21
3.5.4 Identifikasi Bakteri Menggunakan Analisis Sekuen 16S rDNA
Pada penelitian ini metode yang digunakan dalam analisis sekuen DNA mengacu pada metode Sambrook et al. 1999, yaitu:
1. Persiapan larutan pengesktrak Larutan pengekstrak dibuat dengan menyiapkan SDS 10, Phenol, NaOAc 3
M, dan Solution I. Cara pembuatan Solution I yaitu dengan mencampurkan larutan dengan konsentrasi 50 mM glucose, 25 mM tris-HCl, dan 10 mM
EDTA, kemudian larutan distrerilisasi dengan cara diautoklav dan disimpan pada suhu 4
o
C. 2. Ekstraksi
Kultur bakteri dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml kemudian disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu 4
o
C selama 5 menit, kemudian di buang supernatannya. Tambahkan 400 µl Larutan I 50mM Glukose, 25mM Tris-
HCl, 10mM EDTA, kemudian disterilisasi pada suhu 121
o
C selama 20 menit. Kemudian ditambahkan 100 µl Lysozim 2 mgml dan di inkubasi dalam es
selama 10 menit dan di tambahkan 50 µl 10 SDS. Rotamix selama 10 menit atau sampai bening dan di tambahkan 550 µl Phenol, rotamix kembali selama
10 menit dan di sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm, dengan suhu 4
o
C, selama 5 menit.
3. Purifikasi Purifikasi dilakukan dengan menambahkan 110 3 M volume NaOAc
kemudian di sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu 4
o
C selama 3 menit. Tambahkan 2 kali volume EtOH 100 kemudian di rotamix. Di
simpan pada suhu -20
o
C selama 30 menit. Sentrifugasi pada kecepatan 5000
22
rpm pada suhu 4
o
C selama 5 menit. Buang supernatannya dan keringkan vacum dry. Kemudian ditambahkan 100 µl TE buffer dan 1 µl RNAse 1
mgml, dan di inkubasi pada suhu 37
o
C selama 1 jam. Kemudian di simpan pada suhu -20
o
C.
Untuk mengetahui tingkat homologi bakteri D2.2, hasil sekuen di up load menggunakan aplikasi Basic Local Alignment Search Tool BLAST pada
GenBank National Center for Biotechnology Information NCBI yang dapat diakses pada alamat www.ncbi.nlm.nih.gov untuk dapat diketahui bakteri yang
memiliki tingkat homologi paling tinggi dengan bakteri D2.2. Pohon filogentik bakteri dibuat menggunakan aplikasi online Clustal Omega
yang dapat diakses pada website Europan Bioinformatic Institute EBI yaitu pada alamat http:www.ebi.ac.ukToolsmsaclustalo
. Sekuen dari bakteri D2.2 dalam
kemudian dibandingkan dengan sekuen bakteri yang memiliki homologi paling tinggi dengan bakteri D2.2 yang dapat diakses pada GenBank di National Center
for Biotechnology Information NCBI. Kemudian di up load dalam format FASTA. Setelah data filogenetik didapatkan yaitu dengan format phylip ph,
kemudian dibaca menggunakan aplikasi Tree View X dan dan dimodifikasi sesuai kebutuhan tampilan pohon filogenetik.
Kategori