Tata Cara Penelitian METODE PENELITIAN

Protokol yang digunakan dalam penelitian ini harus valid, oleh karena itu sebelum dilakukan penambatan coumestrol pada REα perlu dilakukan validasi internal dengan menambatkan kembali 4-hidroksi-tamoksifen pada REα untuk mengetahui apakah protokol yamg digunakan dapat menghasilkan kembali pose dari ligan ko-kristal dengan menggunakan parameter nilai RMSD. Protokol dapat diterima apabila 95 dari data mempu nyai nilai RMSD ≤ 2 Å sesuai dengan diagram pengambilan keputusan Gambar 3. Tabel I. Data RMSD penambatan ulang 4-hidroksi-tamoksifen RMSD ≤ 2 Å ChemPLP RMSD ≤ 2 Å Tc-PLIF Non Filter Filter Non Filter Filter Rep.I Rep.II Rep.III Rep.I Rep.II Rep.III Rep.I Rep.II Rep.III Rep.I Rep.II Rep.III 99,9 99,8 99,8 100 100 99,9 89,6 89,9 90,5 91,2 92,5 90,6 Berdasarkan tabel I dapat diketahui bahwa protokol yang menggunakan parameter Tc-PLIF tidak dapat menghasilkan kembali pose ko-kristal sedangkan protokol yang menggunakan parameter ChemPLP baik filter maupun non filter dapat menghasilkan kembali pose ko-kristal yang ditandai dengan lebih dari 95 data memiliki nilai RMSD ≤ 2 Å oleh karena itu protokol dengan parameter ChemPLP filter dapat digunakan untuk menentukan pose penambatan coumestrol pada REα. Salah satu tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui dan menguji kemampuan protokol yang dikembangkan oleh Radifar dkk. 2013 dapat mengenali coumestrol sebagai ligan pada REα. Dari data validasi internal diputuskan protokol dengan parameter ChemPLP filter yang digunakan, namun karena protokol tersebut berdasar pada nilai ChemPLP terbaik maka nila Tc-PLIF yang didapat belum tentu merupakan nilai yang terbaik, sehingga digunakan protokol dengan parameter Tc-PLIF filter untuk menguji apakah protokol dapat mengenali coumestrol sebagai ligan pada REα. Protokol dengan parameter Tc-PLIF filter digunakan karena protokol tersebut telah divalidasi oleh Radifar dkk. 2013 bahwa protokol tersebut mampu mengenali ligan REα. Namun protokol tersebut belum dilakukan validasi apakah dapat menghasilkan kembali pose dari ligan ko-kristal. Oleh karena itu pada penelitian ini digunakan protokol dengan parameter Tc-PLIF filter untuk mengetahui dan menguji kemampuan protokol yang dikembangkan oleh Radifar dkk. 2013 dapat mengenali coumestrol sebagai ligan pada REα serta protokol dengan parameter ChemPLP filter untuk mengetahui pose coumestrol pada kantung ikatan REα.

4.1. Protokol Tc-PLIF filter

Protokol ini berdasar pada nilai Tc-PLIF terbaik dari coumestrol yang memiliki ikatan hidrogen dengan ASP351 REα pada setiap penambatannya. Penambatan dilakukan sebanyak 1.000 kali 3 kali replikasi. Coumestrol dapat dikenali sebagai ligan pada REα apabila memiliki nilai Tc-PLIF ≥ 0,600 Marcou dan Rognan, 2007. Untuk menguji apakah nilai Tc- PLIF yang didapatkan ≥ 0,600 digunakan aplikasi statistik R 3.0.1. R Development Core Team, 2013. Dari penelitian yang dilakukan didapatkan nilai Tc-PLIF dengan nilai mean dan median berturut-turut 0,356 SEM= 0,003 dan 0,417 Lampiran 12 kemudian dilakukan uji Wilcoxon dengan Hi yaitu Tc-PLIF lebih kecil dari 0,600 didapatkan nilai p-value 2,2e-16 Lampiran 12 artinya Tc-PLIF 0,600 sehingga protokol ini tidak dapat mengenali coumestrol sebagai ligan pada REα. Namun berdasarkan penelitian Hopert, dkk. 1998 dan Jacob dkk. 2000 secara in vitro maupun in vivo coumestrol aktif sebagai ligan pada REα. Oleh karena itu protokol Radifar dkk. 2013 perlu dikembangkan agar dapat mengenali coumestrol sebagai ligan bagi REα. Kelemahan dari metode interaksi sidik jari yaitu metode tersebut sangat bergantung pada senyawa standar karena prinsip dari sidik jari interaksi yaitu mengukur kemiripan sidik jari interaksi ligan dengan sidik jari interaksi senyawa standar. Dalam protokol Radifar dkk. 2013 senyawa standar yang digunakan adalah 4-hidroksi-tamoksifen yang diketahui mempunyai afinitas yang sangat tinggi terhadap REα oleh karena itu usulan pengembangannya adalah dengan mengganti senyawa standar 4-hidroksi-tamoksifen dengan senyawa ligan REα yang afinitasnya lebih rendah dari 4-hidroksi-tamoksifen. Usulan pengembangan lainnya yaitu dengan mengganti filter asam amino Asp351 degan asam amino lain yang berperan dalam pengikatan ligan bagi RE α seperti Glu353, Arg394, Thr347. Gambar 4. Histogram sebaran nilai Tc-PLIF coumestrol- REα