3.3.1 Identifikasi dan pengambilan sampel
Penelitian diawali dengan pengambilan sampel anemon laut pada tanggal 20 Februari 2011 pukul 16.00 WIB. Sampel anemon laut diambil menggunakan
pahat dan palu dengan cara memahat sekeliling tempat menempelnya agar anemon tidak lepas dari substratnya sehingga anemon tidak merasa terganggu.
Anemon yang telah diambil kemudian dimasukkan ke dalam keranjang plastik untuk dibawa ke daratan. Pengambilan sampel anemon laut ini dilakukan pada
kedalaman 0,5 m – 1 m. Ukuran anemon yang diambil dibagi menjadi 3 katagori
yaitu ukuran kecil kurang dari 10 cm, berat 140-160 gram, sedang 10-25 cm, berat 200-315 gram, besar lebih dari 25 cm, berat 500-700 gram. Ukuran ini
merupakan ukuran diameter tubuh dari anemon laut. Tingkat kesegaran anemon dibedakan menjadi 2 jenis yaitu anemon segar dan anemon mati. Anemon segar
memiliki ciri-ciri yaitu tidak adanya mucus yang keluar, keadaan tentakel yang mengembang, warna yang cerah, dan kondisi mesenterial filaments yang normal,
sedangkan anemon mati memiliki ciri-ciri seperti cukup banyaknya sedang keluarnya mucus, keadaan tentakel yang mengembang, warna agak pucat, dan
abnormalnya mesenterial filaments. Spesies anemon laut ini kemudian diidentifikasi dengan melihat penampakan, bentuk tentakel, warna tubuh dan
disesuaikan dengan buku identifikasi yang berjudul Tropical Pasific Invertebrte Collin dan Arnesson 1995.
3.3.2 Penelitian pendahuluan
Tahap penelitian pendahuluan meliputi ekstrak senyawa bioaktif dan penentuan ekstrak terbaik berdasarkan ukuran tubuh anemon laut dengan uji
antioksidan menggunakan metode DPPH. Tujuan yang ingin dicapai adalah menentukan ukuran tubuh terbaik yang menghasilkan ekstrak dengan sifat
antioksidan yang paling tinggi.
3.3.2.1 Ekstraksi senyawa bioaktif Pramadhany 2006
Ekstraksi komponen antioksidan dilakukan dengan menghasilkan ekstrak kasar terlebih dahulu. Komponen antioksidan diperoleh melalui ekstraksi tunggal
dengan menggunakan pelarut metanol. Sampel anemon laut yang berbeda ukuran kecil, sedang dan besar dan tingkat kesegaran segar dan mati, masing-masing
sebanyak 50 gram dihancurkan sampai halus dengan blender kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Pelarut metanol ditambahkan sampai terendam
dengan perbandingan bahan dan pelarut 1:3 wv. Erlenmeyer ditutup dengan kapas dan alumunium foil untuk mencegah penguapan dari pelarut. Sampel
dimaserasi dengan menggunakan orbital shaker selama 2 x 24 jam. Hasil larutan maserasi tersebut disaring dengan menggunakan kertas saring Whatman 42 untuk
memisahkan filtrat dan residunya. Filtrat yang didapat dievaporasi pada suhu 37
o
C. Ekstrak kasar yang diperoleh dimasukkan ke dalam botol ekstrak yang akan digunakan untuk dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH
Salazar-Aranda et al. 2009 dan uji komponen fitokimia secara kualitatif Harborne 1987. Proses esktraksi dapat dilihat pada Gambar 4.
Gambar 4 Diagram alir proses ekstraksi anemon laut
Sumber: Pramadhany 2006 yang dimodifikasi
Ukuran
Penimbangan 50
Maserasi 2x 24 jam dengan metanol 150 ml
Penyaringan
Filtrat Residu
Evaporasi
Ekstrak Anemon laut
Tingkat kesegaran
Pencacahan
Evaporasi Maserasi 2 x 24 jam dengan
metanol 150 ml wv Penimbangan 50 g
Ekstrak kasar
3.3.2.2 Uji
aktivitas antioksidan
dengan metode
DPPH Salazar-Aranda
et al. 2009
Ekstrak kasar anemon laut dari hasil ekstraksi tunggal menggunakan pelarut metanol dilarutkan dalam etanol dengan konsentrasi yang berbeda. Ekstrak kasar
ukuran tubuh kecil dilarutkan dalam etanol dengan konsentrasi 4.000, 2.000, 1.000, 500, 250, 125, 62,5, dan 31,25 ppm. Ekstrak kasar ukuran tubuh besar
dilarutkan dalam etanol dengan konsentrasi 800, 600. 400, 200 ppm. Perhitungan larutan stok dan proses pengencerannya dapat dilihat pada Lampiran 2.
Larutan DPPH yang digunakan, dibuat dengan melarutkan kristal DPPH dalam pelarut metanol 1 mM. Kemudian sampel dan pembanding dipindahkan ke
dalam microplate sebanyak 100 µl menggunakan pipet mikro dan ditambahkan 100 µl DPPH. Campuran tersebut diinkubasi pada suhu 37 °C selama 30 menit,
kemudian diukur absorbansinya dengan menggunakan Elisa Reader. Aktivitas antioksidan dari masing-masing sampel dinyatakan dengan persen inhibisi, yang
dihitung dengan rumus sebagai berikut: inhibisi=
absorbansi blanko-absorbansi sampel absorbansi blanko
x 100 Nilai konsentrasi dan hambatan ekstrak diplot masing-masing pada sumbu
x dan y pada persamaan regresi linier. Persamaan garis yang diperoleh dalam bentuk y = bx + a digunakan untuk mencari nilai IC inhibitor concentration,
dengan menyatakan nilai y sebesar 50 dan nilai x sebagai IC
50
. Nilai IC
50
menyatakan konsentrasi larutan sampel yang dibutuhkan untuk mereduksi DPPH sebesar 50 .
3.3.3 Penelitian utama