Amplifikasi DNA uji dengan primer yang dirancang

8 Pengujian Primer 1 Pengujian primer pada Ganoderma spp. 1.1 Amplifikasi hasil isolasi DNA genom Ganoderma spp. DNA genom berhasil diisolasi dari keempat sampel Ganoderma spp. yaitu GIPB, GLom1, GLom2, GLom3. Keberhasilan isolasi dapat terlihat dengan melakukan elektroforesis kemudian divisualisasikan pada UV. Hasil dokumentasi menunjukkan adanya pita yang terbentuk sejajar dengan DNA marker yang berarti DNA berhasil diisolasi Gambar 3.

1.2 Amplifikasi DNA Ganoderma spp. dengan primer yang dirancang

Tahap awal pengujian hasil desain primer dapat bekerja pada DNA Ganoderma spp. adalah dengan melakukan metode PCR menggunakan sampel DNA Ganoderma sp. koleksi IPBCC GIPB. Suhu annealing kedua primer sebelumnya telah ditentukan untuk mendapatkan hasil amplifikasi pita yang jelas dengan melakukan percobaan PCR beberapa kali pada penggunaan suhu annealing 50, 52, 54, 56, 58, dan 60 ⁰C. Kedua pasang primer yang menunjukkan terbentuknya pita yang jelas dan terang dengan ukuran amplikon ± 300 bp pada suhu annealing 52 ⁰C Gambar 4. Gambar 3 Hasil isolasi DNA keempat sampel Ganoderma spp. Gambar 4 Amplifikasi PCR pada DNA sampel GIPB menggunakan kedua pasang primer Keterangan: GIPB: sampel Ganoderma sp. koleksi IPBCC kode 10.658 GLom1: sampel Ganoderma sp. pertama dari Lombok GLom2: sampel Ganoderma sp. kedua dari Lombok GLom3: sampel Ganoderma sp. ketiga dari Lombok Keterangan: Sumur pertama primer Beta-GanA Sumur kedua primer Gan-ITS12B 9 Pengujian primer selanjutnya dilakukan menggunakan tiga sampel DNA Ganoderma sp. dari Lombok GLom1, GLom2, GLom3 hasilnya menunjukkan terbentuknya pita dengan ukuran ± 200 bp Gambar 5. Hasil pengujian primer Gan-ITS12 tidak dapat teramplifikasi pada sampel DNA Ganoderma sp. Lombok GLom1, GLom2, GLom3, meskipun telah dicoba pada suhu annealing yang berbeda pada proses PCR. Hal tersebut menunjukkan bahwa primer tersebut tidak mampu menempel pada Ganoderma sp. Lombok.

1.3 Sekuensing hasil PCR dan analisis bioinformatika

Amplifikasi PCR yang dapat terbentuk kemudian dilakukan metode PCR Scale-up untuk pasangan primer Beta-Gan pada keempat sampel Ganoderma spp.. Metode PCR Scale-up adalah memperbanyak volume pada reaksi PCR normal sebanyak enam kali lipatnya. Hasil PCR Scale-up kemudian dikirim ke perusahaan analisa DNA untuk dilakukan sekuensing. Hasil sekuensing kemudian diolah menggunakan software BioEdit. Hasil pensejajaran DNA sekuensing selanjutnya di Blast pada program NCBI dengan laptop yang terhubung ke internet Lampiran 2 dan 3. Hasil sekuensing menunjukkan bahwa pita DNA yang teramplifikasi menggunakan primer Beta-Gan adalah benar adanya DNA Ganoderma spp. Tabel 2. Sampel DNA GIPB hasil PCR yang telah dianalisis teridentifikasi merupakan genus Ganoderma applanatum dengan nilai query coverage 99, nilai E-value 9e-124, dan nilai max ident atau kemiripan 95, sedangkan sampel DNA GLom1, GLom2 dan GLom 3 menunjukkan jenis yang sama yaitu Gambar 5 Amplifikasi PCR kedua pasang primer menggunakan tiga sampel DNA Ganoderma sp. Lombok GLom1, GLom2, GLom3 Tabel 2 Analisis Bioinformatika keempat sampel Ganoderma spp. menggunakan primer Beta-Gan Sampel DNA Accession Description Query Coverage E value Max. ident. GIPB JQ675614.1 Ganoderma applanatum strain ATCC 44053 beta-tubulin gene 99 9e-124 95 GLom1 JQ675670.1 Ganoderma tornatum strain CBS 109679 beta-tubulin gene 16 3.6 89 GLom2 JQ675670.1 Ganoderma tornatum strain CBS 109679 beta-tubulin gene 16 3.7 89 GLom3 JQ675670.1 Ganoderma tornatum strain CBS 109679 beta-tubulin gene 16 3.7 89 Keterangan: Sampel GIPB sebagai kontrol pada kolom 1 dan 4 Kolom M: marker 1 kb Kolom A: Primer Beta-Gan Kolom B: Primer Gan-ITS12 10 Ganoderma tornatum dengan nilai query coverage 16, nilai E-value 3.6, dan nilai kemiripan 89. Ukuran pita amplifikasi yang berbeda antara GIPB dan Glomb Gambar 5 menunjukkan adanya perbedaan posisi penempelan primer Beta-Gan Gambar 6. Primer forward menempel pada posisi yang sama yaitu posisi ke 54 pada dua sekuen cendawan Ganoderma yang berbeda spesies, sedangkan posisi akhir penempelan primer reverse terletak berbeda pada GIPB dan GLom. 2 Pengujian kespesifikan primer Primer yang telah dirancang diuji kespesifikannya terhadap sesama cendawan yang berada pada satu kelompok Basidiomycota, karena Ganoderma termasuk dalam kelompok ini. Cendawan tersebut sama-sama mampu membentuk tubuh buah berumur panjang. Cendawan tersebut yaitu jamur Enoki Flammulina velutipes, jamur Buna Shimeji Hypsizygus tessellatus, jamur Champignon A. bisporus, jamur Tiram Pleurotus ostreatus, dan jamur Merang Volvariella volvacea. Cendawan-cendawan tersebut sebelumnya telah diisolasi DNAnya Lampiran 4 Hasil amplifikasi menunjukkan bahwa kedua pasang primer tidak mampu mengamplifikasi DNA pada semua sampel cendawan uji Gambar 7. Gambar 6 Peta DNA yang terbentuk hasil amplifikasi primer Beta-Gan pada sampel GIPB dan GLom Hasil amplifikasi DNA GLom 237 bp Gambar 7 Hasil uji kespesifikan primer Beta-Gan:A, ITS12:B menggunakan DNA cendawan kelompok Basidiomycota Keterangan: Kolom: M marker 100bp, 1 Enoki Flammulina velutipes, 2 Buna Shimeji Hypsizygus tessellatus, 3 Champignon A. bisporus, 4 Jamur Tiram Pleurotus ostreatus, 5 Jamur Merang Volvariella volvacea.