Bahan dan Alat Penelitian Hasil penimbangan berat badan dan pengukuran gula darah tikus model selama penelitian

BAB III BAHAN DAN METODE PENELITIAN

3.1 Bahan dan Alat Penelitian

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain larutan Buffer Neutral Formalin BNF 10, alkohol 70, alkohol 90, alkohol 95, alkohol absolut, xilol, parafin, aquades, pewarna histologi hematoksilin-eosin, entelan, ketamin, sambiloto, Phosphat Buffer Saline PBS dan streptozotosin STZ. Peralatan yang digunakan antara lain spoit, kandang tikus, sonde lambung, scalpel, gunting, pinset, tissue proccessor, tissue embedding console, mikrotom, gelas objek, cover glass, timbangan digital, digital blood glucose meter dan mikroskop. 3.2 Metode Penelitian 3.2.1 Waktu dan Tempat Penelitian Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juni 2008 sampai bulan September 2008, di Laboratorium Patologi Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Histologi Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor. 3.2.2 Hewan Penelitian Penelitian ini menggunakan 24 ekor tikus putih jantan dengan galur Sprague Dawley Rattus norvegicus yang berumur 8 minggu dengan kisaran berat badan 250 g.

3.2.3 Pengelompokkan Hewan Penelitian

Tikus dikelompokkan menjadi dua kelompok, yaitu: - Kelompok model non-diabetes yang diberi sambiloto - Kelompok model diabetes yang diberi sambiloto Kelompok model diabetes selanjutnya dievaluasi secara individu dengan mengambil 4 ekor tikus model diabetes yang mempunyai kadar gula darah tinggi ± 450 mgdl dan 4 ekor yang mempunyai kadar gula darah rendah ± 150 mgdl 3.2.4 Pemberian Streptozotosin Tikus yang terpilih untuk dijadikan model diabetes diinduksi dengan Streptozotosin STZ dengan dsis tunggal sebesar 40 mgkg BB diberikan secara intraperitoneal. Sedangkan tikus yang terpilih sebagai model non-diabetes dengan cara yang sama diberikan Phosphat Buffer Saline PBS dengan pH 7,4. 3.2.5 Pemberian Sambiloto Bentuk sambiloto yang akan digunakan untuk perlakuan berupa seduhan serbuk kering dengan dosis setara dengan 25 mgkgBB. Supernatan dari air seduhan yang telah diendapkan diambil sesuai dosis dan diberikan per oral. Sambiloto diberikan setiap hari pada semua kelompok pada pagi hari sebelum diberi pakan dengan menggunakan sonde lambung selama 4 minggu. 3.2.6 Berat Badan dan Kadar Gula Darah Penimbangan berat badan dilakukan dengan menggunakan timbangan digital skala 2 angka dibelakang koma. Penimbangan berat badan dilakukan 2 kali dalam seminggu. Pengukuran kadar gula darah dilakukan dengan menggunakan digital blood glucose meter. Pengukuran kadar gula darah dilakukan sekali dalam satu minggu setalah akhir pemberian sambiloto.

3.2.7 Pengambilan Organ Hati, Usus Halus, dan Limpa

Pengambilan organ hati, usus halus, dan limpa dilakukan secara periodik yang dimulai pada akhir minggu ke 5. Selanjutnya pengambilan dilakukan setiap minggu masing-masing kelompok sebanyak 3 ekor. 3.2.8 Pembuatan Preparat Histologis Pembuatan preparat histologis pada organ hati, usus halus, dan limpa dapat dilakukan dengan prosedur sebagai berikut: Fiksasi Sediaan organ hati, usus halus, dan limpa direndam dalam larutan Buffer Neutral Formalin BNF 10, kemudian dipotong dengan ketebalan ± 3 mm dan potongannya dimasukkan ke dalam kaset jaringan. Dehidrasi Organ yang berada dalam kaset jaringan dimasukkan ke dalam gelas-gelas mesin tissue processor untuk dilakukan dehidrasi. Dehidrasi ini dilakukan bertahap dengan menggunakan alkohol yang konsentrasinya berbeda, dimulai dari konsentrasi 70, 80, 90, 95, alkohol absolut I dan alkohol absolut II masing-masing 2 jam. Setelah itu dilakukan proses penjernihan clearing dengan memasukkan sediaan ke dalam xilol I dan II masing-masing 2 jam. Perendaman dan Pencentakkan Embedding Paraffin dimasukkan ke dalam cetakan sampai setengah, kemudian potongan jaringan dimasukkan, selanjutnya cetakan ditambah dengan parafin hingga penuh dan dilabel. Proses pencetakan dilakukan dengan menggunakan tissue embedding console. Sediaan lalu dibekukan dan didinginkan sebelum dilakukan pemotongan dengan menggunakan mikrotom. Pemotongan Sectioning Jaringan dipotong dengan menggunakan rotary mycrotome dengan ketebalan 4-5 μm dan hasil potongan selanjutnya ditempelkan pada gelas objek, kemudian dikeringkan pada suhu ruang lalu disimpan dalam inkubator sampai dilakukan pewarnaan. Pewarnaan Hematoksilin-Eosin Pewarnaan Hematoksilin-Eosin HE meruakan pewarnaan umum untuk melihat morfologi jaringan secara umum. Pada pewarnaan ini inti yang bersifat asam diwarnai dengan Hematoksilin asidofilik sedangkan sitoplasma diwarnai dengan Eosin basofilik. Penggunaan pewarnaan ini dapat memvisualisasikan secara kontras bagian inti dan sitoplasma, sehingga gambaran mikroskopis jaringan dapat diamati dengan jelas. Pewarnaan HE diawali dengan proses deparafinasi dengan menggunakan xilol I, II dan III masing-masing selama 3 menit. Kemudian dilanjutkan dengan proses rehidrasi dengan menggunakan alkohol absolut I, II dan III masing-masing 3 menit, alkohol 95, 90, 80 dan 70 secara berurutan masing-masing selama 3 menit. Sediaan dicuci dengan air kran selama 10 menit dan dilanjutkan dengan air aquades selama 5 menit. Sediaan diwarnai dengan pewarna Hematoksilin selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air kran selama 10 menit dan air aquades selama 5 menit. Setelah itu sediaan diwarnai dengan pewarna Eosin selama 5 menit dan dicuci kembali dengan air kran selama 10 menit dan air aquades selama 5 menit. Setelah sediaan diwarnai, dilakukan dehidrasi dengan alkohol 70, 80, 90 dan 95 masing-masing selama beberapa detik, dan dilanjutkan dengan alkohol 100 I, II dan III masing-masing 2 menit. Setelah itu dilakukan proses Clearing dengan xilol I, II dan III selama 3 menit dan ditutup dengan gelas penutup. 3.2.9 Pengamatan Pengamatan dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya untuk melihat perubahan morfologi secara umum dan perubahan sel-sel yang khas pada organ hati, usus halus, dan limpa pada semua kelompok tikus. 3.2.10 Analisa Data Analisa data hasil penimbangan berat badan, pengukuran kadar gula darah, serta pengamatan mikroskopis pada organ hati, usus halus, dan limpa dilakukan secara deskriptif.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil penimbangan berat badan dan pengukuran gula darah tikus model selama penelitian

Penimbangan berat badan menunjukkan bahwa pada awal penelitian berat badan tikus kelompok model diabetes mempunyai rataan yang lebih tinggi dibandingkan dengan tikus kelompok non-diabetes, namun pada 2 minggu terakhir terjadi penurunan. Pada periode tersebut rataan berat badan tikus non- diabetes tetap meningkat sehingga nilai berat badan kedua kelompok pada akhir penelitian berada pada nilai yang sama Gambar 7. Hal demikian sangat mungkin terkait dengan kondisi klinis diabetes yang diketahui pada periode tertentu dapat menyebabkan penurunan berat badan. Gambar 7. Nilai Rataan Pertumbuhan Berat Badan Tikus Model. DB : Tikus Kelompok Diabetes, Non DB : Tikus Kelompok Non-diabetes Pengukuran kadar gula darah pada tikus model diabetes secara umum menunjukkan rataan nilai kadar gula darah dengan pola menurun pada akhir penelitian. Pada pengukuran terakhir gula darah tikus model diabetes mencapai nilai di bawah 200 mgdl Gambar 8. Data demikian mengindikasikan bahwa sambiloto mempunyai efek hipoglikemik yang cukup kuat. Pengukuran kadar gula darah pada kelompok non-diabetes setelah pemberian sambiloto selama 4 0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 350.0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Penimbangan ke B er at B ada n g DB nonDB minggu menunjukkan nilai rataan tetap pada kisaran 100 mgdl, walaupun terdapat kecenderungan menurun pada periode akhir penelitian. Gambar 8. Nilai Kadar Gula Darah Rata-Rata Tikus Model. DB : Tikus Kelompok Diabetes, Non DB : Tikus Kelompok Non-diabetes Lebih jauh dari hasil gambaran nilai rataan kadar gula darah tikus model diabetes yang menunjukkan penurunan setelah pemberian sambiloto, dievaluasi secara individu untuk melihat pola respon model diabetes dengan kadar gula darah tinggi 270 – 450 mgdl dan kadar gula darah rendah ± 150 mgdl. Evaluasi individu model diabetes dengan kadar gula darah tinggi dan rendah dilakukan dengan mengamati 4 ekor tikus model diabetes yang mempunyai kadar gula darah tinggi 270 – 450 mgdl dan 4 ekor tikus model diabetes dengan kadar gula darah rendah ± 150 mgdl. Hasil pengamatan individu pada 4 ekor tikus model dengan kadar gula darah tinggi menunjukkan respon yang bervariasi dari individu yang Gambar 9A. Nilai gula darah per waktu pengorbanan menunjukkan keragaman, yaitu terdapat nilai yang langsung menurun, meningkat, maupun berfluktuasi pada pemeriksaan pada minggu selanjutnya. Tikus model diabetes yang menunjukkan nilai gula darah diatas 250 mgdl secara umum memperlihatkan penurunan nilai gula darah setelah pemberian sambiloto, namun sampel diabetes pada minggu ke-7 DB 7 justru menunjukkan peningkatan pada minggu ke 3 pasca akhir pemberian sambiloto. 0.0 50.0 100.0 150.0 200.0 250.0 300.0 350.0 400.0 450.0 500.0 1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 Sampling ke K ad ar G ul a D ar ah m g dl DB nonDB Gambar 9A. Nilai Kadar Gula Darah per Waktu Sampling Tikus Model Diabetes dengan Nilai Kadar Gula Darah Awal Tinggi. DB 5 : Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-5, DB 6 : Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-6, DB 7 : Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-7, DB 8 : Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-8 Keragaman respon terhadap pemberian sambiloto juga ditemukan pada tikus model diabetes yang menunjukkan nilai kadar gula darah di bawah 150 mgdl Gambar 9B. Pada tikus sampel diabetes lain didapatkan pada minggu ke- 5 DBr5 menunjukkan nilai kadar gula yang meningkat tajam 350 mgdl pada minggu pertama pasca akhir pemberian sambiloto, sementara tikus lain mendekati nilai kadar gula darah 100 mgdl. Gambar 9B. Nilai Kadar Gula Darah Per Waktu Sampling Tikus Model Diabetes dengan Nilai Kadar Gula Darah Awal Rendah DBr 5 : Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-5, DBr 6 : Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-6, DBr 7 : Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-7, DBr 8 : Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-8 Kondisi demikian mendorong dilakukannya evaluasi histologis terhadap organ hati, usus halus, dan limpa berdasar nilai kadar gula darah saat pengorbanan. 50 100 150 200 250 300 350 400 1 2 3 4 5 6 7 8 Minggu ke K ad ar Gu la D ara h mg d l DBr8 DBr7 DBr6 DBr5 100 200 300 400 500 600 1 2 3 4 5 6 7 8 Minggu ke Kad ar Gu la D ar ah m g dl DB8 DB7 DB6 DB5

4.2 Hasil pengamatan histologis tikus model setelah pemberian seduhan sambiloto.