6
2.1.4 Sekuensing hasil PCR dan analisis bioinformatika
Sekuensing dilakukan pada hasil amplifikasi keempat sampel Ganoderma spp.. Hasil amplifikasi PCR disiapkan hingga volume campurannya mencapai 60
µL menggunakan pasangan primer dengan program yang sama. Sebagian hasil PCR ini, sebanyak 5 µL digunakan untuk cek elektroforesis. Sisanya dikirim ke
perusahaan analisa DNA untuk sekuensing. Hasil sekuensing kemudian dibandingkan dengan sekuen nukleotida dari GenBank menggunakan
megaBLAST yang dilakukan di http:www.ncbi.nlm.nih.gov. Lampiran 2 dan 3 untuk mengidentifikasi DNA cendawan yang mampu mengamplifikasikan pita.
2.2 Pengujian kespesifikan primer
Pengujian primer dilakukan terhadap DNA cendawan dari kelompok Basidiomycota dan yang bukan dari kelompok Basidiomycota. DNA cendawan
kelompok Basidiomycota yang digunakan adalah DNA cendawan Enoki Flammulina velutipes, Buna Shimeji Hypsizygus tessellatus, Champignon A.
bisporus, Jamur Tiram Pleurotus ostreatus, dan Jamur Merang Volvariella volvacea. Cendawan kelompok bukan Basidiomycota yang digunakan yaitu
sampel DNA dari Penicillium sp., Hypoxilon sp., Mortierella sp., dan Xilaria sp.. 2.2.1 Isolasi DNA genomik cendawan dari tubuh buah
Isolasi DNA genomik cendawan dari tubuh buah menggunakan metode yang sama dengan yang berasal dari miselia, dengan modifikasi yang sedikit
berbeda. Kelima tubuh buah dari cendawan yang bukan dari kelompok Basidiomycota diambil sekitar 0,5 gram, kemudian digerus menggunakan N
2
cair dalam mortar. Hasil penggerusan dimasukkan ke dalam tabung eppendorf yang
telah diisi dengan 600 L CTAB 2 dan PVP yang sudah diinkubasi pada suhu
65 ⁰C dalam waterbath. Tabung berisi hasil gerusan ini dibolak- balik dan diinkubasi dalam waterbath pada suhu 65 ⁰C. Setelah 30 menit, diangkat dan
disimpan dalam es. Setelah kurang lebih lima menit, dita mbahkan ± 600 L fenol
dan dihomogenkan. Langkah berikutnya sama dengan tahapan ektraksi DNA dari miselia.
2.2.2 Amplifikasi DNA uji dengan primer yang dirancang
Proses amplifikasi pada tahap ini sama dengan proses pada amplifikasi DNA Ganoderma spp. dengan primer yang dirancang.
HASIL
Perancangan Primer
Primer forward maupun primer reverse didesain berdasarkan pensejajaran dari kumpulan sekuen Ganoderma spp. pada daerah ITS rRNA dan daerah
β- tubulin rRNA yang ada pada GenBank NCBI. Penamaan primer dipilih
berdasarkan daerah penanda yang digunakan, cendawan yang digunakan, dan arah amplifikasi primer yaitu forward atau reverse.
7 Berdasarkan hasil pensejajaran kumpulan sekuen daerah
β-tubulin DNA Ganoderma spp. diperoleh dua sekuen oligonukleotida pasangan primer forward
dan reverse dengan kode A. Primer forward yaitu Beta-Gan F, primer reverse yaitu Beta-Gan R. Berdasarkan hasil pensejajaran kumpulan sekuen daerah ITS
rDNA Ganoderma spp., diperoleh dua sekuen oligonukleotida yang merupakan pasangan primer forward dan reverse dengan kode B. Primer forward yaitu Gan-
ITS12 F, primer reverse yaitu Gan-ITS12 R. Runutan masing-masing dari daerah konserv dapat dilihat pada Lampiran 5 dan 6. Panjang masing-masing
oligonukleotida adalah 20 basa. Kedua pasang primer tersebut memiliki nilai GC dan Tm yang sama yaitu 50 dan 58,4 ⁰C. Ukuran amplikon yang
diharapkan pada pasangan primer Beta-Gan sekitar 305 bp, sedangkan pada pasangan primer Gan-ITS12 sekitar 308 bp Tabel 1. Posisi penempelan primer
hasil amplifikasi yang diharapkan pada kedua daerah ITS dan
β-tubulin digambarkan pada Gambar 2.
Sekuen DNA Ganoderma spp. daerah ITS1,5.8,ITS2 dari GenBank maka pasangan primer akan menempel mulai dari basa ke 144 hingga 451, sedangkan
pada daerah β-tubulin pasangan primer akan menempel mulai dari basa ke 56 hingga 360 Gambar 2.
Tabel 1 Perancangan desain primer
Primer Kode Gen rRNA Se
kuen primer 5’-3’ GC
Tm ⁰C
Amplikon yang
diharapkan Beta-Gan F
A β -Tubulin
rRNA GAT CGT ATG ATG
GCC ACG TT 50 58,4
305 bp Beta-Gan R
TGT TGA CAG CCA ACT TCC TG
50 58,4 Gan-ITS12 F
B ITS1-ITS2
rRNA TGT GTG CCT GCG
TTT ATC AC 50 58,4
308 bp Gan-ITS12 R
TAA GAC GAG CCG ACC AAG AA
50 58,4 bp=base pairpasang basa
1 72
143 215
287 359
431 503
573 bp 144 bp
451 bp Amplifikasi panjang DNA yang diharapkan dari
penempelan primer Gan-ITS12 308 bp ±
Sekuen DNA spp.
Daerah ITS1,5.8,ITS2 dari GenBank Ganoderma
1 56
56 bp 112
168 223
279 335
391 446 bp
360 bp Amplifikasi panjang DNA yang diharapkan dari
penempelan primer Beta-Gan 3 bp
± 05 Sekuen DNA
spp. Daerah Beta-Tubulin dari GenBank
Ganoderma
ITS1
5.8
ITS2
206 bp 377 bp
Gambar 2 Posisi amplifikasi kedua primer yang diharapkan akan terbentuk
8
Pengujian Primer 1 Pengujian primer pada
Ganoderma spp. 1.1 Amplifikasi hasil isolasi DNA genom
Ganoderma spp.
DNA genom berhasil diisolasi dari keempat sampel Ganoderma spp. yaitu GIPB, GLom1, GLom2, GLom3. Keberhasilan isolasi dapat terlihat dengan
melakukan elektroforesis kemudian divisualisasikan pada UV. Hasil dokumentasi menunjukkan adanya pita yang terbentuk sejajar dengan DNA marker yang
berarti DNA berhasil diisolasi Gambar 3.
1.2 Amplifikasi DNA Ganoderma spp. dengan primer yang dirancang
Tahap awal pengujian hasil desain primer dapat bekerja pada DNA Ganoderma spp. adalah dengan melakukan metode PCR menggunakan sampel
DNA Ganoderma sp. koleksi IPBCC GIPB. Suhu annealing kedua primer sebelumnya telah ditentukan untuk mendapatkan hasil amplifikasi pita yang jelas
dengan melakukan percobaan PCR beberapa kali pada penggunaan suhu annealing 50, 52, 54, 56, 58, dan 60 ⁰C. Kedua pasang primer yang menunjukkan
terbentuknya pita yang jelas dan terang dengan ukuran amplikon ± 300 bp pada suhu annealing 52 ⁰C Gambar 4.
Gambar 3 Hasil isolasi DNA keempat sampel Ganoderma spp.
Gambar 4 Amplifikasi PCR pada DNA sampel GIPB menggunakan kedua pasang primer
Keterangan: GIPB: sampel Ganoderma sp. koleksi
IPBCC kode 10.658 GLom1: sampel Ganoderma sp. pertama
dari Lombok GLom2: sampel Ganoderma sp. kedua dari
Lombok GLom3: sampel Ganoderma sp. ketiga dari
Lombok
Keterangan: Sumur pertama primer Beta-GanA
Sumur kedua primer Gan-ITS12B
Kategori