Homologi DNA Gen 16S rRNA Bakteri Simbion

20 mengenali isyarat yang dikeluarkan dari individu yang lain dan secara langsung menyerang dan berusaha menggigit individu rayap tersebut. Rayap yang terlihat adanya perilaku agresif mengindikasikan bahwa rayap masih mampu mengenali isyarat yang dikeluarkan oleh individu yang lain. Isyarat yang dikeluarkan dari individu rayap pekerja kemudian dikenali oleh individu rayap pekerja yang lain merupakan sifat dari perilaku pengenalan rayap di dalam koloninya nestmate. Isyarat yang dikeluarkan berasal dari induk betina, sehingga rayap yang berperilaku saling mengenali satu sama lain merupakan rayap yang masih berasal dari tetua yang sama. Rayap pekerja mayor dan prajurit minor dari M. subhyalinus dan M. bellicosus diuji dan diperoleh hasil bahwa rayap pekerja mayor M. subhyalinus mempunyai kemampuan membedakan ekspresi dari variasi tingkat agresi terhadap pekerja mayor dari rayap M. bellicosus. Rayap prajurit minor M. subhyalinus maupun M. bellicosus juga bereaksi terhadap koloni asing dengan tingkat agresi yang berbeda Jmhasly dan Leuthold 1999. Rayap yang saling yang saling mendekat kemudian melakukan respon untuk menyerang atau menggigit mengindikasikan bahwa proses pengenalan isyarat dari individu satu dengan individu yang lain berhasil. Isyarat yang dikeluarkan dari individu satu kemudian diterima oleh individu rayap yang lain. Akan tetapi isyarat yang dikeluarkan tidak dikenali, sehingga menyebabkan rayap saling menyerang. Rayap menganggap bahwa proses pengenalan dari koloninya tidak berhasil karena isyarat yang dikeluarkan berbeda dengan yang dikeluarkannya. Rayap yang menganggap isyarat yang dikeluarkan tidak sama dengan koloninya, menganggap bahwa rayap lain tersebut sebagai musuh Shelton dan Grace 1996. Koloni yang dulunya berasal dari tetua yang sama, tetapi karena sudah terlalu lama terpisah dapat menyebabkan pengenalan recognize dari koloni sebelumnya menjadi semakin luntur. Pengenalan dari koloni yang semakin melemah terhadap pengenalan dari koloni sebelumnya menyebabkan kedua koloni yang terpisah tidak saling mengenal. Koloni yang tidak saling mengenal terhadap isyarat dari koloni yang lain menyebabkan perilaku agresif pada rayap Andrews 1911. Analisis Kekerabatan Rayap Tanah M. gilvus dengan Teknik Molekuler Hasil amplifikasi gen COI pada rayap. Primer forward dan reverse mampu mengamplifikasi gen COI dengan baik, terlihat pita DNA 1 sampai 4 merupakan hasil amplifikasi gen COI dari rayap. Pita DNA 1 dan 2 berasal dari DNA total rayap pekerja dari CA Yanlappa-Jasinga, sedangkan pita DNA 3 dan 4 berasal dari DNA total rayap pekerja Kampus IPB. Pita yang terlihat sesuai dengan target yang diinginkan yaitu berukuran sekitar 750pb Gambar 8. Analisis homologi sekuen DNA gen COI pada rayap. Keempat sekuen DNA rayap M. gilvus dari Bogor CA Yanlappa-Jasinga dan Kampus IPB Dramaga mempunyai homologi dengan rayap M. gilvus dari Laos dengan nilai query cover , e-value, dan max-identity berturut-turut adalah 100, 0.0, dan 98 Tabel 6. Rayap yang telah diidentifikasi secara morfologi dan berdasarkan hasil BLAST-N merujuk pada spesies yang sama yaitu M. gilvus. Gambar 8 Visualisasi hasil amplifikasi gen COI rayap dari CA Yanlappa dan Kampus IPB Dramaga menggunakan primer spesifik Keterangan: sumuran M, 1, 2, 3, dan 4 adalah Marker 1 kb, sampel Mg 4.2 JSG, Mg 6.2 JSG, Mg 4.1 DMG, dan Mg 6.1 DMG, Tabel 6 Hasil BLAST-N sekuen gen COI dari rayap pekerja CA Yanlappa- Jasinga dan Kampus IPB Dramaga No. Aksesi Haplo- tipe Spesies Skor Maksimum Skor total Query cover e- value Max- Ident AB909015 H3

M. gilvus 1269

1269 100 0.0 98 AB909017 H5 M. gilvus 1264 1264 100 0.0 98 AB909014 H2 M. gilvus 1264 1264 100 0.0 98 AB909013 H1 M. gilvus 1264 1264 100 0.0 98 AB909016 H4 M. gilvus 1258 1258 100 0.0 98 Keterangan: H: Haplotipe Keempat sekuen rayap dari Bogor yang merujuk pada spesies rayap M. gilvus mempunyai panjang DNA 732pb, dengan kandungan AT 57.92, persentase kesamaan dan gap dengan M. gilvus asal Laos No. aksesi AB909015 sebesar 97.67 dan 2.32 Tabel 7. Persentase kesamaan nukleotida sampel rayap dari Bogor sangat tinggi karena sampel rayap berada pada tingkatan intraspesies yang sangat sulit dibedakan Simon et al. 2006. Alignment sekuen DNA rayap dari Bogor tidak memperlihatkan adanya variasi nukleotida. Basa nukleotida 1 hingga 732 dari keempat sekuen dari Bogor mempunyai nukleotida yang sama. Hal itu menunjukkan rayap dari CA Yanlappa- Jasinga dan Kampus IPB Dramaga mempunyai hubungan kekerabatan yang sangat dekat berdasarkan gen COI dari DNAmt. Meskipun DNAmt mempunyai laju rekombinasi dan evolusi yang tinggi, tetapi organisme yang masih berkerabat sangat dekat akan sulit menemukan variasi nukleotidanya Simon et al. 2006. M 1 2 3 4 250 pb 762 pb 500 pb 750 pb 1000 pb 21 22 Tabel 7 BLAST-N gen COI M. gilvus haplotipe baru menggunakan program BLAST-N www.ncbi.nlm.nih.gov Karakter Gen COI M. gilvus Mg 4 DMG Mg 6 DMG Mg 4 JSG Mg 5 JSG Panjang DNA pb 732 732 732 732 Kandungan AT 57.92 57.92 57.92 57.92 Spesies lain M. gilvus Mg.15.H3 M. gilvus Mg.15.H3 M. gilvus Mg.15.H3 M. gilvus Mg.15.H3 No. Aksesi AB909015 AB909015 AB909015 AB909015 E-value 0.0 0.0 0.0 0.0 Persentase kesamaan 97.67 97.67 97.67 97.67 Gap 2.32 17732 2.32 17732 2.32 17732 2.32 17732 Tabel 8 Posisi nukleotida gen COI M. gilvus dengan database sekuen nukleotida berdasarkan GenBank yang menunjukkan variasi haplotipe Sampel Nukleotida ke- 1290384399 414639 33264 39174341 534611 200 258 408 706 Mg 4 DMG C G T G T A T Mg 6 DMG . . . . . . . Mg 4 JSG . . . . . . . Mg 5 JSG . . . . . . . Mg 13 LAO T A C C C G . Mg 14 LAO T A C C C G . Mg 15 LAO T A C C . G . Mg 16 LAO T A C C C G G Mg 17 LAO T A C C . G G Keterangan: Mg: M. gilvus, JSG: CA Yanlappa-Jasinga, DMG: Kampus IPB-Dramaga, LAO: Laos asal spesimen rayap Sekuen DNA rayap dari Bogor di-alignment dengan sekuen DNA rayap M. gilvus gen COI dari Laos dengan nomor aksesi secara berurutan AB909013, AB909014, AB909015, AB909016, AB909017 secara berurutan Mg.13.H1, Mg.14.H2, Mg.15.H3, Mg.16.H4, dan Mg.17.H5. Sekuen-sekuen DNA rayap M. gilvus dari Bogor tidak ada perbedaannya setelah di-alignment. Akan tetapi, sekuen-sekuen DNA rayap dari Bogor yang dibandingkan dengan sekuen DNA rayap dari Laos terdapat beberapa perbedaan sekuen nukleotida. Sebanyak 17 basa nukleotida pada sekuen DNA rayap dari Bogor yang dibandingkan dengan sekuen DNA rayap haplotipe dari Laos Tabel 8 dan Lampiran 6. Urutan basa ke-12, 90, 384, 399, 414, dan 639 pada sekuen rayap M. gilvus dari Bogor menunjukkan basa “Cytosin C”, sedangkan pada haplotipe M. gilvus dari Laos menunjukkan basa “Timin T”. Urutan basa ke-33 dan 264 dari rayap sekuens rayap Bogor menunjukkan basa “Guanin G”, sedangkan pada haplotipe dari Laos menunjukkan basa Adenin “A”. Sekuen DNA rayap dari Bogor pada basa ke-200 yang mempunyai basa “G” yang sama dengan ke-33 dan 264 menunjukkan basa yang berbeda pada haplotipe dari Laos yaitu basa “C”. Sekuens rayap dari Bogor pada basa ke 408 menunjukkan basa “A”, sedangkan pada sekuen haplotipe dari Laos menunjukkan basa “G” Tabel 8. Gen COI pada penelitian ini merupakan gen yang digunakan untuk analisis dengan DNA Barkode. DNA barkode merupakan suatu cara untuk mengidentifikasi spesies secara cepat dan akurat menggunakan DNA pendek dari mitokondria yang distandardisasi Hebert et al. 2003. Gen COI dipilih karena gen COI yang digunakan relatif pendek, bersifat conserve, relatif stabil tidak mudah mengalami perubahan-perubahan dengan gen-gen mitokondria yang lainnya, dan gen ini terdapat dalam jumlah kopi yang banyak Hebert et al. 2003. Beberapa penelitian lain menunjukan bahwa gen COI dapat mengidentifikasi spesies kriptik. Rayap yang telah diidentifikasi berdasarkan morfologi sebanyak 31 spesies, akan tetapi setelah dilihat kembali menggunakan penanda genetik gen COI ada tiga spesies kriptik dari 31 spesies tersebut Bourguignon et al. 2013. Nukleotida yang berbeda pada sekuen dari Bogor dan haplotipe dari Laos telah berevolusi dan beradaptasi terhadap seleksi alam dari tempat asalnya Asia Tenggara ke Indonesia. Rayap M. gilvus mempunyai persebaran yang sangat luas dan hampir ditemukan di semua Asia Tenggara. Strategi dalam cara bertahan hidup menjadi salah satu faktor yang sangat penting bagi persebaran M. gilvus di berbagai Asia Tenggara. Hibernasi dan migrasi adalah dua strategi adaptasi utama untuk kelangsungan hidup serangga di musim dingin Tauber et al. 1986. Strategi ini akan berpengaruh terhadap peningkatan proses distribusi M. gilvus. Rayap Coptotermes formosanus Shiraki famili Rhinotermtidae dianalisis menggunakan gen COII dari DNAmt. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa rayap C. formosanus yang menginfestasi dan merusak di Hawai berasal dari tetua yang sama yaitu berasal dari Asia dan Amerika utara. Hal ini menunjukkan bahwa rayap C. formosanus yang menginfestasi daerah Hawai merupakan satu tetua yang sama kemudian tersebar dan bertahan hidup. Hubungan evolusi dapat dilihat dari pohon filogenetik yang menunjukkan bahwa rayap C. formosanus yang berasal dari Jepang, China, dan Amerika membentuk cabang parafiletik Gentz et al. 2008. Analisis filogeni dan jarak genetik rayap. Analisis filogeni 732 basa dari gen COI rayap diperoleh bahwa sebanyak 715 basa konstan dari 732, basa variable sebanyak 17 2.32, dan parsimony-informatif sebanyak 17 2.32. Jumlah basa konstan yang diperoleh tergolong sangat tinggi dan basa variable dan basa parsimony-informatif mempunyai nilai yang sangat rendah persentasenya karena rayap berada dalam tingkat intraspesies. Konstruksi pohon filogeni dengan metode Neighbor-Joining NJ dan Maximum-Parsimony MP menunjukkan sedikit perbedaan pada percabangan antara rayap-rayap di Bogor. Rayap dari Bogor pada pohon filogeni NJ tidak membentuk percabangan Gambar 9, sedangkan pada pohon filogeni MP membentuk percabang Gambar 10, walaupun dengan nilai kepercayaan bootstrap yang rendah yaitu 30 dan 20. Rayap M. annandalei membentuk cabang yang berbeda karena termasuk out-group. 23 24 Gambar 9 Pohon filogeni antara M. gilvus dan M. annandalei berdasarkan gen COI menggunakan metode Neighbor-Joining dengan bootstrap 1000x Gambar 10 Pohon filogeni antara M. gilvus dan M. annandalei berdasarkan gen COI menggunakan metode Maximum-Parsimony dengan bootstrap 1000x Rayap dari Bogor mempunyai nilai kedekatan dengan nilai bootstrap 100 dan didukung dengan nilai jarak genetik sebesar 100 Tabel 9. Hal ini menunjukkan bahwa rayap dari Bogor yang terdiri dari rayap koloni CA Yanlappa-Jasinga dan Kampus IPB Dramaga mempunyai kekerabatan yang sangat dekat berdasarkan gen COI. Rayap dari Bogor dan Laos meskipun berasal dari spesies yang sama M. gilvus tetapi jarak genetiknya tidak 100, karena terdapat beberapa nukleotida Mg_13_LAO Mg_16_LAO Mg_14_LAO Mg_15_LAO Mg_17_LAO Mg_6_DMG Mg_5_JSG Mg_4_DMG Mg_4_JSG Man_09_LAO Man_10_LAO 100 20 30 18 46 36 98 100 M. gilvus in-group out-group Mg_13_LAO Mg_14_LAO Mg_16_LAO Mg_17_LAO Mg_15_LAO Mg_4_DMG Mg_6_DMG Mg_4_JSG Mg_5_JSG Man_09_LAO Man_10_LAO 100 100 58 47 21 96 0.01 Mg_13_LAO Mg_14_LAO Mg_16_LAO Mg_17_LAO Mg_15_LAO Mg_4_DMG Mg_6_DMG Mg_4_JSG Mg_5_JSG Man_09_LAO Man_10_LAO 100 100 58 47 21 96 0.01 Out-group M. gilvus in-group yang berbeda tabel 8. Rayap M. gilvus dari Bogor yang dibandingkan dengan out- group M. annandalei mempunyai jarak genetik sebesar 91-92 karena rayap dibandingkan pada tingkat intraspesies. Tabel 9 Jarak genetik M. gilvus gen COI dengan sampel dari GenBank 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 [1] [2] 100 [3] 100 100 [4] 100 100 100 [5] 97.8 97.8 97.8 97.8 [6] 97.8 97.8 97.8 97.8 100 [7] 97.9 97.9 97.9 97.9 99.8 99.8 [8] 97.6 97.6 97.6 97.6 99.8 99.8 99.7 [9] 97.8 97.8 97.8 97.8 99.7 99.7 99.8 99.8 [10] 91.5 91.5 91.5 91.5 92.3 92.3 92.3 92.3 92.3 [11] 92.4 92.4 92.4 92.4 93 93 93 93 93 97.2 Keterangan: 1: Mg_4_DMG, 2: Mg_6_DMG, 3: Mg_4_JSG, 4: Mg_5_JSG, 5: Mg_13_LAO, 6: Mg_14_LAO, 7: Mg_15_LAO, 8: Mg_16_LAO, 9: Mg_17_LAO, 10: Man_09_LAO, 11: Man_10_LAO Analisis Kekerabatan Rayap Tanah M. gilvus Keempat sekuen rayap dari Bogor CA Yanlappa-Jasinga dan Kampus IPB Dramaga yang telah dianalisis homologinya memberikan hasil yang sama dengan identifikasi rayap secara morfologi yaitu merujuk pada spesies rayap M. gilvus. Analisis homologi dari sekuen basa nukleotida dari keempat rayap dari Bogor mempunyai basa nukleotida yang sama. DNA mitokondria merupakan DNA yang diturunkan secara murni dari induk betina maternal dan mempunyai tingkat evolusi yang tinggi Simon et al. 2006. Analisis kekerabatan menggunakan pendekatan perilaku menunjukkan bahwa rayap dari CA Yanlappa-Jasinga dan Kampus IPB Dramaga diduga berasal dari tetua yang berbeda. Rayap pekerja yang terlihat saling agresif ini mengindikasikan bahwa rayap berasal dari induk yang berbeda, karena isyarat yang dikeluarkan rayap pekerja dari masing-masing lokasi dikenali bukan sebagai anggota koloninya nestmate tetapi dikenali sebagi musuh Shelton Grace 1996. Hasil yang diperoleh antara pendekatan perilaku dan molekuler menunjukkan hasil yang bertolak belakang. Analisis menggunakan pendekatan perilaku menunjukkan hasil bahwa rayap M. gilvus berasal dari tetua yang berbeda. Berdasarkan pendekatan molekuler menunjukkan hasil bahwa rayap mempunyai kedekatan yang tinggi berdasarkan gen COI. 25 26 Inventarisasi Bakteri Simbion Rayap Tanah M. gilvus Isolasi, Identifikasi Morfologi dan Fisologi Bakteri Simbion Bakteri yang telah diisolasi dari saluran pencernaan rayap CA Yanlappa- Jasinga dan Kampus IPB Dramaga diperoleh hasil isolasi dengan jumlah yang berbeda. Bakteri simbion yang berhasil diisolasi dari rayap CA Yanlappa berjumlah 17, sedangkan dari Kampus IPB Dramaga berjumlah 20 isolat yang berasal dari saluran pencernaan tengah dan belakang Lampiran 7. Isolat bakteri simbion yang diperoleh dari rayap kasta pekerja CA Yanlappa- Jasinga berjumlah 3 yaitu J4M1, J5P1, dan J5P2, sedangkan dari Kampus IPB Dramaga berjumlah 5 yaitu D4M1, D6P1, D6P2, D6P3, dan D6P5. Semua koloni bakteri simbion mempunyai karakter berbentuk bulat dan pinggiran yang halus, akan tetapi warna tiap isolat berbeda-beda Tabel 10. Semua isolat bakteri yang diperoleh bersifat aerobik dan umumnya bersifat Gram negatif, hanya dua isolat yang bersifat Gram positif yaitu J4M1 dan J5P1 Tabel 10. Bakteri simbion di dalam saluran pencernaan rayap merupakan organisme yang membantu rayap untuk mencerna selulosa sebagai makanan utamanya Li et al . 2006. Bakteri simbion mendapatkan keuntungan yaitu mendapatkan tempat perlindungan yang nyaman untuk berkembang biak. Rayap dan bakteri simbion memberikan dan mendapatkan keuntungan satu sama lainnya, sehingga terjalin sinergi diantara keduanya. Kehidupan rayap sangat bergantung pada mikrob simbion di dalam saluran pencernaannya Eutick et al. 1978; Bignell 2000. Tabel 10 Hasil karakterisasi morfologi dan fisiologi bakteri simbion dari kasta pekerja rayap M. gilvus dari CA Yanlappa-Jasinga dan Kampus IPB Dramaga Kode isolat Karakter Morfologi Fisiologi Warna Bentuk Pinggiran Gram Aerobik Cagar Alam Yanlappa-Jasinga J4M1 Putih Bulat Halus + √ J5P1 Kuning Bulat Halus + √ J5P2 Krem kekuningan Bulat Halus - √ Kampus IPB Dramaga D4M1 Putih susu Bulat Halus - √ D6P1 Putih bening Bulat Halus - √ D6P2 Putih susu mengkilat Bulat Halus - √ D6P3 Kuning kejinggaan Bulat Halus - √ D6P5 Kuning Bulat Halus - √ Keterangan: J: CA Yanlappa-Jasinga, D: Dramaga, M: saluran pencernaan tengah midgutmesenteron, P: saluran pencernaan belakang hindgutproktodeum Identifikasi Bakteri Simbion dengan Teknik Molekuler Primer universal digunakan untuk mengamplifikasi gen 16S rRNA pada bakteri simbion hasil karakterisasi morfologi dan fisiologi. Pita DNA pada sumuran 1-8 merupakan hasil amplifikasi DNA gen 16S rRNA bakteri menggunakan primer universal. Pita pada sumuran 1-8 mempunyai posisi + 1500 pb yaitu berad a segaris dengan posisi marker di posisi 1500 pb Gambar 11. Gambar 11 Hasil amplifikasi gen 16S rRNA dari bakteri simbion asal rayap CA Yanlappa-Jasinga dan Kampus IPB-Dramaga Keterangan: Sumuran 1-8 dan M merupakan kode isolat J4M1, J5P1, J5P2, D4M1, D6P1, D6P2, D6P3, D6P5, dan Marker 1kb Tabel 11 Homologi sekuen gen 16S rRNA bakteri simbion hasil isolasi rayap M. gilvus dari CA Yanlappa-Jasinga dan Kampus IPB Dramaga Kode isolat Homologi No. aksesi Query cover e-value Max- Ident J4M1 P. naphthalenovorans NR_028817 99 0.0 98 J5P1 K. palustris KC581675 95 0.0 96 J5P2 Stenotrophomonas sp. KF542918 89 0.0 94 D4M1 E. coli CP007394 100 0.0 99 D6P1 Kluyvera sp. AF176564 97 0.0 98 D6P2 Ochrobactrum sp. KF737368 96 0.0 98 D6P3 Chryseobacterium sp. EU500825 99 0.0 99 D6P5 P.nitroreducens EU500825 99 0.0 98 Analisis homologi sekuen gen 16S rRNA dari bakteri simbion tersebut menunjukkan tingkat homologi yang tinggi. Isolat dengan kode J4M1, J5P1, J5P2, D4M1, D6P1, D6P2, D6P3, dan D6P5 secara berurutan mempunyai homologi dengan Paenibacillus naphthalenovorans, Kocuria palustris, Stenotrophomonas 1500 pb 1500 pb 1000 pb 750 pb 500 pb 250 pb 1 2 3 4 5 6 7 8 M 27