Validasi Metode Analisis Lansoprazol Dalam Darah Gandjar

21 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

5.4.3. Penetapan Fase Gerak

Larutan standar Lansoprazol pada konsentrasi 10 gmL diinjeksikan sebanyak 10 µ L pada komposisi fase gerak methanol:dapar fosfat pada perbandingan 70:30, 65:35, dan 60:40 pH 7 serta perbandingan 65:35 dengan penambahan trietilamin TEA sampai pH 7,4 dan kecepatan alir 0,8 – 1,2 mLmenit dan dideteksi pada panjang gelombang terpilih, kemudian dicatat waktu retensi, luas puncak, dihitung jumlah plat teoritis, HETP Height Equivalent Theoritical Plate, faktor kapasitas, dan asimetrisitas.

5.4.4. Uji Kesesuaian Sistem

Larutan Lansoprazole pada konsentrasi 10 gmL diinjeksikan sebanyak 10 L ke alat KCKT dengan fase gerak terpilih, diulangi sebanyak enam kali. Kemudian dihitung jumlah plat teoritis, HETP Height Equivalent Theoritical Plate, faktor kapasitas, asimetrisitas, dan RSD Relative Standard Deviation.

5.4.5. Penetapan Metode Ekstraksi Evans,1994; Kelly,1990

Ke dalam tabung sentrifus dimasukkan 1,05 ml darah + 0,1 mL EDTA 10 disentrifugasi selama 10 menit pada 2500 rpm. Kemudian diambil supernatan plasma dan dicampur metanol dengan perbandingan 1:2, 1:3, dan 1:4 pada tabung sentrifugasi. Kemudian dikocok dengan vorteks selama 1 menit dan disentrifugasi pada 10000 rpm selama 10 menit, lalu supernatan diinjeksikan sebanyak 10 L ke alat KCKT. Kemudian dianalisis kromatogram dari masing-masing perbandingan untuk mengetahui kondisi kromatogram blanko darah. Kemudian dilakukan hal yang sama terhadap darah yang sudah mengandung larutan Lansoprazol masing-masing dengan konsentrasi 5 ppm, 3 ppm, dan 1 ppm, kemudian diekstraksi sesuai dengan perbandingan terpilih, dan diinjeksikan sebanyak 10 L ke alat KCKT kemudian dicatat waktu retensi dan luas puncaknya.

5.4.6. Validasi Metode Analisis Lansoprazol Dalam Darah Gandjar

Rohman, 2007; Harmita, 2006; Food Drug and Administration, 2001; United Nations Office on Drug and Crime, 2009 22 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 5.4.6.1.Pembuatan Kurva Kalibrasi dan Uji Linearitas dalam Darah In Vitro Dibuat larutan blangko dan larutan Lansoprazol dalam darah dengan konsentrasi 2-6 gmL, kemudian dipreparasi sesuai prosedur. Lalu supernatan masing-masing sebanyak 1 0 L disuntikkan ke alat KCKT pada kondisi terpilih. Setelah itu dianalisis regresi perbandingan luas puncak terhadap konsentrasi Lansoprazol dalam darah dari masing-masing konsentrasi dan dibuat kurva kalibrasi dengan persamaan garis regresi linier y = a + bx. Dihitung koefisien korelasi r dari kurva tersebut. 5.4.6.2.Limit Deteksi LOD dan Limit Kuantitasi LOQ Larutan Lansoprazol dalam darah dengan konsentrasi 2-6 gmL dipreparasi sesuai prosedur. Kemudian supernatan sebanyak 1 0 L dari masing-masing larutan tersebut disuntikkan ke alat KCKT pada kondisi terpilih. Setelah itu dianalisis regresi perbandingan luas puncak terhadap konsentrasi Lansoprazole dalam darah dari masing-masing konsentrasi dan dibuat kurva kalibrasinya. LOQ dihitung melalui persamaan garis regresi linier dari kurva kalibrasi, dengan rumus : LOQ = sedangkan nilai batas deteksi LOD diperoleh dengan rumus : LOD = dimana Syx adalah simpangan baku residual, b adalah slope dari persamaan regresi. 5.4.6.3.Uji Selektivitas Sebanyak 10 L supernatan sampel darah yang telah dideproteinase dan mengandung Lansoprazol pada konsentrasi 5 gmL disuntikkan ke dalam instrumen KCKT dengan kondisi fase gerak dan kecepatan alir terpilih, diulang sebanyak 6 kali. Kemudian dihitung nilai RSD Relative Standard Deviation dengan nilai ≤ 15 dan akurasinya diff dengan nilai ± 15. 23 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta 5.4.6.4.Uji Akurasi Dibuat larutan Lansoprazol dalam darah dengan konsentrasi 3 gmL, 4 gmL, dan 5 gmL. Setelah itu dipreparasi sesuai prosedur. Supernatan sebanyak 1 0 L disuntikkan ke alat KCKT dengan kondisi fase gerak dan kecepatan alir terpilih, diulangi sebanyak tiga kali. Kemudian dihitung persentase akurasi diff dan perolehan kembali recovery dari masing- masing konsentrasi larutan tersebut. Nilai rata-rata diff disyaratkan ± 15. Sedangkan nilai perolehan kembali dihitung dengan cara membandingkan konsentrasi Lansoprazol dalam darah yang diperoleh dari hasil ekstraksi dengan konsentrasi Lansoprazol yang sebenarnya dikalikan dengan 100. Perolehan kembali disyaratkan pada ± 15 dalam sampel biologis. 5.4.6.5.Uji Presisi Dibuat larutan Lansoprazol dalam darah dengan konsentrasi 3 gmL, 4 gmL, dan 5 gmL. Setelah itu dipreparasi sesuai prosedur. Supernatan sebanyak 1 0 L disuntikkan ke alat KCKT dengan kondisi fase gerak dan kecepatan alir terpilih, diulangi sebanyak tiga kali. Dilakukan pengukuran intra-hari dan inter-hari selama 2 hari berturut-turut, kemudian dihitung persentase simpangan baku relatif atau RSD Relative Standard Deviation dari masing- masing konsentrasi dengan nilai ≤ 15. 24 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN

9.1. Hasil

9.1.1. Penentuan Metode Analisis Lansoprazol

9.1.1.1.Penentuan Panjang Gelombang Maksimum Penentuan panjang gelombang maksimum dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer ultraviolet-visibel, diperoleh serapan maksimum Lansoprazol pada panjang gelombang 283 nm. Spektrum serapan Lansoprazol dapat dilihat pada lampiran 1 gambar 6.1. 9.1.1.2.Penetapan Komposisi Fase Gerak Penetapan kadar Lansoprazol dalam darah in vitro dilakukan pada kondisi optimum dengan kromatografi cair kinerja tinggi menggunakan kolom Acclaim ® C18 dengan kecepatan alir 0,8 mLmenit, panjang gelombang 283 nm, dan volume penyuntikan 10 L Komposisi fase gerak semula terdiri dari metanol:dapar fosfat pH 7 70:30. Pada komposisi ini, waktu retensi Lansoprazol yaitu 2,95 menit. Kemudian dilakukan modifikasi fase gerak yaitu komposisi kedua metanol-dapar fosfat pH 7 65:35 dan komposisi ketiga metanol-dapar fosfat pH 7 60:40. Pada komposisi metanol-dapar fosfat pH 7 65:35 waktu retensi Lansoprazol yaitu 3,67 menit. Sedangkan pada komposisi metanol-dapar fosfat pH 7 60:40 waktu retensi Lansoprazol yaitu 5,04 menit. Laju alir yang digunakan adalah 0,8 mlmenit. Namun hasil optimasi ini memberikan data kromatogram dengan puncak yang lebar dan pada komposisi 60:40 dihasilkan double peak. Kemudian dilakukan modifikasi lagi dengan penambahan TEA Trietilamin dengan komposisi metanol:dapar fosfat 65:35 dengan penambahan TEA hingga pH 7,4. Dengan komposisi fase gerak ini, didapatkan waktu retensi sekitar 3,77 menit. Metode ini dipilih karena menghasilkan plat teoritis yang lebih banyak daripada komposisi fase gerak yang lain, HETP Height Equivalent Theoritical Plate yang lebih kecil,