10
BAB III. METODE PENELITIAN
3.1 Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Agustus 2014 hingga Januari 2015 di Laboratorium Mikrobiologi Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam, Universitas Jember.
3.2 Bahan dan Alat Penelitian
Bahan yang digunakan pada penelitian ini yaitu isolat Rhizopus oligosporus koleksi Laboratorium Mikrobiologi, Jurusan Biologi, FMIPA Universitas Jember,
kedelai, ragi tempe, PDA Potato Dextrose Agar, aquades steril, basal mineral, pepton 0.75, dan media M9 Na
2
HPO
4
.2H
2
O 6 gr, KH
2
PO
4
3 gr, NaCl 0.5 gr, L- Asparagin 5 gr, 1 molL MgSO
4
.7H
2
O 2 mL, 0.1 molL CaCl
2
.2H
2
O 1 mL, agar 20 gr, dan pH 7 dalam 1 L aquades dengan Phenol red 2.5: 0.04-0.36 mL, Buffer
fosfat TRIS-HCl 0.50 mmol pH 8.5. Alat yang akan digunakan pada penelitian ini antara lain cawan petri,
erlenmeyer, spatula, alumunium foil, shaker, oven, autoklaf, tabung reaksi, jarum ose bulat dan tusuk, botol falcon, rak tabung reaksi, beaker glass, pipet volume, pipet
tetes, mikro pipet, tip, vorteks, kertas dorslag, mikroskop, inkubator, spektrofotometer, sentrifuge, pH meter, indikator pH universal, laminar air flow,
Haemasitometer, neraca analitik, waterbath, dan kompor.
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Peremajaan Isolat
Rhizopus oligosporus
Koleksi isolat R. oligosporus diinokulasikan pada media PDA miring dan dinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 30°C sebagai stok isolat dan untuk uji lanjut.
3.3.2 Uji Aktivitas Rhizopus oligosporus secara Semikuantitaif pada media M9
modified
Isolat R. oligosporus yang telah dibuat stok kulturnya, dilakukan uji semikuantitatif pada media M9 modified untuk mengetahui indeks aktivitas enzim
IAE L-Asparaginase. Uji semikuantitaif merupakan metode yang cepat dan produksi L-Asparaginase lebih tervisualisasi secara langsung Gulati et al., 1996.
Satu ose isolat diinokulasikan tepat di tengah media M9 modified dengan indikator phenol red
, kemudian diinkubasi pada suhu 30
o
C selama 2x24 jam. Setelah 48 jam, diamati kemampuan R. oligosporus dalam menghidrolisis asparagin yang terkandung
dalam media M9 modified dan diindikasikan dengan terbentuknya zona pink di sekitar koloni. Aktivitas semikuantitatif R. oligosporus didapatkan dengan mengukur
diameter koloni dan diameter zona pink sehingga dperoleh nilai indeks aktivitas enzim dengan persamaan:
koloni diameter
pink zona
diameter enzim
aktivitas indeks
3.3.3 Kurva Kepadatan Spora Rhizopus oligosporus
Kurva kepadatan spora R. oligosporus dibuat dengan mengkulturkan spora R.oligosporus
pada media PDA miring, diinkubasi pada suhu 30
o
C. Kultur PDA miring diamati kepadatan spora setiap hari selama 7 hari. Pengamatan dilakukan
dengan menambahkan 9 ml aquades steril pada tabung kultur. Spora dikerik dengan jarum ose hingga merata. Suspensi spora yang didapat dipindahkan secara aseptis
pada tabung steril dan dihomogenkan. Sebanyak 1 ml suspense spora diteteskan pada
Haemocytometer dan dihitung dengan menggunakan mikroskop. Spora yang dihitung
adalah spora yang ada pada kotak sedang Haemocytometer. Perhitungan dilakukan sebanyak lima kali. Jumlah sporaml sampel ditentukan dengan persamaan berikut:
S=
Keterangan: S= Jumlah sporaml; n= Rerata jumlah spora pada bidang hitung; L= Luas bidang hitung 0.2 mm
2
; t= kedalaman bidang hitung 0.1; d= faktor pengenceran 10
-1
.
3.3.4 Pembuatan Inokulum Rhizopus oligosporus
Pembuatan inokulum diawali dengan pengukuran pertumbuhan R. oligosporus yang sudah diremajakan pada media PDA miring, yang diinkubasi pada suhu 30
o
C selama 7 hari. Pengamatan dilakukan dengan menambahkan 9 ml aquades steril pada
tabung kultur. Spora dikerik dengan jarum ose hingga merata. Suspensi spora yang didapat dipindahkan secara aseptis pada tabung steril dan dihomogenkan. 10µl
suspensi spora diteteskan pada bidang haemacytometer. Dihitung dengan menggunakan rumus pada prosedur 3.4.3. Hingga didapatkan kepadatan spora 10
8
selml. Fermentasi padat menggunakan kepadatan spora berkisar 10
4
hingga 10
8
selml. Mitchell et al., 2000 menyatakan bahwa kepadatan spora yang optimum digunakan berkisar 10
4
hingga 10
8
selml karena jika kurang dari 10
4
biomassa spora tidak mencukupi untuk fermentasi, sedangkan jika melebihi 10
8
akan memicu pertumbuhan kontaminan.
3.3.5 Fermentasi Padat Kedelai menggunakan Rhizopus oligosporus
Fermentasi padat atau solid state fermentation merupakan metode yang sering digunakan untuk memproduksi enzim dengan menggunakan kapang. Pada proses
fermentasi kedelai menggunakan 2 jenis substrat, yaitu kedelai dan tepung kedelai. Kedelai dicuci dan direndam dalam air yang ditambah cuka selama 12 jam pada suhu
kamar. Pemberian cuka berfungsi agar pH kedelai turun yang sesuai dengan pH tumbuh kapang. Kemudian kedelai yang sudah direndam ditiriskan, dikelupas kulit
arinya dan disterilkan dengan autoklaf pada 121
o
C selama 15 menit. Fermentasi dengan substrat kedelai setelah dingin, sebanyak 10 inokulum R. oligosporus
dengan kepadatan sel 10
8
selml diinokulasikan pada 500 gram kedelai dalam basal mineral vb sebagai sumber karbon dan sumber energi. Fermentasi dilakukan pada
suhu 30
o
C selama 6 hari Cheng et al., 2011. Substrat tepung kedelai, setelah disterilisasi proses selanjutnya yaitu pengeringan, kemudian ditumbuk atau diblender
untuk mendapatkan bubuk kedelai. Pada fermentasi dengan tepung kedelai, total media produksi yang digunakan 5ml dengan rincian substrat 2.25 gram, mineral
2.25ml, dan ragi tempe atau spora R. oligosporus Ragi tempe digunakan sebagai kontrol baik fermentasi dengan kedelai
ataupun tepung kedelai. Kedelai yang diinokulasi dengan spora isolat R. oligosporus diberi nama kedelai spora R. oligosporus KSR, sedangkan dengan kedelai yang
diinokulasi dengan ragi tempe diberi nama kedelai ragi KR.
3.3.6 Ekstraksi L-Asparaginase
Setelah masa inkubasi, enzim ekstrak kasar diekstraksi dari substrat menggunakan Buffer Fosfat 0.1M pH 8 dengan perbandingan 1:2 untuk kedelai,
sedangkan tepung kedelai dengan perbandingan 1:4 Hosamani dan Kaliwal, 2011; Suresh and Raju, 2012 dalam substrat medium. Shaker selama 15 menit kemudian di
sentrifuge 8000 rpm selama 20 menit. Supernatan yang dihasilkan diestimasi sebagai crude enzim
L-asparaginase. Crude enzim L-asparaginase disimpan di dalam freezer - 20°C untuk mencegah kerusakan enzim dan kontaminan.
ml digunakan
yang enzim
volume x
menit inkubasi
waktu uMol
dihasilkan yang
Ammonia ml
UI
3.3.7 Uji Kuantitatif L-Asparaginase a. Pembuatan Standart Ammonium Sulfat
Standart ammonium sulfat dibuat dengan mereaksikan 100µL ammonium sulfat dengan konsentrasi 5µM, 10µM, 15µM, 20 µM, 25µM, 30µM, dan 35µM. Setiap
konsentrasi ditambahkan dengan reagen Nessler sebanyak 200µL dan 3.7 ml aquades steril. Campuran tersebut direaksikan selama 20 menit. Kemudian diukur OD dengan
panjang gelombang 450 nm. Blanko disiapkan dengan penambahan 1 mL aquades Kushwaha et al., 2012. Berdasarkan nilai absorbansi yang diperoleh dibuat kurva
regresi linear yang menunjukkan hubungan antara konsentrasi dengan nilai absorbansi larutan sampel.
b. Uji Aktivitas L-asparaginase
Aktivitas L-Aspraginase ditentukan berdasarkan estimasi jumlah ammonia yang dibebaskan dari L-Asparaginase. Reaksi enzimatik terdiri atas 0.5ml L-
Asparagin 0.04M, 0.5ml buffer Tris-HCl 0.1M pH 8, 0.5ml larutan enzim dan 0.5ml air destilasi ditambahkan hingga total volume 2ml. Lalu diinkubasi pada suhu
37
o
C selama 30 menit. Reaksi berhenti stopped reaction dengan ditambahkan 0.5ml asam Trichloro-asetat TCA 1.5M. Blanko disiapkan dengan penambahan
enzim setelah penambahan TCA. 0.1ml dari campuran diatas diambil, ditambahkan 0.2ml reagen Nessler, dan ditambahkan 3.7ml aquades. Setelah diinkubasi pada suhu
20
o
C selama 20 menit diukur nilai OD dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 450nm. Konsentrasi amonium dari reaksi ditentukan berdasarkan kurva
standart ammonium sulfat Hosamani dan Kaliwal, 2011; Suresh and Raju, 2012. Aktivitas enzim UI didefinisikan sebagai jumlah enzim yang mengkatalis
pembentukan 1µMol Ammonia per menit Gulati et al., 1996. UI L-Asparaginase ditentukan dengan persamaan berikut:
15
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Uji Semikuantitatif Rhizopus oligosporus pada media M9 modified
Pada uji semikuantitatif, adanya zona bening di sekitar koloni R. oligosporus menunjukkan bahwa R.
oligosporus mampu mendegradasi asparagin yang
terkandung dalam media M9 modified terdiri atas mineral, asparagin dan Phenol Red sebagai indikator. L-asparagine dibutuhkan sebagai sumber nitrogen untuk sintesis
protein dan kelangsungan hidup sel. L-asparaginase mengkatalis hidrolisis gugus amida dari L-asparagin menghasilkan aspartat dan NH
4 +
Cho et al., 2007. NH
4 +
yang dihasilkan dari proses pemecahan tersebut menyebabkan perubahan pH pada medium. Hal ini dibuktikan dengan adanya perubahan warna dari jingga menjadi
merah muda di sekitar koloni. Pada media M9 modified yang telah diinokulasi R. oligosporus
gambar 4.1 IIA, muncul perubahan warna menjadi merah muda di sekitar tusukan. Sebagai kontrol, media M9 modified tanpa inokulum tidak
mengalami perubahan warna menjadi merah muda. Perubahan warna dari jingga menjadi merah muda terjadi karena perubahan
pH dari
asam menjadi
basa IJIRSET,
2013. Struktur
Phenol red
phenolsulfonphtalin atau PSP terdiri atas gugus sulfat yang bermuatan negatif dan gugus keton yang bermuatan positif H
2 +
PS
-
. Ketika pH meningkat, proton dari gugus keton hilang, menghasilkan warna kuning, bermuatan negatif dilambangkan
sebagai HPS
-
. Ketika pH meningkat lagi, gugus hidroksida dari phenol yang kehilangan proton, menghasilkan ion merah sebagai PS
2-
Tamura and Maeda, 1997.
Kategori