2. Pengaruh sambiloto pada sekresi insulin fase cepat BRIN-BD11.
Untuk menilai efek insulinotropik sambiloto pada sekresi insulin fase cepat BRIN-BD11, dilakukan tahapan sama seperti di atas, hanya lama inkubasi dalam
inkubator selama 20 menit saja dengan 1 mL larutan ekstrak sambiloto konsentrasi 0.625, 1.25, 2.5, 5, dan 10 mgmL dalam KRB-3 Modified Kreb
Ringer Buffer berkadar glukosa 16.7 mM dan KRB-1. Selanjutnya media dipanen dan dimasukkan dalam wadah 1.5 mL, dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan
1500 rpm selama 5 menit untuk memisahkan sel BRIN-BD11 yang terlepas dalam media tersebut. Lakukan pemeriksaan kadar insulin dengan Kit Mercodia Rat
Insulin ELISA.
3. Mekanisme kerja sambiloto sebagai insulin sekretagog
Untuk mempelajari mekanisme kerja sambiloto sebagai insulin sekretagog, dilakukan tahapan sama seperti di atas, tetapi lama inkubasi hanya 20 menit.
Perbedaan terletak pada jenis media, yaitu KRB-1 yang ditambahkan dengan 0.5 mM Diazoxide aktifator K
+ ATP
, 0.1 mM Verapamil inhibitor kanal kalsium VDCC tipe-L, dan perlakuan dalam media dengan kandungan KCl 25 mEq.
Selanjutnya media dipanen dan dimasukkan dalam wadah 1.5 mL, dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 1500 rpm selama 5 menit untuk memisahkan sel
BRIN-BD11 yang terlepas dalam media tersebut. Perhitungan kadar insulin menggunakan KIT Mercodia Rat Insulin ELISA.
Pemeriksaan Kadar Insulin
Analisis insulin bisa langsung dikerjakan, atau bila dilakukan lebih dari 24 jam pasca panen, harus disimpan dalam suhu -20
C. Pada penelitian ini analisis insulin dikerjakan langsung segera setelah selesai perlakuan. Pemeriksaan kadar
insulin menggunakan Kit Mercodia Rat Insulin Eliza buatan Mercodia, dengan teknik direct sandwich.
Tahap persiapan.
Siapkan lempeng mikrotiter khusus bagian dari KIT yang telah disediakan yang mempunyai sumur yang telah diberi anti-insulin mouse monoclonal anti-
insulin pada dasar sumur. Untuk pemeriksaan 6 baris 6 X 8 sumur, siapkan larutan konjugat dengan cara menambahkan 250
μL larutan persediaan konjugat anti-insulin yang sudah berikatan dengan enzim peroksidase Peroxidase
conjugated mouse monoclonal anti-insulin yang tidak berwarna, ke dalam 2.5 mL larutan penyangga konjugat conjugate buffer yang diberi warna biru.
Tahap pelaksanaan.
Tahap berikutnya adalah memasukkan 25 μL cairan standar insulin dengan
konsentrasi 0, 0.15, 0.4, 1, 1.5, 3 dan 5.5 μgL ke dalam masing masing sumur
pada baris pertama lempengan yang telah disiapkan di atas, mulai pada sumur ke dua dari atas. Sumur pertama dipakai sebagai koreksi blanko. Tambahkan 25
μL sampel ke dalam sumur pada baris baris berikutnya. Tambahkan 50
μL larutan konjugat Peroxidase conjugated mouse monoclonal anti-insulin yang telah
disiapkan sebelumnya ke dalam sumur sumur yang telah diberi standar insulin maupun sampel, kecuali pada sumur blanko. Inkubasi di atas shaker selama 2 jam
pada suhu ruang. Sambil menunggu inkubasi dapat disiapkan cairan pencuci, yaitu dengan melarutkan 1 bagian detergen konsentrat ke dalam 20 bagian aquabidest.
Setelah 2 jam inkubasi, lakukan pencucian dengan larutan deterjen yang telah disiapkan, menggunakan alat pencuci otomatis merek Bio Rad sebanyak 6 kali.
Setelah diyakini tidak ada cairan tertinggal dalam sumur sumur tersebut, tambahkan 200
μL tetramethylbenzidine TMB sebagai substrat dari enzim peroksidase. Inkubasi selama 15 menit pada suhu ruangan, dan terhindar dari
cahaya. Tambahkan 50 μL stop solution H
2
SO
4
. Taruh pada alat pembaca kepadatan optik Spectrophotometer Microplate Reader BioRad model 3550
dengan panjang gelombang 450 nM. Alat ini secara otomatis akan mengguncang rak selama 5 detik sebelum pembacaan.
Perhitungan kadar insulin.
Intensitas warna yang terbaca oleh alat spectrophotometer menggambarkan konsentrasi insulin, makin tinggi intensitasnya makin tinggi konsentrasi yang
terdeteksi. Perhitungan kadar insulin dalam satuan μgL, diawali dengan
pembuatan fungsi grafik antara kadar insulin standar sebagai sumbu X dan intensitas kepadatan warna sebagai sumbu Y. Dengan menggunakan program
Microsoft Office Excel akan didapat persamaan grafik fungsi hubungan intensitas warna dan kadar insulin standar 0, 0.15, 0.4, 1, 1.5, 3 dan 5.5
μgL, dari berbagai bentuk fungsi yang ada, fungsi yang terbaik dengan nilai r
2
mendekati satu, biasanya berbentuk fungsi kuadrat Y = aX
2
+ bX + q. Dengan melanjutkan perhitungan, persamaan akan menjadi 0 = aX
2
+ bX + c di mana c = q – Y. Selanjutnya X dapat dihitung dengan: X
1.2
= [- b + b
2
- 4ac
12
] : 2a .
Perhitungan Statistik
Perhitungan statistik untuk menilai perbedaan jumlah sekresi insulin pada berbagai perlakuan, digunakan student t test tidak berpasangan.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Untuk dapat menjawab permasalahan tersebut di atas, hasil dan pembahasan penelitian ini juga dilakukan dalam 3 tahap, yaitu:
1. Efek insulinotropik sambiloto pada BRIN-BD11.
2. Pengaruh sambiloto pada sekresi insulin fase cepat BRIN-BD11 dan
3. Mekanisme kerja sambiloto sebagai insulin sekretagog.
Berbeda dengan penelitian in vivo yang bisa menggunakan serbuk kering sambiloto, pengaruh sambiloto pada sekresi insulin BRIN-BD11 secara in vitro
hanya dapat dinilai bila sambiloto dalam bentuk larutan atau ekstrak yang larut dalam media, sehingga perlu dilakukan ekstraksi sambiloto. Adapun cara ekstraksi
yang dipilih adalah ekstraksi sederhana dengan air mendidih, berdasarkan pada beberapa pertimbangan sebagai berikut:
a. Penelitian ini adalah penelitian in vitro dengan menggunakan organ uji
sel lestari, sehingga bentuk bahan yang akan diuji harus dalam bentuk larutan, dan tidak mungkin dalam bentuk serbuk.
b. Dalam kehidupan masyarakat sehari-hari, penggunaan sambiloto untuk
berbagai keperluan adalah dalam bentuk rebusan dan bukan ekstrak air dingin.
c. Pemanasan juga dimaksudkan untuk menghilangkan efek lektin yang
mungkin juga berperan Gray Flatt, 1999. c. Pada beberapa penelitian yang menunjukkan bahwa ekstrak air
merupakan bentuk yang paling bermanfaat dibanding bentuk ekstraksi lainnya Gray Flatt, 1998c, walaupun ada pula penelitian yang
menggunakan ekstrak alkohol Nunemaker et al, 2004, Limsong et al, 2004.
Dengan asumsi kadar andrografolid yang paling rendah, 2.5 berat kering daun sambiloto, maka penggunaan 0.625 mgmL serbuk kering sambiloto dapat
disetarakan dengan 15.625 μgmL andrografolid, atau setara dengan 44.5 μM. Bila
dilakukan pembulatan, maka dapat diasumsikan penggunaan andrografolid pada penelitian ini adalah 45, 90, 180, 360 dan 720
μM
1. Efek insulinotropik sambiloto A.paniculata pada BRIN-BD11.