reading frame. Perubahan reading frame akan menyebabkan terbentuknya sekuen asam amino yang berbeda dari sekuen asam amino yang seharusnya dihasilkan,
sehingga terbentuk protein baru yang lebih panjang atau lebih pendek dari protein yang seharusnya dihasilkan Chatterjea dan Shinde, 2012; Richards dan Hawley,
2011. Contoh perubahan reading frame pada frameshift mutation ditunjukkan pada Gambar 2.3.
2.5 Enzim Restriksi
Enzim restriksi merupakan enzim yang berperan dalam pemotongan untai double helix DNA secara spesifik pada urutan basa nukleotida tertentu. Enzim
restriksi yang tersedia saat ini umumnya diperoleh dari bakteri dan archae Khan, 2012. Enzim restriksi akan berikatan pada urutan nukleotida spesifik atau yang
dikenal dengan situs pemotongan spesifik situs restriksi pada DNA target yang selanjutnya akan memotong DNA pada daerah tersebut. Enzim restriksi
berinteraksi dengan DNA melalui ikatan hidrogen multiple umumnya 10-15 dan beberapa ikatan van der Waals. Situs pengenalan spesifik enzim restriksi
umumnya terdiri dari empat hingga enam urutan basa nukleotida dan urutan tersebut dapat membentuk pola palindrom. Pola palindrom merupakan urutan basa
nukleotida yang sama dari arah yang berlawanan Clark dan Pazdernik, 2015; Walker dan Rapley, 2005.
Sebagian besar enzim restriksi bekerja optimum pada pH 7,4. Beberapa enzim memerlukan buffer dengan pH tertentu bergantung pada pH optimal enzim
dan persyaratan kekuatan ionik yang dibutuhkan untuk restriksi. Komponen utama
buffer untuk reaksi enz Mg
2+
. Magnesium da ion magnesium diper
restriksi DNA substra yang akan menstabil
digesti Brown, 2016 menentukan kondisi
dalam pembelian enz untuk aktivitas enzim
disediakan. Larutan buf kemudian dapat dienc
digesti enzim restriksi
Gambar 2.4 Mekani
Jelstch, 2001 enzim restriksi adalah natrium klorida NaCl
dalam buffer reaksi enzim restriksi mutlak di perlukan sebagai kofaktor enzim untuk dapat
substrat. Pada beberapa enzim juga diperlukan dithi bilkan enzim dan mencegah inaktivasi enzim
2016. Setiap produsen enzim restriksi um si optimal digesti masing-masing enzim rest
nzim restriksi akan disertai dengan larutan buf im tersebut dan informasi aktivitas enzim pa
buffer tersebut biasanya tersedia dalam konse diencerkan menjadi larutan buffer 1X untuk
ksi Karcher, 1995.
kanisme pemotongan DNA oleh enzim restriksi ch, 2001
l dan magnesium k diperlukan karena
pat berfungsi saat dithitheritol DTT
im selama proses umumnya telah
restriksi sehingga buffer yang sesuai
pada buffer yang konsentrasi 10X yang
uk digunakan pada
iksi Pingoud dan
Mekanisme pemotongan oleh enzim restriksi dapat dilihat pada Gambar 2.4. Secara umum, proses pemotongan DNA oleh enzim restriksi diawali dengan
interaksi nonspesifik antara enzim restriksi dengan DNA khususnya pada gugus fosfat. Selanjutnya, enzim restriksi bergerak sepanjang untai DNA melalui difusi
linier hingga situs pengenalan spesifik ditemukan. Pada saat enzim restriksi menemukan situs pengenalan spesifik, molekul air akan dilepas dan terbentuk
ikatan hidrogen antara enzim restriksi dengan basa nukleotida pada situs pengenalan. Setelah kompleks spesifik DNA-enzim restriksi terbentuk, masing-
masing DNA dan enzim restriksi akan mengalami perubahan konformasi untuk aktivasi reaksi katalisis. Kemudian, enzim restriksi dengan bantuan Mg
2+
akan memotong ikatan fosfodiester reaksi katalisis pada tiap untai DNA. Pemotongan
ikatan fosfodiester tersebut akan menyebabkan terpotongnya untai DNA sesuai dengan posisi pemotongan Williams, 2003; Pingoud dan Jeltsch, 2001.
Tabel 2.3 Perbedaan tipe enzim restriksi Stenesh, 1998
Enzim restriksi Tipe I
Tipe II Tipe III
Situs pemotongan 1-10 kpb dari situs
pengenalan Dalam situs
pengenalan 24-26 pb dari situs
pengenalan Subunit
Multisubunit Subunit tunggal
Multisubunit Kebutuhan ATP
Ya Tidak
Tidak
Berdasarkan daerah pemotongan, jumlah subunit, dan kebutuhan ATP pada proses restriksi maka enzim restriksi dibagi menjadi tiga tipe yang ditnjukkan
pada Tabel 2.3. Dari ketiga tipe tersebut, enzim restriksi tipe II merupakan enzim
restriksi yang paling sering dimanfaatkan dalam bidang biologi molekuler. Hal tersebut dikarenakan situs pemotongan enzim restriksi tipe II berada dalam situs
pengenalannya, sehingga pemotongan DNA menjadi sangat spesifik pada sekuen tertentu Stenesh, 1998. Selain itu, enzim restriksi tipe II umumnya memiliki
situs pengenalan yang palindrom Clark dan Pazdernik, 2015.
Gambar 2.5 Pemotongan enzim restriksi tipe II pada untai DNA Clark dan
Pazdernik, 2015
Enzim restriksi tipe II dapat memotong untai DNA dengan dengan menghasilkan dua tipe fragmen, yaitu blunt end dan sticky end. Pada mekanisme
pemotongan blunt end, enzim tersebut memotong DNA tepat pada posisi yang sama sehingga menghasilkan dua fragmen DNA dengan ujung untai ganda.
Sedangkan pada mekanisme pemotongan sticky end, enzim tersebut memotong pada urutan yang sama dari situs pengenalan namun pada posisi yang tidak sama
tepat sehingga akan menghasilkan dua fragmen DNA dengan ujung untai tunggal pendek Clark dan Pazdernik, 2015. Mekanisme pemotongan tersebut dapat
dilihat pada Gambar 2.5.
2.6 Pemilihan Enzim Restriksi
