pipet 1-10 ml Pyrex, multichannel mikropipet 0,1-1 μl, 10-200μl dan 100-1000
μl Wiegthex, sentrifus Hamle dengan kecepatan 2500-5000 putaran per menit dan spuit 1 ml dan 3ml yang sucihama multichannel mikro pipet 10-100
μl, shaking
Biotek, penangas air Biotek dan Memmert, ELISA reader Biotek
ELX 808, elektroforesis Sigma, dan lempeng kaca Parmacia-Biotek.
3.2.2. Pemeriksaan Serologik
Pemeriksaan serologik serum sapi dan kambing potong yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan RBT, CFT dan I-ELISA.
1. RBT RBT adalah reaksi pengikatan antigen yang telah dilemahkan dan diwarnai
dengan antibodi dari contoh serum. Pengikatan antigen permukaan dengan antibodi menyebabkan terjadinya aglutinasi. Bila tidak terjadi aglutinasi, ini
memiliki arti tidak ada antibodi dalam contoh serum tersebut. Pengambilan contoh serum dari sapi dan kambing potong sebanyak 235
contoh serum, masing-masing dilakukan menggunakan spuit 3 ml Trumo yang sucihama. Serum dikemas dalam tabung kecil Eppendorf dan diberi label yang
jelas. Sebanyak 25 μl contoh serum sapi dan kambing potong diambil
menggunakan singlechannel pipet 10-100 μl Wiegthex dan dicampurkan dengan
25 μl reagen RBT BBALITVET di dalam sumur cawan WHO
hemagglutination tray . Larutan dicampur hingga rata menggunakan pengaduk
yang sucihama. Reaksi aglutinasi diamati setelah 4-5 menit. Hasil dinilai positif +++ jika terjadi agglutinasi sempurna, cairan jernih dan tampak jelas. Hasil
dinilai positif ++ jika terjadi agglutinasi berupa pasir halus, cairan agak jernih dan batas cukup jelas. Sedangkan RBT dinilai positif + jika terjadi aglutinasi
berupa pasir halus, cairan tidak jernih dan batas cukup jelas.
2. CFT
CFT merupakan reaksi pengikatan komplemen untuk mengukur kadar antibodi serum ataupun antigen. Prinsip reaksi ini adalah adanya kompleks
antigen dan antibodi yang homolog, menarik komplemen untuk berikatan dengan bagian Fc dari antibodi sehingga melisiskan RBC. Reaksi pengikatan komplemen
terdiri dari dua tahap. Tahap pertama adalah reaksi pengikatan sejumlah
komplemen menggunakan komplemen dengan konsentrasi 10 untuk memperoleh komplek antigen dan antibodi. Tahap kedua adalah penghancuran
eritrosit yang telah dilapisi hemolisin sistem indikator dengan menggunakan hemolisin dengan pengenceran 1:100 dan hemolisin dengan pengenceran
1:150. Reaksi komplemen dan hemolisis dilakukan dalam tabung reaksi 10ml Pyrex.
Domba yang akan diambil darahnya disuntik antigen B. abortus dalam jangka waktu dua minggu sebelum pengambilan darah. Sehingga, darah domba
yang diperoleh nantinya adalah darah domba yang telah mengandung antibodi terhadap B. abortus. Pengambilan darah domba dilakukan menggunakan spuit
yang berisi antikoagulan Na sitrat Sigma konsentrasi 3,85 dengan perbandingan 0,5 ml antikoagulan untuk 3ml darah domba. Darah disentrifugasi
dengan kecepatan 2500-5000 putaran per menit. Selanjutnya dicuci menggunakan NaCl berkonsentrasi 0,95 untuk memperoleh sel darah merah. Sistem indikator
atau hemolisin terdiri dari RBC domba konsentrasi 4 yang mengandung
antibodi terhadap B. abortus. Titrasi hemolisin dilakukan dengan menggunakan
tabung reaksi sebanyak dua belas tabung yang disusun menjadi dua baris A dan B. Baris A diberi nomor ganjil, yaitu 1, 3, 5, 7, 9 dan 11 dan baris B diberi nomor
genap, yaitu 2, 4, 6, 8, 10 dan 12. Baris A dan baris B merupakan gambaran
titrasi hemolisin. Larutan dari ke enam tabung dihomogenkan dengan cara
menggoyang rak tabung reaksi, kemudian diinkubasikan dalam penangas air selama 30 menit pada suhu 37
o
C. Sebanyak 0,25 ml komplemen 10 ditambahkan ke masing-masing tabung, diikuti dengan menambahkan 0,25 ml
RBC domba 4. Tabung reaksi disusun kembali menjadi satu baris dengan nomor
yang berurutan 1-12, larutan dihomogenkan dan diinkubasikan kembali selama 30 menit pada suhu 37
o
C. Adanya antigen dan antibodi yang homolog akan ditandai dengan adanya pengendapan eritrosit dari sistem indikator yang berarti
terjadi reaksi pengikatan komplemen.
Sebaliknya, tidak adanya kesesuaian antara antigen dan antibodi akan ditandai dengan lisisnya eritrosit dari sistem indikator reaksi komplemen negatif.
Tabung reaksi sebanyak enam buah disusun dalam satu baris dan diberi nomor berurut dari 1 sampai 6. Larutan dihomogenkan dengan cara menggoyang rak
tabung reaksi, kemudian diinkubasikan dalam penangas air selama 10 menit 37
o
C. Pada reaksi pengikatan komplemen dilakukan titrasi serum yang diuji.
Pengenceran serum mengakibatkan perubahan reaksi pada masing-masing tabung, yaitu dari pengendapan reaksi positif sampai lisisnya eritrosit reaksi negatif.
Adanya antigen dan antibodi yang homolog, ditandai dengan pengendapan eritrosit dari sistem indikator reaksi pengikatan komplemen positif. Hasil CFT
positif dengan titer 150 IU.
3. I-ELISA
