Metode Rancangan Kerangka Operasional Instrumen Penelitian

BAB 3 METODOLOGI PENELITIAN

3.1. Tempat dan Waktu Penelitian 3.1.1. Tempat Penelitian Penelitian ini dilakukan di Sentra Diagnostik Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, RSUP H. Adam Malik Medan dan laboratorium swasta spesialis Patologi Anatomi di Medan.

3.1.2. Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan mulai bulan Juni 2008 sampai September 2008 yang meliputi studi kepustakaan, pengumpulan data, pengumpulan sampel, penelitian dan hasil penelitian.

3.2. Metode Rancangan

Metode rancangan penelitian yang digunakan adalah analitik dengan studi cross sectional. Tiap subjek penelitian hanya diobservasi sekali saja dan pengukuran dilakukan terhadap status karakter atau variabel subjek pada saat pemeriksaan. 29 Lidya Imelda Laksmi : Tampilan Imunositokimia Her2Neu Pada Biopsi Aspirasi Metastasis Karsinoma Nasofaring Kelenjar Limfe, 2009

3.3. Kerangka Operasional

Rancangan penelitian yang digunakan dapat digambarkan seperti gambar berikut ini: Metastasis karsinoma, tipe: squamous cell ca atau undifferentiated ca Anamnese åkeluhan yang mendukung untuk metastases KNF Imunositokimia HER2neu Biopsi aspirasi jarum halus ulang II Biopsi aspirasi jarum halus å Pewarnaan Diff Quik Pembesaran KGB palpasi + Negative Lemah +1 Sedang +2 Kuat +3 Gambar 3.1. Kerangka Operasional 3.4. Populasi, Sampel dan Besar Sampel Penelitian 3.4.1. Populasi Populasi dalam penelitian ini adalah pembesaran KGB yang teraba dan didiagnosa sebagai metastasis KNF ke KGB dengan cara biopsi aspirasi jarum halus yang diperoleh dari tempat penelitian dilakukan. Lidya Imelda Laksmi : Tampilan Imunositokimia Her2Neu Pada Biopsi Aspirasi Metastasis Karsinoma Nasofaring Kelenjar Limfe, 2009

3.4.2. Sampel

Sampel pada penelitian ini adalah hasil sediaan hapus dari biopsi aspirasi jarum halus pembesaran KGB yang teraba dan didiagnosa sebagai metastasis KNF ke KGB, jenis; undifferentiated carcinoma , dan squamous cell carcinoma

3.4.3. Besar Sampel Penelitian

Perkiraan besarnya sampel penelitian berdasarkan perhitungan dengan menggunakan rumus: 2 2 1 . d p p z n − = α Keterangan: n = jumlah populasi z = tingkat kepercayaan 95 Z-score = 1,96 p = proporsi seluruh lesi, bila tidak ada dianggap 50 atau 0,5 d = ketepatan 0,2 2 2 20 , 5 , 5 , 96 , 1 x n = = 24,01 25 sampel Maka besar sampel ditetapkan 25 sediaan sitologi metastasis KNF ke KGB jenis; undifferentiated carcinoma dan squamous cell carcinoma Lidya Imelda Laksmi : Tampilan Imunositokimia Her2Neu Pada Biopsi Aspirasi Metastasis Karsinoma Nasofaring Kelenjar Limfe, 2009 3.5. Kriteria Inklusi dan Eksklusi 3.5.1. Kriteria Inklusi Yang termasuk kriteria inklusi adalah semua sediaan sitologi biopsi aspirasi jarum halus pada pembesaran KGB leher yang teraba pada saat palpasi dan didiagnosa sebagai metastasis KNF ke KGB jenis; undifferentiated carcinoma dan squamous cell carcinoma. . Pewarnaan sediaan sitologi menggunakan pewarnaan Diff-Quik.

3.5.2. Kriteria Eksklusi

• Sediaan hapus sitologi dari pembesaran KGB leher dengan pewarnaan Diff-Quik dan didiagnosa bukan sebagai metastasis KNF ke KGB • Sediaan sitologi pembesaran KGB yang rusak dan tidak dapat diproses dengan pulasan imunositokimia HER2neu. 3.6 Variabel Penelitian dan Definisi Operasional 3.6.1. Variabel Penelitian Variabel yang menjadi perhatian didalam penelitian ini yaitu: • Variabel bebas adalah HER2neu • Variabel terikat adalah metastasis KNF ke KGB leher jenis undifferentiated carcinoma dan squamous cell carcinoma . Lidya Imelda Laksmi : Tampilan Imunositokimia Her2Neu Pada Biopsi Aspirasi Metastasis Karsinoma Nasofaring Kelenjar Limfe, 2009

3.6.2. Definisi Operasional

• Imunositokimia immunocytochemistry= ICC adalah suatu pemeriksaan laboratorium praktis yang menggunakan antibodi sebagai target resepor antigen pada sel. • HER2neu human eoidermal growth factor receptor 2, dikenal juga sebagai ErbB-2, ERBB2 adalah protein yang memberikan tingkat agresivitas yang tinggi pada karsinoma payudara. HER2neu ditandai juga sebagai CD 340 cluster of differentiation 340. • Hasil pulasan imunositokimia HER2neu adalah tampilan pulasan warna coklat pada membran sitoplasma sel epitel yang dinyatakan: o Negatif, bila tidak berhasil menampilkan warna coklat, dimana pada saat proses yang sama kontrol + menampilkan warna coklat dengan pewarnaan kromogen DAB. o Positif, bila terdapat tampilan pulasan warna coklat pada sitoplasma sel dengan menggunakan mikroskop cahaya pembesaran 400x pada 5 lokasi lapangan pandang dan pada saat yang sama kontrol + juga menampilkan warna yang sama. Perhitungan luas hasil pulasan imunositokimia HER2neu adalah sebagai berikut: ̇ Skor 0 : negatif ̇ Skor 1 tampilan lemah : 10 sel yang terpulas Fokal • Skor 2 tampilan sedang : 10-49 sel epitel yang Lidya Imelda Laksmi : Tampilan Imunositokimia Her2Neu Pada Biopsi Aspirasi Metastasis Karsinoma Nasofaring Kelenjar Limfe, 2009 terpulas fokal ̇ Skor 3 tampilan kuat : ≥ 50 sel epitel yang terpulas difus o Biopsi aspirasi jarum halus adalah suatu teknik pengambilan sediaan sitologi pada benjolan yang teraba pada saat melakukan palpasi, dengan menggunakan alat pistolet dan spuit 10 cc. o Karsinoma adalah suatu neoplasma ganas yang berasal dari sel epitel. o Metastasis adalah suatu kemampuan dari tumor ganas untuk melakukan implantasi sekunder yang terpisah dari tumor primer. o Kelenjar getah bening adalah suatu jaringan yang berperan penting dalam mengatur mekanisme pertahanan tubuh yang tersebar di seluruh tubuh sepanjang jalur pembuluh limfatik. 3.7. Prosedur Penelitian 3.7.1. Pengambilan Sampel sitologi Peralatan yang digunakan adalah pistolet Comeco Swedia, spuit disposible 10 ml, ukuran jarum 22-23 G, panjang 30-50 mm, kapas alkohol dan lokasi pengambilan pada pembesaran KGB yang teraba pada saat palpasi.

3.7.2. Prosedur Pengambilan Sediaan Sitologi

• Kulit didesinfeksi, tanpa menggunakan anastesi, nodul atau tumor difiksasi diantara jari tangan, sambil kulit di atasnya di regangkan. Lidya Imelda Laksmi : Tampilan Imunositokimia Her2Neu Pada Biopsi Aspirasi Metastasis Karsinoma Nasofaring Kelenjar Limfe, 2009 • Apabila jarum sudah berada di dalam massa tumor, piston ditarik ke arah proksimal dan tekanan di dalam tabung menjadi negatif • Pada posisi piston di bagian proksimal, jarum digerakkan maju mundur, sehingga ekstrak aspirat yang mengandung sejumlah sel tumor masuk ke dalam lumen jarum atau tabung suntik. Menurut Thomson dengan gerakan mundur maju dari ujung jarum, terjadi selective sampling yang merupakan mekanisme biopsi aspirasi untuk memperoleh sediaan aspirat yang representatif. Oertel berpendapat bahwa gerakan mundur maju dari ujung jarum cukup pada satu garis needle tract. Apabila aspirat sudah kelihatan pada muara jarum, pegangan piston dilepaskan. Tujuannya untuk mencegah aspirat masuk ke dalam tabung suntik, sehingga sulit untuk dikeluarkan, kecuali pada aspirat kista dimana cairan di evakuasi hingga kista mengalami kolaps. • Sebelum jarum dicabut, piston dalam tabung suntik dikembalikan pada tempat semula dengan melepaskan pegangan piston, sehingga tekanan di dalam tabung kembali seperti semula. Tujuannya untuk mencegah masuknya ekstrak jaringan yang berada di sepanjang needle tract di luar massa tumor pada waktu jarum dicabut, yang dapat mengacaukan pemeriksaan sitologi aspirasi tumor Lidya Imelda Laksmi : Tampilan Imunositokimia Her2Neu Pada Biopsi Aspirasi Metastasis Karsinoma Nasofaring Kelenjar Limfe, 2009 • Untuk mengeluarkan aspirat, jarum dibebaskan dari tabung suntik, piston ditarik ke arah proksimal kemudian jarum disatukan kembali dengan tabung. Tekanan di ruangan tabung menjadi positif. Lalu, ujung jarum diletakkan di atas kaca objek, piston didorong pelan-pelan dan aspirat diteteskan di atas kaca objek dan dibuat sediaan hapus. Untuk mengosongkan jarum atau tabung, prosedur ini dilakukan berulang-ulang. 3.7.3. Bahan dan Prosedur pewarnaan Diff-Quik 3.7.3.1. Bahan pewarnaan Diff Quik • Larutan fiksatif : Triarylmethane Dye, 100 PDC Methyl alkohol, dalam konsentrasi 0,002 gliter • Larutan I : Xanthene Dye, 100 PDC Buffer Sodium azide, dalam konsentrasi 1,25 gliter • Larutan II : Thiazine Dye Mixture, 100 PDC Buffer, dalam konsentrasi 1,25 gliter

3.7.3.2. Prosedur pewarnaan Diff-Quik

• Celupkan sediaan kedalam larutan fiksatif selama 5 Lidya Imelda Laksmi : Tampilan Imunositokimia Her2Neu Pada Biopsi Aspirasi Metastasis Karsinoma Nasofaring Kelenjar Limfe, 2009 detik 5 kali celup masing-masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir. • Celupkan sediaan kedalam larutan I selama 5 detik 5 kali celup masing-masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir. • Celupkan sediaan kedalam larutan II selama 5 detik 5 kali celup, masing-masing satu detik. Kelebihannya biarkan mengalir. • Cuci sediaan dengan air distilasi atau air diionisasi • Keringkan, beri entelan dan siap dilihat dibawah mikroskop. Hasil : Inti : berwarna biru Sitoplasma : eosinofilik 20

3.7.4. Prosedur kerja imunositokimia HER2neu pada sediaan sitologi

Setelah dibuat sediaan hapus dengan menggunakan kaca objek yang telah di coating dengan poly-L-lysine atau menggunakan silanized slide agar sediaan smear dapat melekat pada kaca objek selama proses imunositokimia, kemudian difiksasi dengan methanol absolut selama 30 menit selanjutnya masukkan slide kedalam PBS. Langkah 1 : Endogenous Enzyme Block Lidya Imelda Laksmi : Tampilan Imunositokimia Her2Neu Pada Biopsi Aspirasi Metastasis Karsinoma Nasofaring Kelenjar Limfe, 2009 • Bersihkan preparat dari sisa buffer pencuci dengan menggunakan lap khusus. • Teteskan Dual endogenous enzyme block secukupnya untuk menutupi seluruh specimen. • Inkubasi selama 5 -10 menit. • Bilas dengan air distilasi atau solusi buffer tanpa mengenai specimen langsung. • Letakkan preparat dalam bath buffer yang baru. Langkah 2 : Reagen antibodi primer atau kontrol negatif • Bersihkan preparat dari sisa cairan buffer pencuci dengan lap khusus. • Teteskan antibodi primer yang sudah diencerkan secukupnya menutupi seluruh jaringan. • Inkubasi selama 30 menit. • Bilas dengan lembut pada cairan buffer dan tempatkan dalam bath buffer yang baru. Jika prosedur pewarnaan ingin di interupsi, slides dapat dibiarkan didalam bath buffer selama 1 jam, pada suhu ruangan. Langkah 3 : Labeled Polymer -HRP • Bersihkan preparat dari sisa cairan buffer seperti di atas. Lidya Imelda Laksmi : Tampilan Imunositokimia Her2Neu Pada Biopsi Aspirasi Metastasis Karsinoma Nasofaring Kelenjar Limfe, 2009 • Teteskan labelled polymer secukupnya sampai menutupi sediaan hapus • Inkubasi selama 30 menit. • Bilas dengan lembut pada larutan buffer dan tempatkan dalam bath buffer selama 5 menit. Langkah 4 : Substrat-kromogen • Lap kering slide preparatnya seperti biasa. • Teteskan substrat-kromogen secukupnya dan inkubasi selama 5-10 menit. • Bilas lembut dengan air distilasi. Langkah 5 : Counterstain hematoxylin • Masukkan slide ke dalam cairan Meyer hematoksilin dan inkubasi seperti biasa. • Bilas dalam bath air distilasi. • Celupkan slide 10 kali dalam larutan amonia 0,037 molL atau bluing agent lainnya. • Bilas slide dalam bath air distilasi atau deionisasi selama 2-5 menit. • Tutup dengan entelan • Lihat dibawah mikroskop tampilan imunositokimia HER-2neu

3.8. Alat dan Bahan Penelitian Imunositokimia

Lidya Imelda Laksmi : Tampilan Imunositokimia Her2Neu Pada Biopsi Aspirasi Metastasis Karsinoma Nasofaring Kelenjar Limfe, 2009

3.8.1. Alat-alat Penelitian

Alat-alat yang diperlukan untuk penelitian ini adalah pistolet Comeco, spuit disposible 10 ml ukuran jarum 22-23 G, panjang 30-50 mm, kapas alkohol, inkubator, staining jar, rak kaca objek, rak inkubasi, pensil diamond, pipet mikro, kertas saring, stop watch, gelas Erlenmeyer, gelas beker, tabung sentrifuge 15 ml, microwave, spin master, thermolyte stirrer, selenise slide, deck glass, entelan dan mikroskop cahaya.

3.7.5.2. Bahan-bahan untuk pemeriksaan imunositokimia

Penelitian ini menggunakan EnVision+ Dual Link system-HRP DAB+ dari DakoCytomation, terdiri dari: • 1 x 15 mL : Dual Endogenous Enzyme Block • 1 x 15 mL : Labelled Polymer-HRP • 1 x 18 mL : DAB+ Substrate Buffer • 1 x 1 mL : DAB+ Chromogen Larutan substrat chromogen: Protokol pembuatan 1 mL DAB + substrat chromogen cukup untuk 10 spesimen jaringan atau 5 sediaan smear. Langkah 1: Bergantung berapa banyak jumlah slide yang akan diwarnai, masukkan 1 ml substrat buffer ke dalam ali quot. Langkah 2: Untuk setiap 1 ml buffer, tambahkan setetes 20 L DAB cair + kromogen. Campur segera. Lidya Imelda Laksmi : Tampilan Imunositokimia Her2Neu Pada Biopsi Aspirasi Metastasis Karsinoma Nasofaring Kelenjar Limfe, 2009 Larutan DAB+ substrat kromogen akan stabil kira-kira 5 hari bila disimpan dalam suhu 2-8°C. Larutan ini hanya dicampur sesaat sebelum akan digunakan. Prosedur tetap pembuatan phosphate buffer formalin PBS 1. NaCl ditimbang 87,5 gram 2. KH2PO4 ditimbang 1,92 gram 3. Cara kerja : Na2HPO4 2H2O ditimbang 15,33 gram Larutan nomor 1 ditambah larutan nomor 2 ditambah aquadest 800 ml dicampur sampai larut dengan pengaduk. Kemudian ditambahkan larutan nomor 3 dicampur sampai larut, ditambahkan aquadest sampai 1 liter.

3.9. Instrumen Penelitian

Instrumen penelitian yang digunakan adalah hasil pulasan imunositokimia HER2neu terhadap sampel sediaan sitologi dari KGB. Penilaian terhadap pulasan imunositokimia HER2neu adalah sebagai berikut: • Kontrol positif : slide sitologi karsinoma payudara • Positif : warna coklat yang tertampil pada sitoplasma sel Perhitungan luas hasil pulasan imunositokimia HER2neu adalah sebagai berikut: • 0 : negatif, tidak dijumpai sitoplasma sel yang terpulas atau sangat tipis dan ≤ 10 sel-sel tumor • +1 : ≤ 10 sel yang terpulas fokal atau hanya setempat dari Lidya Imelda Laksmi : Tampilan Imunositokimia Her2Neu Pada Biopsi Aspirasi Metastasis Karsinoma Nasofaring Kelenjar Limfe, 2009 membran sitoplasma • +2 : tampilan lemah atau moderate komplit pada membran sitoplasma pada ≥ 10 sel-sel tumor • +3 : tampilan kuat dan komplit pada membran sitoplasma ≥ 10 sel-sel tumor Tabel 3.1. Luas tampilan imunositokimia HER2neu pada metastase KNF ke KGB Diagnosa sitologi metastasis KNF ke KGB leher, jenis; Luas Tampilan Imunositokimia HER2neu Undifferentiated ca Squamous cell ca Jumlah +1 +2 +3 Jumlah Keterangan: Tampilan imunositokimia HER2neu: ̇ 0 = negatif ̇ +1 = lemah 10 sel yang positif ̇ +2 = sedang 10-49 sel yang positif ̇ +3 = kuat ≥ 50 sel yang positif

3.10. Teknik Analisa Data