BAB III BAHAN DAN METODE PENELITIAN
3.1 Bahan dan Alat Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain larutan Buffer Neutral Formalin BNF 10, alkohol 70, alkohol 90, alkohol 95, alkohol
absolut, xilol, parafin, aquades, pewarna histologi hematoksilin-eosin, entelan, ketamin, sambiloto, Phosphat Buffer Saline PBS dan streptozotosin STZ.
Peralatan yang digunakan antara lain spoit, kandang tikus, sonde lambung, scalpel, gunting, pinset, tissue proccessor, tissue embedding console, mikrotom,
gelas objek, cover glass, timbangan digital, digital blood glucose meter dan mikroskop.
3.2 Metode Penelitian 3.2.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan dari bulan Juni 2008 sampai bulan September 2008, di Laboratorium Patologi Departemen Klinik, Reproduksi, dan Patologi
Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor dan Laboratorium Histologi Departemen Anatomi, Fisiologi dan Farmakologi, Fakultas Kedokteran Hewan
Institut Pertanian Bogor. 3.2.2 Hewan Penelitian
Penelitian ini menggunakan 24 ekor tikus putih jantan dengan galur Sprague Dawley Rattus norvegicus yang berumur 8 minggu dengan kisaran
berat badan 250 g.
3.2.3 Pengelompokkan Hewan Penelitian
Tikus dikelompokkan menjadi dua kelompok, yaitu: - Kelompok model non-diabetes yang diberi sambiloto
- Kelompok model diabetes yang diberi sambiloto Kelompok model diabetes selanjutnya dievaluasi secara individu dengan
mengambil 4 ekor tikus model diabetes yang mempunyai kadar gula darah tinggi ± 450 mgdl dan 4 ekor yang mempunyai kadar gula darah rendah
± 150 mgdl
3.2.4 Pemberian Streptozotosin
Tikus yang terpilih untuk dijadikan model diabetes diinduksi dengan Streptozotosin STZ dengan dsis tunggal sebesar 40 mgkg BB diberikan secara
intraperitoneal. Sedangkan tikus yang terpilih sebagai model non-diabetes dengan cara yang sama diberikan Phosphat Buffer Saline PBS dengan pH 7,4.
3.2.5 Pemberian Sambiloto
Bentuk sambiloto yang akan digunakan untuk perlakuan berupa seduhan serbuk kering dengan dosis setara dengan 25 mgkgBB. Supernatan dari air
seduhan yang telah diendapkan diambil sesuai dosis dan diberikan per oral. Sambiloto diberikan setiap hari pada semua kelompok pada pagi hari sebelum
diberi pakan dengan menggunakan sonde lambung selama 4 minggu. 3.2.6 Berat Badan dan Kadar Gula Darah
Penimbangan berat badan dilakukan dengan menggunakan timbangan digital skala 2 angka dibelakang koma. Penimbangan berat badan dilakukan 2
kali dalam seminggu. Pengukuran kadar gula darah dilakukan dengan menggunakan digital blood glucose meter. Pengukuran kadar gula darah
dilakukan sekali dalam satu minggu setalah akhir pemberian sambiloto.
3.2.7 Pengambilan Organ Hati, Usus Halus, dan Limpa
Pengambilan organ hati, usus halus, dan limpa dilakukan secara periodik yang dimulai pada akhir minggu ke 5. Selanjutnya pengambilan dilakukan setiap
minggu masing-masing kelompok sebanyak 3 ekor. 3.2.8 Pembuatan Preparat Histologis
Pembuatan preparat histologis pada organ hati, usus halus, dan limpa dapat dilakukan dengan prosedur sebagai berikut:
Fiksasi Sediaan organ hati, usus halus, dan limpa direndam dalam larutan Buffer
Neutral Formalin BNF 10, kemudian dipotong dengan ketebalan ± 3 mm dan potongannya dimasukkan ke dalam kaset jaringan.
Dehidrasi
Organ yang berada dalam kaset jaringan dimasukkan ke dalam gelas-gelas mesin tissue processor untuk dilakukan dehidrasi. Dehidrasi ini dilakukan
bertahap dengan menggunakan alkohol yang konsentrasinya berbeda, dimulai dari konsentrasi 70, 80, 90, 95, alkohol absolut I dan alkohol absolut II
masing-masing 2 jam. Setelah itu dilakukan proses penjernihan clearing dengan memasukkan sediaan ke dalam xilol I dan II masing-masing 2 jam.
Perendaman dan Pencentakkan Embedding
Paraffin dimasukkan ke dalam cetakan sampai setengah, kemudian potongan jaringan dimasukkan, selanjutnya cetakan ditambah dengan parafin
hingga penuh dan dilabel. Proses pencetakan dilakukan dengan menggunakan tissue embedding console. Sediaan lalu dibekukan dan didinginkan sebelum
dilakukan pemotongan dengan menggunakan mikrotom. Pemotongan Sectioning
Jaringan dipotong dengan menggunakan rotary mycrotome dengan ketebalan 4-5 μm dan hasil potongan selanjutnya ditempelkan pada gelas objek,
kemudian dikeringkan pada suhu ruang lalu disimpan dalam inkubator sampai dilakukan pewarnaan.
Pewarnaan Hematoksilin-Eosin Pewarnaan Hematoksilin-Eosin HE meruakan pewarnaan umum untuk
melihat morfologi jaringan secara umum. Pada pewarnaan ini inti yang bersifat asam diwarnai dengan Hematoksilin asidofilik sedangkan sitoplasma diwarnai
dengan Eosin basofilik. Penggunaan pewarnaan ini dapat memvisualisasikan secara kontras bagian inti dan sitoplasma, sehingga gambaran mikroskopis
jaringan dapat diamati dengan jelas.
Pewarnaan HE diawali dengan proses deparafinasi dengan menggunakan xilol I, II dan III masing-masing selama 3 menit. Kemudian dilanjutkan dengan
proses rehidrasi dengan menggunakan alkohol absolut I, II dan III masing-masing 3 menit, alkohol 95, 90, 80 dan 70 secara berurutan masing-masing
selama 3 menit. Sediaan dicuci dengan air kran selama 10 menit dan dilanjutkan dengan air aquades selama 5 menit.
Sediaan diwarnai dengan pewarna Hematoksilin selama 1 menit, kemudian dicuci dengan air kran selama 10 menit dan air aquades selama 5 menit.
Setelah itu sediaan diwarnai dengan pewarna Eosin selama 5 menit dan dicuci kembali dengan air kran selama 10 menit dan air aquades selama 5 menit.
Setelah sediaan diwarnai, dilakukan dehidrasi dengan alkohol 70, 80, 90 dan 95 masing-masing selama beberapa detik, dan dilanjutkan dengan
alkohol 100 I, II dan III masing-masing 2 menit. Setelah itu dilakukan proses Clearing dengan xilol I, II dan III selama 3 menit dan ditutup dengan gelas
penutup. 3.2.9 Pengamatan
Pengamatan dilakukan dengan menggunakan mikroskop cahaya untuk melihat perubahan morfologi secara umum dan perubahan sel-sel yang khas pada
organ hati, usus halus, dan limpa pada semua kelompok tikus. 3.2.10 Analisa Data
Analisa data hasil penimbangan berat badan, pengukuran kadar gula darah, serta pengamatan mikroskopis pada organ hati, usus halus, dan limpa dilakukan
secara deskriptif.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil penimbangan berat badan dan pengukuran gula darah tikus model selama penelitian
Penimbangan berat badan menunjukkan bahwa pada awal penelitian berat badan tikus kelompok model diabetes mempunyai rataan yang lebih tinggi
dibandingkan dengan tikus kelompok non-diabetes, namun pada 2 minggu terakhir terjadi penurunan. Pada periode tersebut rataan berat badan tikus non-
diabetes tetap meningkat sehingga nilai berat badan kedua kelompok pada akhir penelitian berada pada nilai yang sama Gambar 7. Hal demikian sangat
mungkin terkait dengan kondisi klinis diabetes yang diketahui pada periode tertentu dapat menyebabkan penurunan berat badan.
Gambar
7. Nilai Rataan Pertumbuhan Berat Badan Tikus Model.
DB : Tikus Kelompok Diabetes, Non DB : Tikus Kelompok Non-diabetes
Pengukuran kadar gula darah pada tikus model diabetes secara umum menunjukkan rataan nilai kadar gula darah dengan pola menurun pada akhir
penelitian. Pada pengukuran terakhir gula darah tikus model diabetes mencapai nilai di bawah 200 mgdl Gambar 8. Data demikian mengindikasikan bahwa
sambiloto mempunyai efek hipoglikemik yang cukup kuat. Pengukuran kadar gula darah pada kelompok non-diabetes setelah pemberian sambiloto selama 4
0.0 50.0
100.0 150.0
200.0 250.0
300.0 350.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Penimbangan ke B
er at
B ada
n g
DB nonDB
minggu menunjukkan nilai rataan tetap pada kisaran 100 mgdl, walaupun terdapat kecenderungan menurun pada periode akhir penelitian.
Gambar 8. Nilai Kadar Gula Darah Rata-Rata Tikus Model.
DB : Tikus Kelompok Diabetes, Non DB : Tikus Kelompok Non-diabetes
Lebih jauh dari hasil gambaran nilai rataan kadar gula darah tikus model diabetes yang menunjukkan penurunan setelah pemberian sambiloto, dievaluasi
secara individu untuk melihat pola respon model diabetes dengan kadar gula darah tinggi 270 – 450 mgdl dan kadar gula darah rendah ± 150 mgdl.
Evaluasi individu model diabetes dengan kadar gula darah tinggi dan rendah dilakukan dengan mengamati 4 ekor tikus model diabetes yang mempunyai kadar
gula darah tinggi 270 – 450 mgdl dan 4 ekor tikus model diabetes dengan kadar gula darah rendah ± 150 mgdl. Hasil pengamatan individu pada 4 ekor tikus
model dengan kadar gula darah tinggi menunjukkan respon yang bervariasi dari individu yang Gambar 9A. Nilai gula darah per waktu pengorbanan
menunjukkan keragaman, yaitu terdapat nilai yang langsung menurun, meningkat, maupun berfluktuasi pada pemeriksaan pada minggu selanjutnya. Tikus model
diabetes yang menunjukkan nilai gula darah diatas 250 mgdl secara umum memperlihatkan penurunan nilai gula darah setelah pemberian sambiloto, namun
sampel diabetes pada minggu ke-7 DB 7 justru menunjukkan peningkatan pada minggu ke 3 pasca akhir pemberian sambiloto.
0.0 50.0
100.0 150.0
200.0 250.0
300.0 350.0
400.0 450.0
500.0
1 3
5 7
9 11 13 15 17 19
Sampling ke K
ad ar
G ul
a D
ar ah
m g
dl
DB nonDB
Gambar 9A. Nilai Kadar Gula Darah per Waktu Sampling Tikus Model Diabetes dengan Nilai Kadar Gula Darah Awal Tinggi.
DB 5 : Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-5, DB 6 : Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-6, DB 7 : Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-7, DB 8 :
Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-8
Keragaman respon terhadap pemberian sambiloto juga ditemukan pada tikus model diabetes yang menunjukkan nilai kadar gula darah di bawah 150
mgdl Gambar 9B. Pada tikus sampel diabetes lain didapatkan pada minggu ke- 5 DBr5 menunjukkan nilai kadar gula yang meningkat tajam 350 mgdl pada
minggu pertama pasca akhir pemberian sambiloto, sementara tikus lain mendekati nilai kadar gula darah 100 mgdl.
Gambar 9B. Nilai Kadar Gula Darah Per Waktu Sampling Tikus Model Diabetes dengan Nilai Kadar Gula Darah Awal Rendah
DBr 5 : Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-5, DBr 6 : Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-6, DBr 7 : Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-7, DBr 8 :
Sampel Tikus Diabetes pada Minggu ke-8
Kondisi demikian mendorong dilakukannya evaluasi histologis terhadap organ hati, usus halus, dan limpa berdasar nilai kadar gula darah saat
pengorbanan.
50 100
150 200
250 300
350 400
1 2
3 4
5 6
7 8
Minggu ke K
ad ar
Gu la
D ara
h mg
d l
DBr8 DBr7
DBr6 DBr5
100 200
300 400
500 600
1 2
3 4
5 6
7 8
Minggu ke Kad
ar Gu
la D ar
ah m
g dl
DB8 DB7
DB6 DB5
4.2 Hasil pengamatan histologis tikus model setelah pemberian seduhan sambiloto.