3.5.3.3 Pembuatan Kurva Kalibrasi Kloramfenikol Baku
Larutan induk baku kloramfenikol dipipet sebanyak 5 ml, dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dicukupkan dengan pelarut hingga garis tanda,
dikocok hingga homogen sehingga diperoleh larutan kloramfenikol dengan konsentrasi 10 µgml LIB II. LIB II dipipet 0,5; 1; 3; 5; 7; 9 dan 11 ml,
dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, diencerkan dengan pelarut hingga garis tanda, dikocok sampai homogen sehingga diperoleh konsentrasi 0,05; 0,1;
0,3; 0,5; 0,7; 0,9dan 1,1 µgml. Kemudian masing-masing larutan disaring dengan penyaring nitrat selulosa 0,2 µm, dan diinjeksikan ke sistem KCKT menggunakan
vial autosampler sebanyak 10 µl dideteksi pada panjang gelombang maksimum yang diperoleh. Selanjutnya dari luas area yang diperoleh pada kromatogram
dibuat kurva kalibrasi dihitung persamaan garis regresi dan faktor korelasinya.
3.5.3.4 Penetapan Kadar Kloramfenikol dalam Sampel
Sampel ditimbang 5 g, kemudian dimasukkan ke dalam tabung sentrifus bertutup, ditambahkan 10 ml asetonitril dikocok dengan vortex selama 30 detik,
dan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan dipisahkan dari endapan. Diulangi perlakuan dengan asetonitril terhadap endapan.
Supernatan dipisahkan dari endapan dan digabungkan supernatan pertama. Gabungan supernatan ditambahkan 1,5 g NaCl, dikocok dengan vortex selama 1
menit, dan disentrifus dengan kecepatan 3000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipisahkan dari endapan. Supernatan ditambahkan 5 ml n-heksana, dikocok
dengan vortex selama 30 detik, dan didiamkan sampai terpisah sempurna hingga terbentuk 2 lapisan, yaitu lapisan n-heksan di bagian atas dan lapisan asetonitril di
bagian bawah. Lapisan n-heksan dibuang dengan menggunakan pipet secara hati-
hati. Diulangi perlakuan dengan n-heksan. Lapisan asetonitril dikeringkan dengan alat penguap. Ekstrak dilarutkan kembali dengan pelarut sampai 5 ml kemudian
disaring dengan penyaring nitrat selulosa 0,2 µ m, dan diawaudarakan selama 10 menit, kemudian diinjeksikan ke sistem KCKT menggunakan vial autosampler
dan dideteksi pada panjang gelombang maksimum yang diperoleh dengan perbandingan fase gerak metanol-air 55:45 dan laju alir 1 mlmenit. Dilakukan
sebanyak 6 kali pengulangan untuk setiap sampel. Bagan penetapan kadar kloramfenikol dalam sampel dapat dilihat pada Gambar 3.
5 gram telur yang telah disiapkan ditambah 10 ml asetonitril
dikocok 30 detik dengan vortex disentrifus 10 menit
supernatan dan endapan
supernatan endapan
ditambah 10 ml asetonitril dikocok 30 detik dengan vortex
disentrifus 10 menit supernatan dan endapan
supernatan endapan
dipisahkan dipisahkan
Gambar 4. Bagan penetapan kadar kloramfenikol dalam sampel
kumpulan supernatan ditambah 1,5 g NaCl
dikocok 60 detik dengan vortex disentrifus 5 menit
supernatan dan endapan dipisahkan
supernatan endapan
ditambah 5 ml n-heksan dikocok 30 detik dengan vortex
dua lapisan
lapisan atas n-heksan
lapisan bawah asetonitril
diuapkan dilarutkan dengan pelarut
sampai 5 ml
larutan uji dianalisis secara KCKT kolom
C18 dengan fase gerak metanol-air 55:45, laju alir 1
ml, pada panjang gelombang maksimum yang diperoleh
hasil supernatan
dipisahkan
3.5.3.5 Analisis Data secara Statistik
Kategori