3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Peremajaan Isolat
Rhizopus oligosporus
Koleksi isolat R. oligosporus diinokulasikan pada media PDA miring dan dinkubasi selama 2x24 jam pada suhu 30°C sebagai stok isolat dan untuk uji lanjut.
3.3.2 Uji Aktivitas Rhizopus oligosporus secara Semikuantitaif pada media M9
modified
Isolat R. oligosporus yang telah dibuat stok kulturnya, dilakukan uji semikuantitatif pada media M9 modified untuk mengetahui indeks aktivitas enzim
IAE L-Asparaginase. Uji semikuantitaif merupakan metode yang cepat dan produksi L-Asparaginase lebih tervisualisasi secara langsung Gulati et al., 1996.
Satu ose isolat diinokulasikan tepat di tengah media M9 modified dengan indikator phenol red
, kemudian diinkubasi pada suhu 30
o
C selama 2x24 jam. Setelah 48 jam, diamati kemampuan R. oligosporus dalam menghidrolisis asparagin yang terkandung
dalam media M9 modified dan diindikasikan dengan terbentuknya zona pink di sekitar koloni. Aktivitas semikuantitatif R. oligosporus didapatkan dengan mengukur
diameter koloni dan diameter zona pink sehingga dperoleh nilai indeks aktivitas enzim dengan persamaan:
koloni diameter
pink zona
diameter enzim
aktivitas indeks
3.3.3 Kurva Kepadatan Spora Rhizopus oligosporus
Kurva kepadatan spora R. oligosporus dibuat dengan mengkulturkan spora R.oligosporus
pada media PDA miring, diinkubasi pada suhu 30
o
C. Kultur PDA miring diamati kepadatan spora setiap hari selama 7 hari. Pengamatan dilakukan
dengan menambahkan 9 ml aquades steril pada tabung kultur. Spora dikerik dengan jarum ose hingga merata. Suspensi spora yang didapat dipindahkan secara aseptis
pada tabung steril dan dihomogenkan. Sebanyak 1 ml suspense spora diteteskan pada
Haemocytometer dan dihitung dengan menggunakan mikroskop. Spora yang dihitung
adalah spora yang ada pada kotak sedang Haemocytometer. Perhitungan dilakukan sebanyak lima kali. Jumlah sporaml sampel ditentukan dengan persamaan berikut:
S=
Keterangan: S= Jumlah sporaml; n= Rerata jumlah spora pada bidang hitung; L= Luas bidang hitung 0.2 mm
2
; t= kedalaman bidang hitung 0.1; d= faktor pengenceran 10
-1
.
3.3.4 Pembuatan Inokulum Rhizopus oligosporus
