Persiapan Isolat dan Media Pembiakan dan Analisis

BAB IV METODOLOGI PENELITIAN

A. Metode Penelitian

Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah memaparkan metode produksi aflatoksin yang dilakukan oleh beberapa peneliti yang terkait dengan produksi aflatoksin baik dari dalam maupun luar negeri dan yang dilakukan di Balai Besar Penelitian Veteriner Bbalitvet Bogor. Kemudian dilakukan pembandingan hasil dari produksi aflatoksin di Bbalitvet dengan data sekunder yang diperoleh dari hasil penerapan metode yang dilakukan peneliti-peneliti sebelumnya secara kualitatif. Penarikan kesimpulan diambil dengan menggunakan hasil perbandingan tersebut.

1. Metode Kerja Produksi Aflatoksin Davis et al. 1966

a. Persiapan Isolat dan Media

Isolat yang digunakan terdiri dari 7 isolat antara lain A. flavus 2 culture variant of British Isolat 373410, A. flavus 6 dan 8 dari Alabama grown peanuts, ATCC American Type Culture Collection, dan US Department of Agriculture NURDD. Kultur isolat tersebut ditumbuhkan pada medium Czapek solution agar dengan kandungan 20 sukrosa dan dimodifikasi dengan penambahan 7 gL Difco yeast-extract. Medium pertumbuhan yang digunakan dalam penelitian adalah medium basal YES yeast extract sucrose dengan kandungan 2 yeast-extract Difco dan 20 sukrosa. Air demineralisasi digunakan dalam penelitian ini.

b. Pembiakan dan Analisis

Sebelum dikultivasi, medium YES disiapkan terlebih dahulu dengan cara mensterilkan 100 mL media dalam Erlenmeyer 1 L yang ditutup sumbat kapas menggunakan autoklaf selama 15 menit dengan tekanan 20 psi. Lalu media diinokulasikan dengan spora yang berumur 1 sampai 3 minggu dan diinkubasikan selama 6 sampai 8 hari pada suhu 25°C. Inkubasi dilakukan dengan cara stasioner diam. Penelitian menggunakan 3 ulangan dan hasilnya berupa rataan. Ekstraksi kemudian dilakukan dengan cara menyaring kultur dan memisahkan antara filtrat cair dan miselium. Berat kering miselium diukur setelah pengeringan selama 12 sampai 24 jam pada 70°C. Ekstraksi aflatoksin menggunakan cara reflux selama 1 sampai 2 jam dengan pelarut berupa kloroform. Untuk mendapatkan hasil aflatoksin yang tinggi 1-2 mL media dikocok cepat oleh 25 mL menggunakan corong pisah. Lapisan bawah yang merupakan lapisan kloroform dikumpulkan dan diuapkan di atas steam bath baru kemudian diencerkan kembali dengan kloroform pada konsentrasi yang sesuai untuk analisis. Analisis aflatoksin menggunakan metode TLC thin layer chromatography. Lempeng yang digunakan sebagai fase diam adalah lempeng silica gel setebal 0.4 mm yang dielusikan menggunakan campuran 2.5 metanol dalam kloroform. Hasil elusi kemudian dikeringkan dan diperiksa menggunakan sinar ultraviolet. Pengukuran aflatoksin secara kuantitatif dilakukan dengan cara perbandingan visual dengan standar aflatoksin eksternal dan internal.

2. Metode Kerja Produksi Aflatoksin Winn dan Lane 1978