Isolasi, Penapisan, Respon Tumbuh Dan Proses Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar

ISOLASI, PENAPISAN, RESPON TUMBUH DAN PROSES

KOLONISASI CENDAWAN MUTUALISTIK AKAR

RIDA OKTORIDA KHASTINI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2007

@ Hak Cipta milik IPB Tahun 2007 Hak cipta dilindungi Undang-Undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan masalah

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

SURAT PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Rida Oktorida Khastini NIM : G351040151

Program Studi : Biologi (BIO)

dengan ini menyatakan bahwa tesis dengan judul ”Isolasi, Penapisan, Respon Tumbuh dan Proses Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar” adalah benar-benar merupakan hasil penelitian yang saya lakukan di bawah bimbingan Komisi Pembimbing saya, dan belum pernah diteliti oleh peneliti lain. Penelitian tersebut dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), IPB dan di Laboratorium Bagian Mikologi, IPB dan Rumah Kaca Pusat Penelitian Kehutanan sejak Februari 2006 sampai dengan Agustus 2007.

Bogor, Oktober 2007

Rida Oktorida Khastini

ISOLASI, PENAPISAN, RESPON TUMBUH DAN PROSES

KOLONISASI CENDAWAN MUTUALISTIK AKAR

RIDA OKTORIDA KHASTINI

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Depertemen Biologi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2007

Judul Tesis : Isolasi, Penapisan, Respon Tumbuh dan Proses Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar

Nama : Rida Oktorida Khastini NIM : G351040151

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Nampiah Sukarno Ketua

Dr. Ir. Utut Widyastuti Suharsono M.S Prof. Dr. Yasuyuki Hashidoko

Anggota Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Dedy Duryadi S., DEA Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro MS Tanggal Lulus : Tanggal Ujian: 5 Oktober 2007

PRAKATA

Alhamdulillah, segala puji bagi Allah SWT, yang senantiasa melimpahkan segala karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.

Tesis yang berjudul Isolasi, Penapisan, Respon Tumbuh dan Proses Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar merupakan hasil penelitian yang dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), IPB dan di Laboratorium Bagian Mikologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB dan Rumah Kaca Pusat Penelitian Kehutanan sejak Februari 2006 sampai dengan Agustus 2007.

Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu penyelesaian karya ilmiah ini, antara lain Dr. Nampiah Sukarno, Dr. Utut Widyastuti Suharsono, dan Prof. Dr. Yasuyuki Hashidoko selaku komisi pembimbing serta Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono selaku penguji yang telah memberikan bimbingan, saran, dan perhatian, yang sangat berarti selama penelitian hingga tersusunnya tesis ini. Tak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Dr. Ane Sesma dan Dr. Anne Osbourne dari John Innes Center, Inggris atas plasmid pCambGFP yang diberikan, serta SEAMEO BIOTROP atas sebagian dana penelitian. Penghargaan juga diberikan pada Staf Pusat Penelitian Sumbar Daya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), IPB dan di Laboratorium Bagian Mikologi, IPB dan Rumah Kaca Pusat Penelitian Kehutanan yang telah banyak membantu dalam melaksanakan penelitian dan penyusunan tesis.

Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada Mama, Bapa, Iyu dan Ubhie yang senantiasa memberikan dukungan, kasih sayang dan doa yang tak ternilai. Kepada Ibu Dra. Sri Listyowati M.Si, Ibu Rita Tri Puspitasari M.Si, dan Ibu Dr. Happy Widyastuti, Mba Pepi, Pa Mulya, Pa Edi, Mba Retno, Kanthie, Awie, Riza, Venti dan teman-teman yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu, penulis ucapkan terimakasih atas kebersamaan dan bantuannya.

Semoga tesis ini bermanfaat.

Bogor, Oktober 2007

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Majalengka pada tanggal 28 Oktober 1981 dari ayah Khasmuin dan ibu Tatin Sustiatin, S. Pd. Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara.

Pada tahun 1999 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Cilegon dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui Undangan Seleksi Masuk IPB untuk program sarjana. Penulis memasuki Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam pada tahun yang sama. Setelah lulus sarjana pada tahun 2004, penulis langsung melanjutkan pendidikan ke Sekolah pascasarjana IPB, pada Program Studi Biologi.

Semasa perkuliahan di tingkat sarjana, Penulis pernah aktif di organisasi kemahasiswaan sebagai anggota Himpunan Mahasiswa Biologi 2000/2001, anggota Organisasi Kewirausahaan Mahasiswa Biologi (BIOWORLD) 2001/2002. Pada tahun ajaran 2001/2002 sampai dengan tahun ajaran 2002/2003, penulis menjadi asisten mata kuliah Biologi pada Tingkat Persiapan Bersama dan Taksonomi Tumbuhan Berpembuluh. Pada tahun ajaran 2002/2003 penulis juga menjadi asisten mata kuliah Biologi, Biologi Cendawan Simbion dan Mikologi Dasar. Semasa perkuliahan di tingkat pasca sarjana, penulis juga aktif sebagai asisten mata kuliah Biologi Cendawan Simbion dan Mikologi Dasar dan mengikuti berbagai seminar dan training di bidang Biologi, Mikologi dan Molekuler di luar lingkungan IPB.

ABSTRAK

RIDA OKTORIDA KHASTINI. Isolasi, Penapisan, Respon Tumbuh dan Proses Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar. Dibimbing oleh Nampiah Sukarno, Utut Widyastuti, dan Yasuyuki Hashidoko.

Tujuan penelitian ini ialah untuk mengisolasi, menapis dan menganalisis cendawan mutualistik akar potensial untuk pengembangan pupuk hayati. Analsis proses kolonisasi cendawan pada akar tanaman inang juga dilakukan dengan menggunakan metode pewarnaan biru tripan dan gen penanda GFP. Sebanyak 22 isolat cendawan berhasil diisolasi dari rizoplan kebun karet dari Jasinga serta rizosfer dan rizoplan tanaman gambut dari Kalimantan Tengah. Hasil penapisan terhadap sifat simbiosis menunjukkan bahwa ke-22 isolat tersebut terdiri dari 12 isolat cendawan simbiosis mutualistik akar non mikoriza, 3 isolat cendawan simbiosis mutualistik akar mikoriza, dan 7 isolat cendawan simbiosis parasitik akar. Cendawan Aspergillus niger dan Glomus sp. yang diisolasi dari rizoplan tanaman karet menghasilkan pertumbuhan tanaman inang terbaik. Oleh karena itu kedua isolat tersebut dipilih sebagai isolat simbiosis mutualisme terbaik dan digunakan untuk uji lebih lanjut. Isolat cendawan mutualistik akar terpilih diuji respon tumbuh dan kolonisasinya pada berbagai tanaman inang yaitu Oryza sativa, Zea mays, Pharaserianthes falcataria, Acasia sp., Theobroma cacao, Phaleria macrocarpa dan Brassica sp. Hasil pengujian menunjukkan bahwa inokulasi tunggal cendawan A. niger dan Glomus sp. meningkatkan pertumbuhan seluruh tanaman yang diuji jika dibandingkan dengan kontrol. Tanaman yang diinokulasi A. niger meningkatkan pertumbuhan 3 kali lebih tinggi sedangkan inokulasi Glomus sp. meningkatkan pertumbuhan tanaman 2 kali lebih tinggi dibandingkan kontrol. Kolonisasi cendawan A. niger pada tanaman uji berkisar antara 53-75% sedangkan Glomus sp. berkisar antara 25-70%. Pengaruh berbagai taraf P terhadap peranan A. niger dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman diuji menggunakan 8 jenis tanaman tersebut diatas. Pupuk yang digunakan ialah pupuk Johnson dengan konsentrasi P sebesar 25%, 50%, dan 100% pada medium zeolit. Uji lanjut dari kedua cendawan dilakukan dengan inokulasi ganda pada tanaman Centrosema pubescens. Hasil analisis menunjukkan bahwa inokulasi A. niger pada berbagai taraf P meningkatkan respon tumbuh seluruh tanaman secara signifikan dengan respon tertinggi diperoleh pada perlakuan P sebesar 50%. Respon tumbuh tanaman pada perlakuan P sebesar 100% masih menunjukkan respon yang lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan kontrol namun lebih rendah dibandingkan dengan perlakuan P 50%. Introduksi gen GFP pada genom A. niger telah berhasil dilakukan. Berdasarkan analisis PCR dan mikroskop fluoresen dengan filter 512 nm, gen GFP telah terintegrasi pada genom cendawan, bersifat stabil dan terekspresi secara konstitutif pada 3 generasi kultur yang diuji. Analisis proses kolonisasi A. niger yang diamati dengan menggunakan metode pewarnaan dan gen penanda GFP menunjukkan bahwa proses kolonisasi dimulai dengan proses penetrasi hifa ke dalam jaringan epidermis akar, kemudian terbentuk apresorium yang dilanjutkan dengan pembentukan hifa interseluler pada epidermis dan korteks akar serta pembentukkan struktur pembengkakan hifa pada korteks akar. Pada kolonisasi A. niger tidak ditemukan struktur arbuskula seperti pada kolonisasi cendawan mikoriza. Pengamatan analisis kolonisasi menggunakan

mikroskop fluoresen dengan filter 512 nm menghasilkan auto fluoresen pada beberapa jaringan akar namun struktur kolonisasi cendawan A. niger-GFP pada akar tanaman masih dapat teramati dan dapat dibedakan dari jaringan akar.

Kata kunci: cendawan mutualistik akar, cendawan mutualistik non mikoriza, cendawan mikoriza arbuskula, A. niger, Glomus sp., gen GFP

ISOLASI, PENAPISAN, RESPON TUMBUH DAN PROSES

KOLONISASI CENDAWAN MUTUALISTIK AKAR

RIDA OKTORIDA KHASTINI

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2007

@ Hak Cipta milik IPB Tahun 2007 Hak cipta dilindungi Undang-Undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber

a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan masalah

b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB

2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa izin IPB

SURAT PERNYATAAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini :

Nama : Rida Oktorida Khastini NIM : G351040151

Program Studi : Biologi (BIO)

dengan ini menyatakan bahwa tesis dengan judul ”Isolasi, Penapisan, Respon Tumbuh dan Proses Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar” adalah benar-benar merupakan hasil penelitian yang saya lakukan di bawah bimbingan Komisi Pembimbing saya, dan belum pernah diteliti oleh peneliti lain. Penelitian tersebut dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), IPB dan di Laboratorium Bagian Mikologi, IPB dan Rumah Kaca Pusat Penelitian Kehutanan sejak Februari 2006 sampai dengan Agustus 2007.

Bogor, Oktober 2007

Rida Oktorida Khastini

ISOLASI, PENAPISAN, RESPON TUMBUH DAN PROSES

KOLONISASI CENDAWAN MUTUALISTIK AKAR

RIDA OKTORIDA KHASTINI

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Depertemen Biologi

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2007

Judul Tesis : Isolasi, Penapisan, Respon Tumbuh dan Proses Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar

Nama : Rida Oktorida Khastini NIM : G351040151

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Nampiah Sukarno Ketua

Dr. Ir. Utut Widyastuti Suharsono M.S Prof. Dr. Yasuyuki Hashidoko

Anggota Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Biologi Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Dedy Duryadi S., DEA Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro MS Tanggal Lulus : Tanggal Ujian: 5 Oktober 2007

PRAKATA

Alhamdulillah, segala puji bagi Allah SWT, yang senantiasa melimpahkan segala karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan.

Tesis yang berjudul Isolasi, Penapisan, Respon Tumbuh dan Proses Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar merupakan hasil penelitian yang dilakukan di Laboratorium Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), IPB dan di Laboratorium Bagian Mikologi, Departemen Biologi, FMIPA, IPB dan Rumah Kaca Pusat Penelitian Kehutanan sejak Februari 2006 sampai dengan Agustus 2007.

Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu penyelesaian karya ilmiah ini, antara lain Dr. Nampiah Sukarno, Dr. Utut Widyastuti Suharsono, dan Prof. Dr. Yasuyuki Hashidoko selaku komisi pembimbing serta Dr. Ir. Aris Tjahjoleksono selaku penguji yang telah memberikan bimbingan, saran, dan perhatian, yang sangat berarti selama penelitian hingga tersusunnya tesis ini. Tak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada Dr. Ane Sesma dan Dr. Anne Osbourne dari John Innes Center, Inggris atas plasmid pCambGFP yang diberikan, serta SEAMEO BIOTROP atas sebagian dana penelitian. Penghargaan juga diberikan pada Staf Pusat Penelitian Sumbar Daya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB), IPB dan di Laboratorium Bagian Mikologi, IPB dan Rumah Kaca Pusat Penelitian Kehutanan yang telah banyak membantu dalam melaksanakan penelitian dan penyusunan tesis.

Ungkapan terimakasih juga disampaikan kepada Mama, Bapa, Iyu dan Ubhie yang senantiasa memberikan dukungan, kasih sayang dan doa yang tak ternilai. Kepada Ibu Dra. Sri Listyowati M.Si, Ibu Rita Tri Puspitasari M.Si, dan Ibu Dr. Happy Widyastuti, Mba Pepi, Pa Mulya, Pa Edi, Mba Retno, Kanthie, Awie, Riza, Venti dan teman-teman yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu, penulis ucapkan terimakasih atas kebersamaan dan bantuannya.

Semoga tesis ini bermanfaat.

Bogor, Oktober 2007

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Majalengka pada tanggal 28 Oktober 1981 dari ayah Khasmuin dan ibu Tatin Sustiatin, S. Pd. Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara.

Pada tahun 1999 penulis lulus dari SMU Negeri 1 Cilegon dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk IPB melalui Undangan Seleksi Masuk IPB untuk program sarjana. Penulis memasuki Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam pada tahun yang sama. Setelah lulus sarjana pada tahun 2004, penulis langsung melanjutkan pendidikan ke Sekolah pascasarjana IPB, pada Program Studi Biologi.

Semasa perkuliahan di tingkat sarjana, Penulis pernah aktif di organisasi kemahasiswaan sebagai anggota Himpunan Mahasiswa Biologi 2000/2001, anggota Organisasi Kewirausahaan Mahasiswa Biologi (BIOWORLD) 2001/2002. Pada tahun ajaran 2001/2002 sampai dengan tahun ajaran 2002/2003, penulis menjadi asisten mata kuliah Biologi pada Tingkat Persiapan Bersama dan Taksonomi Tumbuhan Berpembuluh. Pada tahun ajaran 2002/2003 penulis juga menjadi asisten mata kuliah Biologi, Biologi Cendawan Simbion dan Mikologi Dasar. Semasa perkuliahan di tingkat pasca sarjana, penulis juga aktif sebagai asisten mata kuliah Biologi Cendawan Simbion dan Mikologi Dasar dan mengikuti berbagai seminar dan training di bidang Biologi, Mikologi dan Molekuler di luar lingkungan IPB.

ABSTRAK

RIDA OKTORIDA KHASTINI. Isolasi, Penapisan, Respon Tumbuh dan Proses Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar. Dibimbing oleh Nampiah Sukarno, Utut Widyastuti, dan Yasuyuki Hashidoko.

Tujuan penelitian ini ialah untuk mengisolasi, menapis dan menganalisis cendawan mutualistik akar potensial untuk pengembangan pupuk hayati. Analsis proses kolonisasi cendawan pada akar tanaman inang juga dilakukan dengan menggunakan metode pewarnaan biru tripan dan gen penanda GFP. Sebanyak 22 isolat cendawan berhasil diisolasi dari rizoplan kebun karet dari Jasinga serta rizosfer dan rizoplan tanaman gambut dari Kalimantan Tengah. Hasil penapisan terhadap sifat simbiosis menunjukkan bahwa ke-22 isolat tersebut terdiri dari 12 isolat cendawan simbiosis mutualistik akar non mikoriza, 3 isolat cendawan simbiosis mutualistik akar mikoriza, dan 7 isolat cendawan simbiosis parasitik akar. Cendawan Aspergillus niger dan Glomus sp. yang diisolasi dari rizoplan tanaman karet menghasilkan pertumbuhan tanaman inang terbaik. Oleh karena itu kedua isolat tersebut dipilih sebagai isolat simbiosis mutualisme terbaik dan digunakan untuk uji lebih lanjut. Isolat cendawan mutualistik akar terpilih diuji respon tumbuh dan kolonisasinya pada berbagai tanaman inang yaitu Oryza sativa, Zea mays, Pharaserianthes falcataria, Acasia sp., Theobroma cacao, Phaleria macrocarpa dan Brassica sp. Hasil pengujian menunjukkan bahwa inokulasi tunggal cendawan A. niger dan Glomus sp. meningkatkan pertumbuhan seluruh tanaman yang diuji jika dibandingkan dengan kontrol. Tanaman yang diinokulasi A. niger meningkatkan pertumbuhan 3 kali lebih tinggi sedangkan inokulasi Glomus sp. meningkatkan pertumbuhan tanaman 2 kali lebih tinggi dibandingkan kontrol. Kolonisasi cendawan A. niger pada tanaman uji berkisar antara 53-75% sedangkan Glomus sp. berkisar antara 25-70%. Pengaruh berbagai taraf P terhadap peranan A. niger dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman diuji menggunakan 8 jenis tanaman tersebut diatas. Pupuk yang digunakan ialah pupuk Johnson dengan konsentrasi P sebesar 25%, 50%, dan 100% pada medium zeolit. Uji lanjut dari kedua cendawan dilakukan dengan inokulasi ganda pada tanaman Centrosema pubescens. Hasil analisis menunjukkan bahwa inokulasi A. niger pada berbagai taraf P meningkatkan respon tumbuh seluruh tanaman secara signifikan dengan respon tertinggi diperoleh pada perlakuan P sebesar 50%. Respon tumbuh tanaman pada perlakuan P sebesar 100% masih menunjukkan respon yang lebih tinggi dibandingkan dengan perlakuan kontrol namun lebih rendah dibandingkan dengan perlakuan P 50%. Introduksi gen GFP pada genom A. niger telah berhasil dilakukan. Berdasarkan analisis PCR dan mikroskop fluoresen dengan filter 512 nm, gen GFP telah terintegrasi pada genom cendawan, bersifat stabil dan terekspresi secara konstitutif pada 3 generasi kultur yang diuji. Analisis proses kolonisasi A. niger yang diamati dengan menggunakan metode pewarnaan dan gen penanda GFP menunjukkan bahwa proses kolonisasi dimulai dengan proses penetrasi hifa ke dalam jaringan epidermis akar, kemudian terbentuk apresorium yang dilanjutkan dengan pembentukan hifa interseluler pada epidermis dan korteks akar serta pembentukkan struktur pembengkakan hifa pada korteks akar. Pada kolonisasi A. niger tidak ditemukan struktur arbuskula seperti pada kolonisasi cendawan mikoriza. Pengamatan analisis kolonisasi menggunakan

mikroskop fluoresen dengan filter 512 nm menghasilkan auto fluoresen pada beberapa jaringan akar namun struktur kolonisasi cendawan A. niger-GFP pada akar tanaman masih dapat teramati dan dapat dibedakan dari jaringan akar.

Kata kunci: cendawan mutualistik akar, cendawan mutualistik non mikoriza, cendawan mikoriza arbuskula, A. niger, Glomus sp., gen GFP

ABSTRACT

RIDA OKTORIDA KHASTINI. Isolation, Screening, Growth Responses and Colonization Process of Root Mutualistic Fungi. Supervised by Nampiah Sukarno, Utut Widyastuti and Yasuyuki Hashidoko.

The aim of this study was to isolate, screen and analyze the potential root mutualistic fungi for developing a good quality of biofertilizer. The fungal colonization process in the root of host plant was also studied using trypan blue staining and GFP marker gene. Twenty two isolates were successfully isolated from root system of rubber tree grown in Jasinga rubber plantation and vegetation grown in Center Kalimantan peat soil. Those isolates were screened based on growth responses and root colonization to determine the fungal symbiotic ability. The results showed that twelve isolates were mutualistic symbionts but non-mycorrhiza (non-non-mycorrhizal mutualistic symbionts), three isolates were mycorrhizal fungi, and seven isolates were parasitic fungi. Among twelve isolates of non-mycorrhizal mutualistic fungi, Aspergillus niger that isolated from rubber plantation was the best isolate to improve plant growth. Similarly, Glomus sp. isolated from the same location showed the best growth responses among the three mycorrhizal fungal isolates. The two fungi, therefore, were selected, compared and analyzed further using Oryza sativa, Zea mays, Pharaserianthes falcataria, Acasia sp., Theobroma cacao, Phaleria macrocarpa and Brassica sp. to determine the growth response of the host plant and fungal colonization. The results showed that A. niger colonized root of host plant ranging from 53% to 75%, while Glomus sp. was ranging from 25% to 70% and there was no colonization observed of non-inoculated control plant. A. niger produced a better plant growth responses 2 and 3 times higher than that of Glomus sp. and control treatments, respectively, for all plants tested. The plant growth response of Glomus sp. inoculation was increased 2 times higher than the control treatment. The double inoculation effect of A. niger and Glomus sp. on plant growth responses was studied using Centrosema pubescens. The result showed that the combination treatment of A. niger and Glomus sp. increased plant growth of Centrosema pubescens. The increase was higher than that of Glomus sp. and control treatments, but lower than that of A. niger treatment alone. Further analyzes of A. niger onthree different P levels of Johnson fertilizer solution (25%, 50%, and 100%) using eight different host plants on zeolite medium indicated that the A. niger significantly increased the growth of all plants at all levels of P tested with the best response was observed at 50% additional P treatment. The inoculation of A. niger could save the P fertilizer application since the addition of P 25% already produced better growth response compared to that of P 100% without A. niger inoculation. Integration of GFP gene into A. niger genome was carried out for developing a marker gene to observe the colonization process of the fungus in the life symbiotic system. Based on PCR and fluorescence microscope observation using 512 nm filter, indicated that the GFP gene was successfully integrated into fungal genome, expressed constitutively and was stable at least until three subculture generations tested. Based on trypan blue staining analysis, it showed that colonization process of A. niger was started from

development of penetration structure, followed by development of apresorium in root epidermis, and intercellular mycelium and chlamydospore like structure in the root cortex. Similar colonization process was also observed using GFP marker gene. The root plant also produce auto fluorescence under 515 nm wavelength filter that made the complication in the observation of fungal colonization process using GFP gene, but the fungal structure within the root was still able to be discriminated from that of root cells.

Key word: root mutualistic fungi, non mycorrhizal mutualistic fungi, arbuscular mycorrhizal fungi, Aspergillus niger, Glomus sp., GFP gene

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ... xi DAFTAR GAMBAR ... xii DAFTAR LAMPIRAN... xiii PENDAHULUAN ... 1 Latar Belakang ... 1 Tujuan Penelitian ... 3 Hipotesis ... 3 TINJAUAN PUSTAKA ... 4 A. Cendawan Mutualistik Akar ... 4 A.1 Cendawan Mikoriza Arbuskula (CMA) ... 4 A.2 Cendawan mutualistik akar non mikoriza... 6 B. Analisis proses kolonisasi dan peningkatan pertumbuhan oleh

endofit akar ... 7 B.1 Pewarnaan cendawan pada akar... 7 B.2 Gen Penanda Khusus ... 8 BAHAN DAN METODE ... 10 Waktu dan Tempat Penelitian ... 10 Bahan ... 10 Metode Penelitian ... 10 A. Isolasi dan penapisan cendawan mutualistik akar... 12 A.1. Cendawan mutualistik akar non mikoriza ... 12 A.2. Cendawan mikoriza arbuskula (CMA) ... 13 B. Analisis respon tumbuh tanaman inang yang diinokulasi cendawan

mutualistik akar ... 13 C. Analisis proses kolonisasi cendawan mutualistik akar non mikoriza .. 15 C.1. Metode pewarnaan biru tripan ... 15 C.2. Penggunaan gen penanda GFP (Green Fluorescent Protein) .... 15 C.2.1 Produksi Speroplas Cendawan (Hasiba 1992) ... 16 C.2.2 Introduksi Gen Fluoresen Hijau (GFP) pada cendawan

mutualistik akar Aspergilus niger... 16 C.2.2.1 Isolasi plasmid pCamb-GFP... 16 C.2.2.2 Introduksi gen GFP... 18 C.2.3 Uji integrasi dan stabilitas gen GFP di dalam genom

cendawan ... 18 C.2.3.1 Isolasi DNA Genom Cendawan ... 19 C.2.3.2 Amplifikasi DNA Cendawan Aspergillus-GFP... 20

Hasil Pengamatan ... 21 A. Isolasi dan penapisan cendawan mutualistik akar... 21 B. Analisis respon tumbuh tanaman inang yang diinokulasi cendawan

mutualistik akar ... 23 B.1 Pengaruh isolat terpilih cendawan mutualistik akar terhadap

pertumbuhan berbagai tanaman inang... 23 B.1.1 Uji spesifisititas respon tumbuh dan kolonisasi ... 23 B.1.2 Pengaruh inokulasi ganda A. niger 1 dan Glomus sp.1 ... 25 B.2 Pengaruh cendawan mutualistik akar non mikoriza terhadap

penyerapan fosfat (P) tanaman inang ... 26 C. Analisis proses kolonisasi cendawan mutualistik akar non mikoriza... 27 C.1 Metode pewarnaan biru tripan ... 27 C.2. Penggunaan gen penanda GFP (Green Fluorescent Protein)... 28 Pembahasan... 33 A. Isolasi dan penapisan cendawan mutualistik akar... 33 B. Analisis respon tumbuh tanaman inang yang diinokulasi cendawan

mutualistik akar ... 36 C. Analisis proses kolonisasi cendawan mutualistik akar... 38 C.1 Metode pewarnaan biru tripan... 38 C.2. Penggunaan gen penanda GFP (Green Fluorescent Protein)... 39

SIMPULAN DAN SARAN ... 42 DAFTAR PUSTAKA ... 42 LAMPIRAN... 43

DAFTAR TABEL

Halaman

1 Cendawan yang berhasil diisolasi dari rizosfir dan rizoplan tanaman karet dan tumbuhan pada tanah gambut. ... 21

2 Penapisan isolat-isolat cendawan pada tanaman Centrosema

pubescens ... 22 3 Respon tumbuh berbagai tanaman inang yang diinokulasi cendawan

mutualistik akar pada P 50%... 23 3 Pengaruh perlakuan P terhadap pertumbuhan berbagai tanaman

inang yang diinokulasi A. niger 1 ... 26

DAFTAR GAMBAR

Halaman

1 Struktur taksonomi secara umum pada CMA dan kaitannya dengan cendawan lain berdasarkan urutan gen SSU rRNA (Walker & Schüßler 2004) ... 4 2 Bagan alur penelitian ... 11 3 Peta plasmid pCamb-GFP (Sesma & Osbourne 2004) ... 16 4 Gambar 4 Parameter respon tumbuh berbagai tanaman

inang yang diinokulasi cendawan mutualistik akar pada P 50% ... 24 5 Struktur kolonisasi Glomus sp. 1 pada akar Brassica sp. pada

perbesaran 10 x. a. apresorium, b. hifa internal ... 27 6 Pengaruh inokulasi ganda cendawan mutualistik akar mikoriza dan

non mikoriza pada Centrosema pubescen umur 3 bulan pada taraf P 50%. ... ... 27 7 Struktur kolonisasi fungi A. niger 1 di dalam akar pada umur 6

minggu setelah inokulasi pebesaran 10x. a. apresorium, b. hifa internal, c. Struktur yang menyerupai klamidospora... 28 8 Jumlah speroplas yang dihasilkan dari miselia dan spora A. niger.... 29

9 Speroplas segar cendawan A. niger setelah pemurnian dengan sistem dua fase sukrosa dan manitol. a. perbesaran 10x, b. perbesaran 40x ... 29 10 Persentase perkecambahan protoplas ... 30 11 Gen GFP diekspresikan secara konstitutif di seluruh struktur

cendawan pada perbesaran 40x. a. struktur aseksual (kepala konidia), b. miselium... 31 12 Miselium cendawan transgenik pada berbagai subkultur (generasi).

(a) generasi T0, (b) generasi T1, dan (c) generasi T2. ... 31 13 Hasil amplifikasi gen ... 32 14 Struktur kolonisasi A. niger transgenik di dalam akar. a. hifa

interseluler, b. Struktur klamidospora... 33

DAFTAR LAMPIRAN

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Peningkatan produksi pertanian, perkebunan dan kehutanan dapat dilakukan melalui proses intensifikasi seperti penggunaan bibit unggul, proses pemupukan dan pemberantasan hama yang terpadu. Proses tersebut pada umumnya dilakukan di daerah yang wilayah pertaniannya semakin sempit akibat diubah menjadi areal pemukiman dan areal industri seperti pulau Jawa. Proses ekstensifikasi merupakan cara alternatif yang dapat dilakukan, namun terkendala oleh kondisi lahan di Indonesia yang umumnya bersifat marjinal. Jenis tanah ini mendominasi lahan kering yang ada di Sumatera, Kalimantan dan Irian Jaya dengan penyebarannya yaitu 10.04 juta ha di Kalimantan Timur; 7.62 juta ha di Irian Jaya; 5.71 juta ha di Kalimantan Barat; 4.81 juta ha di Kalimantan Tengah dan 2.27 juta ha di Riau (Puslitbang Tanah 1999). Kondisi lahan tersebut menyebabkan terhambatnya pertumbuhan tanaman. Hal ini disebabkan oleh kebutuhan unsur-unsur hara makro yang berada di dalam tanah dan dibutuhkan oleh tanaman berada dalam bentuk terfiksasi oleh liat atau unsur lain. Salah satu faktor pembatas pertumbuhan tanaman pada tanah marjinal ialah terbatasnya kemampuan serapan hara P oleh tanaman akibat rendahnya kandungan unsur tersebut di dalam tanah. Kondisi tersebut salah satunya dapat diatasi dengan pemberian pemupukan.

Proses pemupukan dapat dilakukan dengan menggunakan pupuk kimiawi dan pupuk biologis atau pupuk hayati. Penggunaan pupuk kimiawi selain mahal juga menimbulkan banyak pengaruh negatif bagi lingkungan sedangkan penggunaan pupuk hayati selain lebih murah juga ramah lingkungan. Saat ini penggunaan pupuk hayati baik di dalam maupun di luar negeri mulai banyak diminati dibandingkan dengan pupuk kimiawi. Penggunaan pupuk kimiawi pada awalnya disukai oleh petani karena efeknya yang cepat dan penanganannya yang relatif mudah. Namun, setelah beberapa waktu disadari bahwa pupuk kimiawi tersebut memiliki berbagai keterbatasan. Menurut Bayer (2002) sekitar 40-50% pupuk kimiawi yang diberikan pada tanaman yang tumbuh di lahan kering di daerah tropis tidak dimanfaatkan oleh tanaman karena hilang tercuci dari lahan tersebut. Bila kondisi lingkungan kurang mendukung seperti adanya musim

kemarau yang panjang maka efisiensi pemupukan tersebut akan lebih rendah lagi. Akibat dampak yang ditimbulkan tersebut maka petani mulai menggunakan pupuk hayati.

Latar belakang penggunaan pupuk hayati di Indonesia diantaranya disebabkan oleh tumbuhnya kesadaran masyarakat terhadap potensi pencemaran lingkungan melalui penggunaan pupuk kimiawi yang berlebihan. Harga pupuk kimiawi melambung tinggi akibat adanya krisis ekonomi yang terjadi pada tahun 1997 dan dicabutnya subsidi pupuk oleh pemerintah pada tahun 1998. Selain itu adanya program pemerintah yaitu Go Organik pada tahun 2010 turut meningkatkan minat masyarakat untuk menggunakan pupuk hayati.

Mikroorganisme termasuk cendawan mempunyai potensi yang dapat dikembangkan sebagai pupuk hayati. Cendawan yang dapat digunakan sebagai pupuk hayati diantaranya ialah cendawan mutualistik akar. Cendawan mutualistik akar terdiri dari cendawan mikoriza dan non mikoriza. Cendawan yang termasuk ke dalam simbion mutualistik akar non mikoriza diantaranya ialah Aspergillus dan Piriformospora indica (Varma et al. 1999). Sebagai pupuk hayati, cendawan mutualistik akar non mikoriza mempunyai banyak keunggulan dibandingkan dengan cendawan mikoriza. Cendawan tersebut umumnya tumbuh lebih cepat, dapat diperbanyak dalam media buatan, mengkolonisasi hampir semua jenis tumbuhan dan dapat mengkolonisasi hampir semua jenis tumbuhan termasuk tumbuhan bukan inang mikoriza (non host) (Sukarno N dan Suharsono UW, data tidak dipublikasikan). Walaupun cendawan mutualistik non mikoriza mempunyai banyak keunggulan dibandingkan dengan cendawan mikoriza, namun penelitian terhadap cendawan mutualistik non mikoriza yang berhubungan dengan respon tumbuh tanaman inang relatif baru dilakukan. Selain itu, proses kolonisasi cendawan tersebut juga belum banyak dipelajari (Varma et al. 1999).

Proses kolonisasi cendawan pada akar tanaman inang dapat dipelajari dengan menggunakan 2 metode yaitu metode pewarnaan cendawan pada akar dan dengan menggunakan gen penanda khusus diantaranya GFP (Green Fluorescent Protein). Metode pewarnaan mempunyai banyak kelemahan diantaranya ialah tidak dapat digunakan untuk mendeteksi cendawan dalam simbiosis yang hidup sedangkan penggunaan gen GFP dapat digunakan untuk menganalisa cendawan

dan memonitor dinamika proses kolonisasi yang terjadi di dalam jaringan hidup karena gen ini dapat berpendar dan dapat diamati langsung tanpa memerlukan protein substrat ataupun kofaktor (Chalfie et al. 1994).

Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan menganalisis cendawan mutualistik akar potensial termasuk tahapan kolonisasi menggunakan pewarnaan akar dan gen GFP dan untuk pengembangan pupuk hayati yang handal.

Hipotesis

Hipotesis dalam penelitian ini yaitu cendawan mutualistik akar dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman inang dan gen GFP yang diintroduksikan ke dalam genom cendawan dapat digunakan untuk menganalisis proses kolonisasi.

TINJAUAN PUSTAKA

A. Cendawan Mutualistik Akar

Cendawan mutualistik akar merupakan mikroorganisme yang berpotensi untuk digunakan sebagai pupuk hayati. Cendawan ini terdiri dari 2 kelompok yaitu cendawan mikoriza dan cendawan non mikoriza. Cendawan mikoriza terdiri dari beberapa kelompok, diantaranya ialah cendawan mikoriza arbuskula (CMA) yang umumnya bersimbiosis dengan tanaman pertanian, perkebunan dan hutan tanaman industri (HTI)

A. 1 Cendawan Mikoriza Arbuskula (CMA)

Mayoritas tanaman dalam kondisi alamiah berasosiasi dengan cendawan mikoriza (Smith & Read 1997) dan cendawan mikoriza arbuskula merupakan cendawan mikoriza yang paling umum dijumpai karena berasosiasi dengan sebagian besar tumbuhan di dunia.

Menurut klasifikasi dari Morton & Benny (1990) cendawan mikoriza arbuskula (CMA) merupakan cendawan simbion obligat, mempunyai hifa aseptat, dan reproduksinya dilakukan secara aseksual. CMA digolongkan dalam filum Zygomycota kelas Zygomycetes dengan ordo Glomales. Walker & Schüβler (2004) menggolongkan CMA ke dalam filum baru yaitu Glomeromycota berdasarkan urutan gen SSU rRNA (Gambar 1).

Gambar 1 Struktur taksonomi secara umum pada CMA dan kaitannya dengan cendawan lain berdasarkan urutan gen SSU rRNA (Walker & Schüßler 2004).

Filum ini mempunyai Kelas Glomeromycetes dengan 4 ordo, yaitu Glomerales, Diversisporales, Archaeosporales, dan Paraglomerales. Ordo Glomeralesdengan famili Glomeraceae. Ordo Diversisporalesterdiri dari 4 famili, yaitu Gigasporaceae, Diversisporaceae, Acaulosporaceae dan Pacisporaceae. Ordo Archaeosporales terdiri dari 2 famili, yaitu Archaeosporaceae dan Geosiphonaceae. Ordo Paraglomerales mempunyai famili Paraglomeraceae (Walker & Schüßler 2004).

Keuntungan yang diperoleh tanaman dengan adanya simbiosis dengan CMA yaitu tanaman dapat dengan mudah memperoleh unsur hara seperti fosfat (P). Fosfat adalah salah satu unsur hara esensial yang diperlukan dalam jumlah relatif banyak oleh tumbuhan, tetapi ketersediaannya pada tanah-tanah tertentu terbatas, sehingga seringkali menjadi salah satu pembatas utama dalam peningkatan produktivitas tumbuhan. Smith et al. (2003) mengemukakan bahwa CMA dan simbiosisnya merupakan penyedia utama P yang diperlukan oleh tanaman. Kemampuan hifa eksternal CMA mengeksploitasi P tanah yang berlokasi di sekitar daerah deplesi P akar sehingga mengatasi keterbatasan difusi fosfat anorganik yang lambat dalam tanah. Adanya hifa eksternal yang berukuran lebih kecil (1/10) dibandingkan dengan akar tanaman lebih cocok untuk mengeksplorasi P dan air yang terdapat di dalam ruang pori mikro tanah yang tidak dapat dicapai oleh rambut akar, selain itu hifa juga dapat menyerap air. Orcutt & Nielsen (2000) mengemukakan bahwa CMA mampu mengubah lingkungan organik rhizosfer secara kimia melalui pelepasan asam organik, peningkatan aktivitas fosfatase dan peningkatan produksi fitohormon yang dapat mengubah fenotipe akar sehingga meningkatkan kapasitas penyerapan total hara seperti P.

Struktur infeksi CMA dimulai dari terbentuknya miselia aseptat dari propagul cendawan yang berupa spora, miselia dan akar terkolonisasi yang tumbuh di daerah rizosfer perakaran. Miselia selanjutnya melakukan kontak dengan permukaan akar dan melakukan penetrasi pada epidermis atau rambut akar dan membentuk struktur apresorium. Tahapan berikutnya ialah terbentuknya hifa inter dan intraseluler di daerah korteks akar.

Struktur khas yang dibentuk secara intraseluler ialah arbuskula dan vesikula. Arbuskula ialah percabangan dikotomus yang intensif dari hifa intraselular, dan

berperan dalam transfer nutrisi antara cendawan dan tumbuhan. Vesikula dibentuk secara intra dan interseluler. Struktur ini berfungsi sebagai cadangan makanan bagi cendawan. Hifa yang tumbuh di dalam akar disebut struktur intraradikal, sedangkan yang tumbuh di luar akar tanaman dan mengeksplorasi media tumbuh disebut struktur ekstraradikal. Struktur ekstraradikal terdiri dari miselia, spora, dan hifa pelengkap (auxiliary cell). Struktur ekstraradikal tumbuh menjauhi akar, mengeksplorasi rizosfer, dan melakukan penyerapan air dan nutrisi.

A.2 Cendawan Mutualistik Akar Non Mikoriza

Berbagai jenis cendawan termasuk cendawan endofit diketahui dapat berasosiasi dengan akar tanaman membentuk simbiosis mutualisme. Cendawan endofit ialah cendawan yang sebagian besar atau seluruh struktur hidupnya berada dalam jaringan tanaman, dan dalam asosiasinya tidak menimbulkan gejala patogen (Baldani et al. 1998, Petrini 1991, Wennstrom 1994, Wilson 1995). Cendawan endofit yang berasal dari dalam tanaman dan dapat meningkatkan pertumbuhan tanaman inang disebut sebagai cendawan mutualistik akar non mikoriza. Jenis cendawan ini berperan dalam kesuburan tumbuhan inangnya karena dapat berfungsi sebagai pupuk hayati, pengendali hayati hama dan penyakit, dan mendekomposisi bahan organik (Saeed et al. 2002, Zareen et al. 2001, Rubini et al. 2005).

Pengetahuan tentang cendawan mutualistik akar yang dapat meningkatkan pertumbuhan tumbuhan inang sampai saat ini sangat rendah dan sebagian besar penelitian terhadap cendawan yang mengkolonisasi akar dilakukan terhadap cendawan mikoriza (Varma et al. 1999).

Varma et al. (1999) melaporkan bahwa cendawan mutualistik akar Piriformospora indica dapat meningkatkan pertumbuhan berbagai tanaman inang. Mekanisme kolonisasi cendawan tersebut dimulai dengan terbentuknya struktur apresorium saat terjadi kontak dengan akar tumbuhan inang dilanjutkan dengan adanya kolonisasi interseluler di dalam korteks yang membentuk struktur percabangan dan koil atau struktur menyerupai klamidospora. Namun pada cendawan mutualistik akar non mikoriza tidak membentuk struktur arbuskula yang biasanya terbentuk pada mikoriza arbuskula yang berfungsi dalam transfer nutrisi. Hal ini yang membedakannya dengan cendawan mikoriza arbuskula.

Varma et al. (1999) dalam penelitiannya tidak mempelajari struktur simbiosis lebih lanjut yang terjadi diantara ke 2 simbion pada tingkat selular, sehingga ada atau tidaknya invaginasi plasma membran sel inang yang memungkinkan terjadinya transfer nutrisi seperti pada simbiosis mutualisme mikoriza arbuskula tidak dapat diketahui.

B. Analisis Proses Kolonisasi dan Peningkatan Pertumbuhan oleh Cendawan Endofit Akar

Pertumbuhan cendawan pada akar tanaman inang dapat dipelajari dengan menggunakan 2 metode yaitu metode pewarnaan cendawan pada akar dan menggunakan gen penanda khusus diantaranya GFP (Green Fluorescent Protein).

B.1 Pewarnaan Cendawan pada Akar

Metode pewarnaan akar merupakan metode yang memanfaatkan zat pewarna (staining) untuk mewarnai jaringan cendawan sehingga struktur cendawan pada akar tanaman dapat dikenali. Terdapat dua macam metode pewarnaan yaitu non vital staining dan vital staining.

Pada metode non vital staining, pewarna yang digunakan diantaranya ialah biru tripan dan chlorazol black E yang akan bereaksi dengan dinding sel cendawan baik yang hidup maupun yang mati, sehingga tidak dapat membedakan jaringan cendawan yang hidup dan yang mati. Selain itu metode ini tidak dapat digunakan untuk mengenali cendawan yang bersimbiosis dalam sistem yang hidup.

Metode vital staining dapat digunakan untuk mewarnai struktur cendawan yang hidup. Pewarna yang digunakan dapat berupa substrat bagi enzim hidrolisis (fluorescein diacetate) atau akseptor elektron yang akan berubah warna pada saat terjadinya reduksi (garam tetrazolium) atau substrat bagi reaksi lainnya (alkalin fosfatase) (Tisserant et al. 1993). Efektivitas pewarna tersebut bergantung pada penetrasinya ke dalam sel dan dipengaruhi oleh suberinasi dinding sel tanaman atau ketebalan dinding sel tanaman tersebut. Pada metode vital staining, kuantifikasi cendawan pada sistem simbiosis hidup juga tidak bisa dilakukan

sama halnya dengan metode non vital staining. Hal ini disebabkan pada metode tersebut, perlu adanya preparasi yang akan merusak sistem simbiosis tersebut.

B.2 Gen Penanda Khusus

Gen penanda seleksi seperti GFP telah banyak digunakan dalam berbagai penelitian pada sejumlah besar organisme baik pada prokariot maupun eukariot (Chalfie et al. 1994, Cubbit et al. 1995). Menurut Lorang et al. (2001) gen GFP dapat digunakan sebagai alat untuk menganalisa interaksi yang terjadi antara cendawan dan tanaman. Penggunaan gen penanda GFP pada cendawan telah banyak dilakukan, misalnya pada Candida albicans (Cormack et al. 1997) digunakan untuk membedakan protein yang berhubungan dengan sifat patogenisitas yang dihasilkan oleh tipe liar dan mutan pada sel inang. Gen GFP juga digunakan untuk mempelajari aliran sitoplasma yang berperan dalam pertumbuhan dan pertunasan pada khamir (Niedenthal et al. 1996). Pada cendawan penyebab penyakit blas pada padi, gen GFP digunakan sebagai gen penunjuk (reporter gene) untuk mempelajari virulensi dari cendawan tersebut (Xu et al. 2002). Gen GFP digunakan untuk mempelajari proses kolonisasi Aspergillus fumigatus sebagai cendawan patogen manusia (Langfelder et al. 2001), Ustilago maydis sebagai cendawan patogen pada tanaman jagung (Spelling 1996), Aspergillus flavus sebagai cendawan perusak biji-bijian dan penghasil aflatoksin yang disimpan di dalam gudang (Du et al. 1999). Gen GFP juga telah dipakai pada cendawan yang berpotensi dalam bidang industri seperti pada Aspergillus niger untuk memonitor sekresi enzim glukoamilase dan selulase (Gorgon et al. 2000), dan pada Penicillium griseoroseum untuk deteksi produksi enzim pektinolitik yang diperlukan industri tekstil dan makanan (Lopes et al. 2004).

Gen GFP ialah gen yang berasal dari ubur-ubur Aequorea victoria. GFP merupakan polipeptida dengan 238 asam amino, berukuran 27-kDa menyerap cahaya pada panjang gelombang maksimum 395 dan 475 nm serta memancarkan cahaya pada panjang gelombang maksimum 508 nm. Gen GFP tipe liar yang berasal dari A. victoria tidak efisien ditranslasikan pada genom cendawan, tanaman maupun hewan (Spelling 1996, Cormack 1997, Ferna´ndez-A´balos

dapat meningkatkan aktivitas fluoresen dan mengurangi photobleaching (Cubbit 1995, Crameri 1996, Siemering 1996).Beberapa jenis GFP mengalami modifikasi seperti sGFP yaitu dengan cara substitusi serin menjadi treonin pada asam amino ke-65 (S65T) dapat mengekspresikan protein dan dapat ditranslokasikan pada genom eukariot.

Beberapa keuntungan gen GFP sebagai penanda seleksi terutama pada sel hidup dibandingkan penanda lainnya ialah seperti β-glucoronidase (GUS), chloramphenicol acetyltransferase (CAT), β- galactosidase (LacZ) atau luciferase (LUC). Keuntungan tersebut meliputi stabilitas (sedikit atau tanpa adanya photobleching), tidak memerlukan kofaktor atau substrat untuk aktifitasnya, dapat berpendar dan dapat diamati langsung tanpa memerlukan protein substrat ataupun kofaktor (Chalfie etal. 1994).

Gen GFP dapat diintegrasikan ke dalam genom cendawan melalui beberapa cara yaitu elektroforasi, penggunaan lithium asetat dan pembentukan speroplas. Menurut Riach & Kinghorn (1996), keberhasilan transformasi gen pada cendawan ditentukan oleh beberapa faktor yaitu produksi speroplas dan regenerasinya, promotor dan vektor yang digunakan dalam proses tansformasi dan stabilitas integrasi gen tersebut.

Menurut Hashiba (1992) speroplas cendawan dapat diproduksi dengan mengggunakan enzim digesti. Tingkat efektifitas metode ini dipengaruhi oleh tingkat pertumbuhan cendawan, waktu inkubasi dan jenis enzim yang digunakan.

Plasmid merupakan molekul penting yang berperan pada teknologi molekular DNA rekombinan. Plasmid berperan sebagai vektor pembawa gen GFP yang akan dimasukkan ke dalam sel inang. Ekspresi gen GFP di dalam sel inang diatur oleh adanya promotor. Promotor yang cukup kuat telah dikembangkan dari fungi Aspergillus nidulans untuk ekspresi gen yang bertanggung jawab dalam produksi protein ekstraselular. Promotor yang telah berhasil dikembangkan diantaranya ialah alcA, tpiA, toxA dan A. niger glukoamilase (gla) (Cullen et al. 1991, Fowler et al. 1990, Sesma & Osbourne 2004, Smith et al. 1990). Promotor-promotor tersebut telah digunakan secara efektif dalam tujuan-tujuan industri dan studi genetika dari berbagai macam cendawan (Sun et al. 2002).

BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari 2006 sampai April 2007 di Laboratorium dan rumah kaca bagian Mikologi Gunung Gede, Departemen Biologi FMIPA IPB dan Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi (PPSHB) IPB.

Bahan

Bahan yang digunakan ialah sampel akar tanaman dan tanah yang berasal dari lahan gambut Kalimantan Tengah dan kebun karet Jasinga Bogor, Jawa Barat. Pengujian respon tumbuh tanaman inang oleh cendawan mutualistik akar menggunakan tanaman pertanian, kehutanan, perkebunan dan tanaman obat. Pupuk Johnson digunakan sebagai perlakuan berbagai taraf P. Pewarna biru tripan dan gen GFP digunakan untuk analisis tahapan kolonisasi dan plasmid pCamb-GFP digunakan sebagai vektor pembawa GFP.

Analisis molekular menggunakan primer spesifik sGFPf (5’-CGACGTAAACGGCCACAAGT-3’), sGFPr (5’-GTCCATGCCGTGAGTGATCC -3’), Nosf (5’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTGCG-3’), dan Nosr (5’-CGGGACTCTAATCATAAAAACC-3’), digunakan untuk mengidentifikasi keberadaan gen penyandi sGFP dan terminator Nos dari genom cendawan transgenik Aspergillus-GFP serta primer Ubqf (5’-CCAGGACAAGATGATGTGCC-3’) dan Ubqr(5’-AAGAAGCTGAAGCATCCAGC -3’) digunakan untuk mengamplifikasi gen penyandi ubiquitin sebagai kontrol internal.

Metode Penelitian

Secara garis besar penelitian ini dibagi menjadi 2 bagian (Gambar 2) yaitu : 1. Isolasi dan penapisan cendawan mutualistik akar mikoriza dan non

mikoriza hingga diperoleh isolat potensial untuk diuji pada berbagai tanaman inang.

2. Analisis proses kolonisasi cendawan mutualistik akar dengan menggunakan metode pewarna biru tripan dan gen penanda .

I

Gambut dan Kebun karet

Tanah Akar

Isolasi dan penapisan cendawan mutualistik akar mikoriza

Gambar 2 Bagan alur penelitian Analisis respon tumbuh

tanaman inang isolat

cendawan mutualistik akar isolat CMA

Transformasi

Cendawan mutualistik akar-GFP Speroplast

Proses kolonisasi

Analisis Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar Non Mikoriza GFP

Pewarna biru tripan

Penggunaan gen penanda GFP Pewarna biru tripan

Isolasi dan penapisan cendawan mutualistik akar non mikoriza

II

Uji stabilitas gen GFP pada cendawan

A. Isolasi dan Penapisan Cendawan Mutualistik Akar

Cendawan mutualistik akar non mikoriza diisolasi dari akar tanaman, sedangkan cendawan mikoriza diisolasi dari tanah rhizosfer yang berasal dari tanah gambut Kalimantan Tengah dan tanaman karet Jasinga, Bogor. Penapisan cendawan mutualistik akar dilakukan dengan menggunakan tanaman Centrosema pubescens sehingga diperoleh cendawan mutualistik akar mikoriza dan non mikoriza yang memberikan respon terbaik untuk dilakukan analisis selanjutnya.

A.1. Cendawan Mutualistik Akar Non Mikoriza

Isolasi cendawan mutualistik akar non mikoriza dilakukan dengan metode sebagai berikut: akar tanaman dicuci menggunakan air dan dipotong dengan ukuran panjang 1 cm. Akar kemudian disterilisasi permukaannya menggunakan alkohol 70% (v/v) selama 1 menit dan NaOCl 0.1% (v/v) selama 15 menit. Akar kemudian dikeringkan dengan menggunakan tissue steril. Potongan akar ditempatkan dalam media Potato Dextrose Agar (PDA) yang mengandung antibiotik kemisetin 500 mg/l dan rose bengal 1% (b/v). Media tersebut diinkubasikan pada suhu ruang selama 7 hari. Miselium cendawan yang tumbuh selanjutnya dimurnikan sampai didapatkan isolat murni.

Cendawan yang berhasil diisolasi selanjutnya diuji pada tanaman Centrosema pubescens untuk menentukan sifat simbiosisnya. Isolat cendawan yang tidak menyebabkan gejala penyakit pada tanaman inang dan meningkatkan pertumbuhan akan digolongkan sebagai cendawan endofit mutualistik sedangkan yang menyebabkan penyakit pada tanaman akan digolongkan sebagai cendawan parasit.

Masing-masing cendawan ditumbuhkan pada media PD (Potato Dextrose) cair, diinkubasi pada suhu ruang dengan agitasi 100 rpm selama 7 hari. Miselium cendawan dipanen, lalu disaring menggunakan kertas saring steril dan diinokulasikan pada daerah perakaran tanaman Centrosema pubescens yang berumur 1 minggu setelah tanam (MST). Tanaman ditumbuhkan dengan menggunakan media zeolit dan dipelihara di dalam rumah kaca selama 3 bulan. Respon tumbuh tanaman yang meliputi bobot basah dan bobot kering akar, bobot basah dan bobot kering tajuk serta persen kolonisasi cendawan pada akar tanaman diamati.

A.2. Cendawan Mikoriza Arbuskula (CMA)

Cendawan mikoriza arbuskula diisolasi menggunakan metode penyuburan (trapping). Selanjutnya spora tunggal dari campuran spora yang berasal dari biakan pot penyuburan kemudian ditumbuhkan pada akar tanaman Centrosema pubescens dan dipelihara di dalam rumah kaca selama 3 bulan dengan pemberian pupuk Johnson yang mengandung konsentrasi P setengah dosis. Setelah 3 bulan pemeliharaan dilakukan analisa biakan pot dengan menghitung jumlah spora, identifikasi spora dan persentase kolonisasi CMA. Spora didapatkan dengan cara menyaring media dengan saringan bertingkat (Brundett et al. 1994). Spora yang baik dipilih dan diletakkan pada kaca obyek dengan media PVLG untuk selanjutnya diidentifikasi (Schenck & Perez 1990).

Analisis kolonisasi cendawan pada akar dilakukan setelah proses pewarnaan dengan biru tripan (Brundrett et al. 1994).) Secara garis besar teknik pewarnaan akar dilakukan dengan cara sebagai berikut: akar dicuci, direndam dalam KOH 10% (v/v), kemudian KOH dibuang, dan dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya direndam dalam HCl 2% (v/v) selama 12 jam. Setelah itu HCl dibuang, dan terakhir akar diwarnai dengan pewarna biru tripan. Akar selanjutnya disimpan dalam asam gliserol 50% (v/v) sampai dilakukan pengamatan dan penghitungan persentase kolonisasi cendawan pada akar

B. Analisis Respon Tumbuh Tanaman Inang yang Diinokulasi Cendawan Mutualistik Akar

Cendawan mutualistik akar mikoriza dan non mikoriza yang memberikan respon terbaik diinokulasikan pada berbagai jenis tanaman yaitu tanaman pertanian (Oryza sativa, dan Zea mays), kehutanan (Acasia sp. dan Pharaserianthes falcataria), perkebunan (Theobroma cacao), tanaman obat (Phaleria macrocarpa), dan tanaman bukan inang mikoriza (Brassica sp.).

Isolat cendawan mutualistik akar non mikoriza diperbanyak dalam medium PD cair selama 7 hari pada suhu ruang dengan agitasi 100 rpm. Miselium cendawan dipanen dengan menggunakan kertas saring. Sebanyak 50 g miselium cendawan diinokulasikan pada perakaran tanaman tersebut dan ditumbuhkan pada medium zeolit 2 kg di dalam rumah kaca.

Isolat cendawan mutualistik akar mikoriza diperbanyak dengan menggunakan metode biakan pot. Hasil perbanyakan inokulum digunakan untuk menginokulasi tanaman uji tersebut diatas. Sebanyak 400 g inokulum berupa akar tanaman inang, spora dan miselia cendawan mikoriza arbuskula pada biakan pot dicampurkan dengan medium zeolit sebanyak 2 kg. Selanjutnya masing-masing ditumbuhkan secara terpisah pada media tersebut.

Tanaman Oryza sativa, Zea mays, dan Brassica sp., dipelihara selama 3 bulan sedangkan tanaman Theobroma caccao, Phaleria macrocarpa, Acasia sp., dan Pharaserianthes falcataria dipelihara selama 6 bulan. Respon pertumbuhan tanaman diamati dan dianalisis. Parameter yang diamati yaitu tinggi tajuk, bobot basah dan bobot kering tajuk, bobot basah dan bobot kering akar tanaman serta persentase kolonisasi cendawan.

Pengaruh tunggal isolat cendawan mutualistik akar non mikoriza dan mikoriza terbaik serta kombinasi kedua isolat tersebut secara bersamaan diuji pada tanaman Centrosema pubescens. Miselium cendawan mutualistik akar non mikoriza sebanyak 50 g diinokulasikan pada daerah perakaran tanaman Centrosema pubescens yang ditanam di dalam media zeolit. Inokulum CMA dicampurkan dalam media zeolit dan digunakan untuk pertumbuhan Centrosema pubescens. Pengaruh kombinasi kedua isolat secara bersamaan dilakukan dengan cara menginokulasi terlebih dahulu perakaran tanaman Centrosema pubescens dengan inokulum CMA. Setelah 2 minggu inokulasi CMA, tanaman tersebut diinokulasi miselium cendawan mutualistik akar non mikoriza pada daerah perakaran tanaman. Tanaman dipelihara selama 3 bulan di dalam rumah kaca.

Peranan cendawan mutualistik akar non mikoriza dalam membantu penyerapan P diuji dengan memberi perlakuan berbagai taraf P yaitu 25%, 50% dan dosis normal pupuk Johnson dilakukan pada tanaman Oryza sativa, Zea mays, Phaleria macrocarpa, Theobroma caccao, Acasia sp., Pharaserianthes falcataria dan Brassica sp. Dosis pupuk Johnson dapat dilihat pada Lampiran 1. Tanaman dipelihara selama 3 bulan dalam rumah kaca dan dipupuk dengan menggunakan pupuk Johnson dengan berbagai konsentrasi P. Respon pertumbuhan tanaman diamati dan dianalisis. Parameter yang diamati yaitu tinggi tanaman, bobot basah

dan bobot kering tajuk, bobot basah dan bobot kering akar tanaman serta persen kolonisasi.

Percobaan menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dan menggunakan 5 ulangan. Data selanjutnya diolah menggunakan program SAS versi 6.12 dan diuji lanjut menggunakan uji Perbandingan Ganda Duncan. Model linier rancangan penelitian adalah sebagai berikut (Mattjik & Sumertajaya 2000):

Yijkl=μ+αi+βj+ (αβ)ij+δijk

Ket:

Yijkl : nilai respon jenis mikoriza taraf ke-i, P taraf ke-j, ulangan ke-k dan waktu

pengamatan ke-k μ : rataan umum

(αβ)ij: pengaruh interaksi jenis mikoriza dengan P

βj : pengaruh P taraf ke-j

δijk : komponen acak perlakuan

C. Analisis Proses Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar Non Mikoriza C.1. Metode Pewarnaan Biru Tripan

Sebanyak 107 sel/ml suspensi spora cendawan mutualistik akar non mikoriza diinokulasikan pada daerah perakaran tanaman Centrosema pubescens berumur 1 MST yang ditumbuhkan secara hidroponik di dalam botol tertutup. Larutan Johnson dengan konsentrasi P 50% digunakan sebagai unsur hara pada sistem hidroponik. Tanaman dipelihara selama 3 bulan dengan penggantian larutan hara dilakukan setiap 2 minggu.

Kolonisasi dan struktur infeksi cendawan diamati dengan mewarnai akar tanaman dengan menggunakan metode pewarnaan biru tripan (Kormanik & McGraw 1982). Akar tanaman dipotong sebesar 1 cm kemudian dicuci dengan menggunakan air mengalir. Akar kemudian direndam dalam larutan KOH 10% (v/v) untuk menghilangkan isi sel akar. Akar dicuci dengan menggunakan akuades kemudian direndam dalam larutan HCl 1% (v/v). Akar diwarnai dengan pewarna biru tripan dan disimpan dalam larutan gliserol asam. Kolonisasi cendawan diamati dan dihitung dibawah mikroskop.

C.2. Penggunaan gen penanda GFP (Green Fluorescent Protein)

Gen penanda GFP diintroduksikan ke dalam genom cendawan mutualistik akar non mikoriza Aspergillus niger melalui beberapa tahapan yaitu produksi

speroplas (Hasiba 1992), introduksi gen GFP (Wymeleneberg et al. 1997), uji integrasi dan stabilitas gen GFP di dalam genom cendawan.

C.2.1 Produksi Speroplas Cendawan (Hasiba 1992)

Produksi speroplas cendawan dalam penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode Hasiba (1992). Miselia Aspergillus niger ditumbuhkan dalam media cair PD dengan konsentrasi sukrosa 2% (b/v). Selanjutnya kultur diinkubasi pada suhu ruang selama 24 jam, kemudian miselia dipanen dengan cara disaring dan selanjutnya digunakan untuk produksi speroplas. Sebanyak 1 g miselia yang berumur 24 jam dimasukkan ke dalam 25 ml larutan campuran enzim selulase dan “maserozyme” yang mengandung stabiliser osmotik manitol 0.6 M pada 100 ml Erlenmeyer. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 oC dengan agitasi 80 rpm selama 3 jam. Suspensi speroplas dimurnikan dengan menggunakan 4 ml larutan sukrosa dalam Hepes-KOH pH 7.0. Speroplas yang murni kemudian digunakan untuk proses transformasi yaitu integrasi gen GFP pada genom cendawan mutualistik akar Aspergillus niger .

C.2.2 Introduksi Gen GFP pada Cendawan Mutualistik Akar Aspergilus niger

C.2.2.1 Isolasi Plasmid pCamb-GFP

Plasmid yang digunakan dalam penelitian ini ialah plasmid pCamb-GFP yang memiliki promotor ToxA dan terminator Nos.

Gambar 3 Peta plasmid pCamb-GFP (Sesma & Osbourne 2004)

Plasmid tersebut memiliki penanda seleksi berupa resistensi terhadap antibiotik higromisin (Sesma & Osbourne 2004). Plasmid pCamb-GFP yang

pCAMgfp

970 0 bp

Kan-5338 Hygr-6874 SGFP-8686 RB-T-DNA STA region bom LB-T-DNA TrpC-7903 ToxA-Pr-8273 Rep2-2957 Rep1-4767

BamH I (22)

EcoRI (1)

EcoRV (5440 )

HindIII (52)

KpnI (17)

PvuII (147)

SacI (11)

SacII (6317)

SspI (5367)

X baI (28 )

X hoI (68 35)

X m aI (17)

X m nI (6650 )

PstI (9424)

N otI (940 9)

ClaI (3472)

N coI (8 68 5)

ClaI (8 275)

N coI (7543)

PstI (44)

SalI (34)

PvuI (178 )

PvuI (7537)

SalI (68 41)

SalI (8 265)

SphI (50 )

SphI (38 9)

SphI (7315)

N otI (1268 )

N otI (28 0 0 )

digunakan dalam penelitian ini diperoleh dari Dr. Anne Sesma dan Dr. Ane Osbourne (John Innes Centre. U.K). Peta plasmid pCamb-GFP dapat dilihat pada Gambar 3.

Isolasi plasmid dilakukan dengan dengan menggunakan metode Suharsono et al. (2000) dengan tahapan sebagai berikut. Bakteri E. coli DH 10 B yang mengandung plasmid pCamb-GFP dibiakkan dalam medium LB yang mengandung 50 μg/ml antibiotik kanamisin pada suhu 37 oC di pengocok (shaker) dengan kecepatan 200-300 rpm selama semalam. Sel bakteri diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 4000 rpm, 4 oC selama 20 menit. Cairan atau supernatan dibuang dan endapan bakteri yang berwarna putih kekuningan di dasar tabung disuspensikan dengan 2 ml buffer suspensi sel (50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 10 mM EDTA) kemudian divorteks untuk memudahkan bakteri tersuspensi. Setelah bakteri tersuspensi dengan baik, kemudian dilisis dengan cara penambahan 2 ml buffer lisis (0.2 M NaOH, 1% (b/v) SDS). Pencampuran buffer lisis dilakukan dengan membolak-balik effendorf sebanyak 8x dan dibiarkan selama 1-2 menit. Lisis bakteri ditandai dengan terbentuknya lendir. Setelah bakteri lisis, campuran suspensi ditambah 2 ml bufer netralisasi (1.32 M sodium asetat pH 4.8) dan dibolak balik hingga buffer tercampur merata. Campuran suspensi disentrifugasi (Jouan BR-4i) pada suhu 40 oC kecepatan 3000 rpm selama 20 menit. Sentrifugasi campuran suspensi menjadi dua bagian. Bagian bawah merupakan gumpalam sisa-sisa bakteri yang telah lisis sedangkan bagian atas ialah cairan jernih yang terdapat pada bagian atas yang mengandung DNA plasmid. Cairan bagian atas selanjutnya dipindahkan ke dalam tabung baru untuk pemurnian plasmid.

Pemurnian plasmid dilakukan dengan menggunakan campuran larutan fenol, kloroform, isoamilalkohol (25:24:1). Larutan campuran kemudian divorteks agar tercampur dengan baik. Cairan disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu ruang selama 1-2 menit. Setelah disentrifugasi akan terbentuk dua fase yang dibatasi lapisan putih yang tipis. Cairan bagian atas diambil dan dimasukkan ke dalam tabung yang bersih kemudian ditambahkan RNAse (100 µg/ml) dan di inkubasikan pada suhu 37 oC selama semalam untuk menghilangkan RNA. Cairan kemudian dipresipitasikan dengan penambahan 0.1 volume 3 M sodium asetat, pH

5.2, dan 2 volume etanol absolut lalu diinkubasikan pada suhu -20 oC selama 2 jam. DNA plasmid diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4 oC selama 20 menit. Setelah sentrifugasi cairan dibuang dan endapan dibilas dengan etanol 70% (v/v) dan di sentrifugasikan pada 10.000 rpm, suhu 4

o

C selama 10 menit, cairan dibuang dan endapan dikeringkan dengan vakum. DNA disuspensikan di dalam 50 µl TE 1x. Kuantitas plasmid diuji dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa.

C.2.2.2 Introduksi Gen GFP

Introduksi gen dilakukan berdasarkan metode Wymeleneberg et al. (1997). Secara garis besar metode tersebut ialah sebagai berikut: 200 µl speroplast yang setara dengan 1.9 x 105 sel speroplas dicampur dengan plasmid pCamb-GFP sebanyak 200 µl yang setara dengan 10 µg plasmid pada 15 ml tabung Falcon. Kemudian ditambahkan ke dalam tabung larutan PEG (25% PEG 8000, Sigma) 50 µl, 50 mM CaCl, 10 mM Tris HCl pH 7.5 ditambahkan ke dalam tabung, dan diinkubasi dalam es selama 2 menit. Selanjutnya ke dalam tabung ditambahkan 2 ml larutan PEG yang dicampur secara perlahan dan diinkubasi pada suhu ruang selama 5 menit. Selanjutnya larutan 4 ml 0.7 KCl, dan 50 mM CaCl2 ditambahkan

ke dalam tabung. Sebanyak 50 µl larutan yang berasal dari tabung Falcon (larutan transforman) tersebut disebar ke dalam cawan yang berisi media PDA yang mengandung 20% (v/v) sukrosa dan 200 µg/ml higromisin.

C.2.3 Uji Integrasi dan Stabilitas Gen GFP di dalam Genom cendawan Cendawan transforman yang mengekspresikan gen GFP diseleksi lebih lanjut dengan cara mengamati pertumbuhan speroplas pada media PDA yang mengandung antibiotik higromisin dan sukrosa sebesar 20% (b/v). Speroplas yang tumbuh membentuk miselia pada media tersebut diseleksi lebih lanjut menggunakan sinar biru 515 nm pada mikroskop fluoresen (Lorang 2001). Penapisan untuk integrasi gen dilakukan dengan menggunakan subkultur transforman sebanyak 2 kali atau tiga generasi (T0, T1, dan T2).

C.2.3.1 Isolasi DNA Genom Cendawan

Sebanyak 1 g miselium cendawan diletakkan di dalam mortar, ditambahkan N2 cair kemudian digerus hingga halus. Bubuk miselium

(b/v) CTAB, 75 mM Tris-HCL, pH 8.0,15 mM EDTA, 1.05 M NaCl), dicampurkan hingga merata, kemudian diinkubasikan pada suhu 65 oC selama 1 jam. Larutan diekstraksi dengan menambahkan 6 ml larutan campuran antara kloroform dan isoamilalkohol (24:1) dingin dan dibolak-balik secara perlahan-lahan selama 1.5 menit kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm pada 4 oC selama 20 menit. Supernatan yang terletak pada bagian atas diambil dan ditambahkan isopropanol dingin 0.7 x volume, lalu dibolak-balik perlahan-lahan kemudian diinkubasikan di freezer suhu -20 oC selama 2 jam. Larutan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm pada suhu 4 oC selama 20 menit. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan endapan ditambahkan dengan etanol 70% (v/v) sebanyak 3 ml. Larutan disentrifugasi pada kecepatan yang sama lalu cairan dibuang, Tabung dikeringkan dengan cara divakum. Endapan yang telah kering disuspensikan dengan 1 x TE sebanyak 50 µl lalu diresuspensikan secara pelan. Cairan diambil dan dipindahkan ke dalam effendorf kemudian ditambahkan 0.1 vol konsentrasi (100 µg/ ml) RNase dan diinkubasikan selama semalam.

Purifikasi DNA dilakukan dengan menambahkan 1 vol larutan campuran fenol dan kloroform (1:1), lalu effendorf dibolak-balik perlahan kemudian disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu ruang selama 15 menit. Supernatan diambil, dan ditambahkan 0.1 x vol NaOAC 3 M, pH 5.2 dan etanol absolut dingin 2-3 vol kemudian effendorf dibolak-balik perlahan-lahan. DNA genom diendapkan dengan sentrifugasi pada kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4

o

C selama 20 menit. Setelah sentrifugasi cairan dibuang dan endapan dibilas dengan etanol 70%, lalu disentrifugasi kembali pada 10.000 rpm dengan suhu 4

o

C selama 10 menit. Cairan yang terbentuk dibuang dan endapan dikeringkan dengan vakum. DNA disuspensikan di dalam 50 µl 1 x TE. Kuantitas DNA genom diuji dengan menggunakan elektroforesis gel agarosa.

Kemurnian dan konsentrasi DNA dapat diketahui dengan menggunakan spektrofotometer pada OD 260 nm untuk membaca keberadaan asam nukleat dan pada OD 280 nm untuk membaca keberadaan protein. Kemurnian larutan DNA dapat dihitung dengan menghitung hasil OD 260 nm dibagi OD 280 nm. Hasil perbandingan antara 1.6-2.0 menunjukkan kemurnian yang tinggi.

C.2.3.2 Amplifikasi DNA Cendawan Aspergillus-GFP

Amplifikasi DNA cendawan dilakukan dengan menggunakan Real Taq Polymerase, dNTP, sGFPf (5’-CGACGTAAACGGCCACAAGT-3’), sGFPr (5’-GTCCATGCCGTGAGTGATCC-3’), Nosf (5’-GAATCCTGTTGCCGGTCTTGCG -3’), dan Nosr (5’-CGGGACTCTAATCATAAAAACC-3’), digunakan untuk mengidentifikasi keberadaan mengisolasi gen penyandi sGFP dan terminator Nos dari genom cendawan transgenik Aspergillus-GFP serta primer Ubqf (5’-CCAGGACAAGATGATGTGCC-3’) dan Ubqr(5’-AAGAAGCTGAAGCATCCAGC -3’). Kondisi PCR untuk mengamplifikasi fragmen GFP ialah sebagai berikut: pradenaturasi 94 oC selama 1 menit, denaturasi pada 94 oC selama 1 menit, annealing pada suhu 53 oC selama 30 detik, pemanjangan pada suhu 72 oC selama 1 menit diikuti tahapan pendinginan dan dilakukan sebanyak 35 siklus Kondisi PCR untuk fragmen Nos dan Ubiquitin sama seperti kondisi PCR untuk GFP, tetapi berbeda pada suhu annealing sebesar 55 oC untuk amplifikasi Nos dan 58

o

C untuk ubiquitin. Ubiquitin digunakan sebagai kontrol positif.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Hasil Pengamatan

A. Isolasi dan Penapisan Cendawan Mutualistik Akar

Sebanyak 22 isolat cendawan yang terdiri dari 10 isolat yang berasal dari rizoplan kebun karet dan 12 isolat yang berasal dari dari rizosfer dan rizoplan tanaman gambut (Tabel 1).

Hasil isolasi cendawan yang berasal dari akar tanaman karet dan rizoplan tanah gambut berupa cendawan dari genus Acremonium, Aspergillus, Curvularia, Fusarium, Penicillium, Trichoderma, Glomus, Gigaspora, dan beberapa isolat yang belum teridentifikasi.

Tabel 1 Cendawan yang berhasil diisolasi dari rizosfir dan rizoplan tanaman karet dan tumbuhan pada tanah gambut

Isolat Cendawan

Rizoplan tumbuhan karet Rizosfer tumbuhan gambut

Acremonium sp. Aspergillus sp. 2

Aspergillus sp. 1 Aspergillus niger 2

Aspergillus niger 1 Penicillium sp. 2

Curvularia sp. Trichoderma sp.2

Fusarium sp. Isolat 5

Paecilomyces sp. Isolat 6

Penicillium sp.1 Isolat 7

Trichoderma sp. 1 Glomus sp. 2

Isolat 1 Gigaspora sp.

Isolat 2 Isolat 3 Isolat 4

Glomus sp.1

Isolat-isolat cendawan tersebut dapat dibedakan berdasarkan morfologi secara makroskopis dan mikroskopis. Selain itu berdasarkan respon tumbuh dan proses kolonisasi cendawan pada tanaman Centrosema pubescens maka dapat diketahui sifat cendawan yaitu parasitik akar, mutualistik akar non mikoriza dan mutualistik akar mikoriza. Sebanyak 15 isolat cendawan lainnya termasuk dalam kelompok mutualistik akar yang terdiri dari 12 isolat cendawan mutualistik akar non mikoriza dan 3 isolat cendawan mutualistik akar mikoriza, sedangkan 7 isolat cendawan yang termasuk kedalam sifat simbiosis parasitik akar yaitu Acremonium sp., Fusarium sp., isolat 1, isolat 2, isolat 3, isolat 4, dan isolat 7 (Tabel 2).

Tabel 2 Penapisan isolat-isolat cendawan pada tanaman Centrosema pubescens

Perlakuan cendawan BB tajuk BK tajuk BB akar Bk akar % kolonisasi Sifat simbiosis Tanpa inokulasi (K) 0.56de1) 0.1h3 0.863a 0.09d 0g -

Acremonium sp. 0.31h 0.06h 0.19i 0.04d 35.41c Parasit akar

Aspergillus sp. 1 4.02a 1.60a 1.25cd 0.14bcd 60.48ab Mutualistik akar

(Non Mikoriza)

Aspergillus niger 1 4.47a 1.62a 2.94bcd 0.60b 65.80a Mutualistik akar

(Non Mikoriza)

Curvularia sp. 0.61gh 0.17gh 0.74def 0.07cd 57.96bc Mutualistik akar

(Non Mikoriza)

Fusarium sp. 0.29h 0.05h 0.22ghi 0.02d 35.00be Parasit akar

Paecilomyces sp. 1.17ef 0.39e 0.98ef 0.17bcd 52.42c Mutualistik akar

(Non Mikoriza)

Penicillium sp.1 3.04c 0.94c 1.92bc 0.14bcd 55.61bc Mutualistik akar

(Non Mikoriza)

Trichoderma sp. 1 1.81e 0.49e 2.14ab 0.19bcd 56.89bc Mutualistik akar

(Non Mikoriza) Isolat 1 0.39h 0.06h 0.19i 0.02d 31.60ef Parasit akar Isolat 2 0.35h 0.04h 0.37i 0.04d 28.55e Parasit akar Isolat 3 0.33h 0.05h 0.24i 0.02d 35.82e Parasit akar Isolat 4 0.30h 0.04h 0.25i 0.02d 37.34d Parasit akar

Aspergillus sp. 2 2.27d 0.71d 1.67de 0.27bc 52.67c Mutualistik akar

(Non Mikoriza)

Aspergillus niger 2 3.89b 1.34b 2.58i 0.28b 60.17ab Mutualistik akar

(Non Mikoriza)

Penicillium sp. 2 0.94efg 0.24fgh 1.09efghi 1.49bcd 58.51bc Mutualistik akar

(Non Mikoriza)

Trichoderma sp.2 0.96ef 0.32efg 1.17efg 1.33bcd 61.78ab Mutualistik akar

(Non Mikoriza) Isolat 5 1.46e 0.48e 1.41efgh 0.24bcd 52.30c Mutualistik akar (Non Mikoriza) Isolat 6 1.86de 0.54de 1.34def 0.21bcd 56.99bc Mutualistik akar (Non Mikoriza) Isolat 7 0.32gh 0.04h 0.31i 0.01d 45.98e Parasit akar Tanpa inokulasi (K) 10.80c 8.23c 0.73c 0.64c 0c -

Glomus sp. 1 46.30a 25.50a 6.40a 2.40a 79.3a Mutualistik akar

(Mikoriza)

Glomus sp. 2 35.30b 17.87b 4.00b 1.60b 72.3b Mutualistik akar

(Mikoriza)

Gigaspora sp. 30.60b 18.90b 2.6b 1.83b 71.3b Mutualistik akar

(Mikoriza)

Ket: 1)

Angka dalam kolom yang sama pada masing-masing kelompok yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan, P< 0.05.

Cendawan Aspergillus niger 1 yang berasal dari rizoplan tanaman karet yang dikelompokkan sebagai cendawan mutualistik akar non mikoriza menunjukkan respon tertinggi pada parameter pertumbuhan tanaman Centrosema pubescens dibandingkan isolat-isolat cendawan lainnya. Sedangkan cendawan mutualistik akar mikoriza yang menunjukkan respon tertinggi pada parameter pertumbuhan tanaman Centrosema pubescens ialah Glomus sp. 1 yang diisolasi dari rizoplan tanaman karet.

B. Analisis Respon Tumbuh Tanaman Inang yang Diinokulasi Cendawan Mutualistik Akar

B.1 Pengaruh Isolat Terpilih Cendawan Mutualistik Akar terhadap Pertumbuhan Berbagai Tanaman Inang

B.1.1 Uji Spesifistitas Respon Tumbuh dan Kolonisasi

Hasil uji respon tumbuh cendawan mutualistik terpilih yaitu A. niger 1 dan Glomus sp. 1 pada berbagai tanaman uji dosis P 50% untuk mempelajari spesifistitas respon tumbuh dan kolonisasi disajikan pada Gambar 3.

Pada perlakuan inokulasi tunggal, A. niger 1 maupun Glomus sp. 1 meningkatkan pertumbuhan semua tanaman uji pada semua parameter yang diamati. Jika kedua perlakuan tunggal dibandingkan, A. niger 1 mempunyai respon tumbuh yang lebih baik dari Glomus sp. 1.

Masing-masing cendawan mutualistik mengkolonisasi akar tanaman uji. Persentase kolonisasi A. niger 1 berkisar antara 53% sampai 75.67% dengan kolonisasi tertinggi terdapat pada Zea mays dan kolonisasi terendah terdapat pada Phaleria macrocarpa. Sedangkan pada Glomus sp. 1, persentase kolonisasi tertinggi yaitu sebesar 71.33% terdapat pada tanaman Oryza sativa, dan persentase kolonisasi terendah yaitu sebesar 25.67% terdapat pada Brassica sp. Pada perlakuan kontrol tidak dijumpai kolonisasi cendawan baik A. niger 1 maupun Glomus sp.1 (Gambar 4).

Cendawan mutualistik akar non mikoriza A. niger 1 dan cendawan mutualistik akar mikoriza Glomus sp. 1 dapat meningkatkan pertumbuhan tananam seperti tinggi, bobot kering dan bobot basah tajuk, bobot kering dan bobot basah akar berkisar antara 2-4 kali lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol. Peningkatan pertumbuhan tersebut terjadi pada semua tanaman yang diuji yaitu Oryza sativa, Zea mays, Pharaserianthes falcataria, Acasia sp., Theobroma cacao, Phaleria macrocarpa, dan Brassica sp.

Struktur kolonisasi berupa hifa internal yang terbentuk pada akar Brassica sp. hanya dijumpai pada daerah epidermis atas. Struktur arbuskula tidak dijumpai pada akar tanaman tersebut (Gambar 5).

0 20 40 60 80 100 120 140 160 Oryz a sa tiva Zea m ays Phar aser ianth es fa

lcat aria

Aca sia sp

.

Theo bro

ma c accao

Phal eria m

acro car pa Bras sica sp. Jenis tanaman Ti nggi ( c m ) 180 Kontrol A. niger 1 Glomus 1 0 10 20 30 40 50 60 70 Oryza sat iva Zea mays Pha ras eria nthes falc atar ia Aca sia sp. Theo broma cac cao Phal eria mac rocar pa Bras sica sp. Jenis tanaman BB & B K T a ju k ( g ) 80 90

BB Tajuk Kontrol BB Tajuk A. niger 1 BB Tajuk Glomus 1 BK tajuk Kontrol BK tajuk A. niger 1 BK tajuk Glomus 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80 Oryz a s ativa Zea may s Phar aser iant hes fal cata ria Acas ia s

p.

Theo brom

a ca ccao

Phal eria m

acro car pa Bras sica sp. Jenis tanaman BB & BK Ak a

r BB akar Kontrol

BB akar A. niger 1 BB akar Glomus 1 BK akar Kontrol BK akar A. niger 1 BK akar Glomus 1

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Ory za s

ativ a Zea may s Phara seria nthe s fa

lcat aria

Acas ia s

p. Theo brom a c acc ao Phal eria m

acro car pa Bras sica sp. Jenis tanaman P er s en ta se k o lo n isas i (% ) Kontrol A. niger 1 Glomus sp. 1

Gambar 5 Struktur kolonisasi Glomus sp. 1 pada akar Brassica sp. pada perbesaran 10 x. a. apresorium, b. hifa internal

B.1.2 Pengaruh Inokulasi Ganda A. niger 1 dan Glomus sp.1

Pengaruh inokulasi ganda antara A. niger 1 dan Glomus sp. 1 diuji pada tanaman Centrosema pubescens. Respon tumbuh yang dinyatakan dengan bobot basah dan bobot kering tajuk menunjukkan perlakuan inokulasi ganda A. niger 1 dan Glomus sp. 1 meningkatkan respon tumbuh tanaman dibandingkan tanaman kontrol yaitu sebesar 51.67 g dan 17.2 g (Gambar 6). Respon tersebut lebih rendah dibandingkan perlakuan tunggal A. niger 1 yaitu masing-masing sebesar 62.3 g dan 22.6 g namun lebih tinggi dibandingkan perlakuan tunggal Glomus sp.1 yaitu masing-masing sebesar 58.2 g dan 18.3 g.

0 10 20 30 40 50 60

kontrol

Gambar 6 Pengaruh inokulasi ganda cendawan mutualistik akar mikoriza dan non mikoriza pada Centrosema pubescen umur 3 bulan pada taraf P 50%

Hal ini menyebabkan isolat A. niger 1 sebagai cendawan mutualistik akar non mikoriza digunakan pada uji lanjut untuk mengetahui peranan cendawan tersebut terhadap penyerapan P tanaman inang serta proses kolonisasi yang terjadi.

70

A. niger1 Glomus sp.1 A. niger 1 + Glomussp.1

Jenis Inokulum

BB tajuk BK tajuk

BK akar BB akar

Resp

on

t

u

mb

uh

10µm a

B.2 Pengaruh Cendawan Mutualistik Akar Non Mikoriza terhadap Penyerapan P Tanaman Inang

Pengaruh inokulasi cendawan A. niger 1pada berbagai taraf pemupukan P pada berbagai tanaman uji yaitu Oryza sativa, Zea mays, Theobroma cacao, Acasia sp., Pharaserianthes falcataria, Phaleria macrocarpa, dan Brassica sp. disajikan pada Tabel 4.

Tabel 3 Pengaruh perlakuan P terhadap pertumbuhan berbagai tanaman inang yang diinokulasi A. niger 1

Jenis tanaman Perlakuan Tinggi

(cm) BB tajuk (g) BB akar (g) BK tajuk (g) BK akar (g) % Kolonisasi K (P normal – A. niger

1) 41.3c

1)

21.8c 14.6b 3.1c 1.0c 0c

P 25% + A. niger 1 51.6b 49.4b 21.33b 4.33b 1.76b 72.3a

P50% + A. niger 1 61.0a 54.3a 24.87a 5.13a 2.36a 74.33a

Oryza sativa*

P normal + A. niger 1 55.63b 49.9b 20.43 c 4.00b 1.76b 69.00b K (P normal – A. niger

1) 62.6c 44.43c 33.17c 3.2d 2.28d 0c

P 25% + A. niger 1 84.6b 63.0b 45b 6.5b 5.6b 70.67b

P50% + A. niger 1 134.6a 76.6a 61.17a 7.8a 7.86a 73ab

Zea mays*

P normal + A. niger 1 87.3b 58.2b 50b 4.27c 3.86c 73.53a K (P normal – A. niger

1) 21.3b 21.33c 7.6c 1.61c 0.677c 0c

P 25% + A. niger 1 33.9a 35.83b 13.1ab 4.16b 1.51b 62.67b

P50% + A. niger 1 36.17a 50.33a 16.27a 6.1a 1.8a 68.67a

Pharaserianthes falcataria**

P normal + A. niger 1 33.67a 39.73b 11.33bc 3.89b 0.68c 62.3b K (P normal – A. niger

1) 27.33b 14.6d 2.93c 0.68c 0.34b 0c

P 25% + A. niger 1 40.76a 21.43c 5.6b 1.67b 0.68ab 57b

P50% + A. niger 1 45.33a 32.8a 8.4a 3.06a 1.01a 63.33a

Acasia sp.**

P normal + A. niger 1 41.83a 26.67b 4.6bc 1.5b 0.49b 56b K (P normal – A. niger

1) 20.633c 21.67c 15.5c 1.9c 0.89d 0d

P 25% + A. niger 1 25.13b 26.1b 24.8b 2.63b 2.73b 52.67c

P50% + A. niger 1 29.53a 33a 31.0a 3.9a 4.03a 63.3a

Theobroma cacao**

P normal + A. niger 1 24.0b 25.93b 23.67b 1.9c 1.63c 58.33b K (P normal – A. niger

1) 15.5c 20.83c 11.03c 1.98c 0.6c 0c

P 25% + A. niger 1 25.6b 32.67b 21.03b 3.7b 2.17b 52.07b

P50% + A. niger 1 33.8a 42.73a 32.06a 5.23a 4.18a 60.33a

Phaleria macrocarpa**

P normal + A. niger 1 24.67b 30.5b 22.67b 3.23b 2.35b 51.83b K (P normal – A. niger

1) 9.87c 7.83c 1.03c 0.57d 0.103c 0d

P 25% + A. niger 1 18.3b 16.9b 2.3b 1.8b 0.28b 53c

P50% + A. niger 1 26.9a 24.07a 4.9a 2.73a 0.65a 66.5a

Brassica sp.*

P normal + A. niger 1 26a 17.4b 2.26b 1.2c 0.27b 57.83b

Ket: 1) _A

ngka dalam kolom yang sama pada masing-masing kelompok yang diikuti huruf yang sama tidak berbeda nyata berdasarkan uji jarak berganda Duncan, P< 0.05.

Parra-Garcia MD, Lo Giudice V, Ocampo JA. 1992. Absence of VA colonization in Oxalis pes-caprae inoculated with Glomus mosseae. Plant Soil 145:298– 300.

Petrini O, Sieber TN, Toti L, Viret O. 1991. Ecology Metabolite Production and Substrate Utilization in Endophytic Fungi. Natural Toxins 1:185-196.

Puente ME, Bashan Y, Li CY, Lebsky VK. 2004. Microbial populations and activities in the rhizoplane of rock- plants. I. Root colonization and weathering of igneous rocks. Plant Biol 6:629–642.

Puslitbang Tanah. 1999. Tipe tanah. Bogor: Pusat Penelitian dan Pengembangan Tanah dan Agroklimat.

Riach MB, Kinghorn JB. 1996. Genetic transformation and vector development in filamentous cendawan. In Boss CJ, editor. Fungal genetic: Principles and practice. New York: Marcel Dekker, Inc. pp. 209-233.

Register, C.J. 1997. Approaches to evaluating the transgenic status of transformed plants. Tib Tech 15: 141−146.

Reyes I, Baziramakenga R, Bernier L, Antoun H. 2001. Solubilization of phosphate rocks and minerals by a wild-type strain and two UV-induced mutants of Penicillium rugulosum. Soil Biol Biochem 33:1741–1747

Rubini MR et al. 2005. Diversity of endophytic fungal community of cacao (Theobroma cacao L) and biological control of Crinipellis pernicosa, causal agent of Witches’ Broom Disease. Int J Biol Sci 1: 24-33.

Saeed S, Bhatti HN, Bhatti TM. 2002. Bioleaching Studies of Rock Phosphate Using Aspergillus niger. J of Bio Sci 2(2): 76-78.

Salisbury FB, Ross CW. 1995. Fisiologi Tumbuhan Jilid 1. Bandung: Penerbit ITB.

Schenk NC, Perez Y. 1990. Manual for identification of VA mycorrhizal fungi. Ed ke 3. INVAM. Gainesville: University of Florida. hlm 286.

Sesma A, Osbourn A. 2004. The rice leaf blast pathogen undergoes developmental processes typical of root-infecting cendawan. Nature 431:582-586.

Sieverding E. 1991. Vesicular-arbuscular mycorrhiza management in tropical agrosystems. Germany: Deutsche Gesellschaft für Technische Zusammenarbeit (GTZ).

Siemering KR, Golbik R, Sever R, Haseloff J. 1996. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Curr Biol 6:1653–1663.

Smith SE, Read JD. 1997. Mycorrhizal Symbiosis. 2nd. London: Academic Press. Smith SE. Smith FA, Jacobsen I. 2003. Mycorrhizal cendawan can dominate

phosphate supply to plants irrespective of growth responses. Plant Physiol 133: 16-20.

Smith T, Gaskell J, Berka R, Henner D, Cullen D. 1990. Promoter of the Aspergillus niger glucoamylase gene functions in Ustilago maydis. Mol Gen Genet 252:503-509.

Spellig T, Bottin A, Kahmann R, 1996. Green fluorescent protein (GFP) as a new vital marker in the phytopathogenic fungus Ustilago maydis . Mol Gen Genet 252:503-509.

Suharsono U, Fujisawa Y, Kawasaki T, Iwasaki Y, Satoh H, Shimamoto K. 2002. The heterotrimetric G protein as subunit acts upstream of the small GTPase RAc in disease resistance of rice. Proc Natl Acad Sci USA 99: 13307-13312. Sun CB, Kong QL, Xu WS. 2002. Efficient transformation of Penicillium

chrysogenum mediated by Agrobacterium tumefaciens LBA4404 for cloning of Vitreoscilla hemoglobin gene. Elec J of Biotech 5 (1): 1-7.

Tisserant B, Gianinazzi-Pearson V, Gianinazzi S, Golote A. 1993. In planta histochemical staining of fungal alkaline phosphatase activity for analysis of efficient arbuscular mycorrhizal infections. Mycological Research 97:245 250.

Usuki F, Narisawa K, 2007. A mutualistic symbiosis between a dark septate endophytic fungus, Heteroconium chaetospira, and a nonmycorrhizal plant, Chinese cabbage. Mycologia. 99(2):175-184

Varma A, Verma S, sudha, Sahay N, butehorn, Franken P. 1999. Pirimospora indica, a cultivable plant growth promoting root endophyte. Appl Environ Microbiol 65(6):2741-2744.

Wahid OAA, Mehana TA. 2000. Impact of phosphate-solubilizing fungi on the yield and phosphorus-uptake by wheat and faba bean plants. Microbiol Res 155:221–227.

Walker C, Schüßler A. 2004. Nomenclatural clarifications and new taxa in the Glomeromycota. Mycol Res 108:981-982.

Wennstrom A. 1994. Endophyte - the misuse of an old term. Oikos 71:535-536. Wilson D. 1995. Endophyte – the evolution of a term, aFnd clarification of its use

Wymeleneberg AJV, Cullen D, Spear RN, Schoenike B. Andrews JH. 1997. Expression of green fluorescent protein in Aureobasidium pullulans and quantification of the fungus leaf surface. Bio Tech 23:686-690.

Xu C et al. 2002. Two novel fungal virulence genes specifically expressed in apresoria of the rice blast fungus. Plant cell 14:2107-2119.

Zareen A. Zaki MJ, Khan NJ. 2001. Effect of Fungal filtrates of Aspergillus Species on Development of Root-knot Nematodes and Growth of Tomato (Lycopersicon esculentum Mill.) Pakistan J of Bio Sci 4(8):995-999.

Zulfitri A. 2007. Pengaruh Cendawan Endofit Akar Dan Mikoriza Arbuskula (CMA) Terhadap Pertumbuhan Jarak Pagar (Jatropha Curcas Linn.) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.

Lampiran 1Tabel komposisi larutan baku hara Johnson Hara Makro

Senyawa Berat molekul Konsentrasi larutan stok (M)

Konsentrasi larutan stok (g/l)

Volume larutan stok/larutan final

(ml)

KNO3 101,10 1,00 101,10 6,0

Ca(NO)3.4H2O 236,16 1,00 236,16 4,0

NH4H2PO4 115,08 1,00 115,08 2,0

MgSO4.7H2O 246,49 1,00 246,49 1,0

HaraMikro

Senyawa Berat molekul Konsentrasi larutan stok (M)

Konsentrasi larutan stok (g/l)

Volume larutan stok/larutan final

(ml)

KCl 74,55 50,0 3,728

H2BO3 61,84 25,0 1,546

MnSO4.H2O 169,01 2,0 0,338

ZnSO4.7H2O 287,55 2,0 0,575 1,0

CuSO4.5H2O 249,71 0,5 0,125

H2MoO4(85% MoO3) 161,97 0,5 0,081

SIMPULAN DAN SARAN

Cendawan mutualistik akar non mikoriza dan mikoriza telah berhasil diisolasi dari tanah gambut dan kebun karet. Penapisan kedua macam cendawan tersebut dilakukan untuk mengetahui isolat potensial dalam peningkatan pertumbuhan tanaman. A. niger yang diisolasi dari kebun karet merupakan isolat cendawan mutualistik terbaik yang dapat meningkatkan pertumbuhan 3 kali dibandingkan dengan kontrol dan 2 kali lebih tinggi dibandingkan dengan CMA. Kolonisasi cendawan A. niger pada tanaman uji berkisar antara 53-75% sedangkan Glomus sp. berkisar antara 25-70%. Analisis proses kolonisasi cendawan mutualistik akar A. niger dilakukan dengan metode konvensional pewarnaan biru tripan dan penggunaan gen GFP. Gen penanda GFP berhasil diintroduksikan dalam genom A. niger dan stabil dalam 3 generasi subkultur cendawan. Struktur yang terbentuk di dalam akar tanaman inang berupa apresorium, hifa internal dan struktur menyerupai klamidospora. Struktur yang digunakan dalam transfer nutrisi pada cendawan mutualistik non mikoriza masih belum diketahui, sehingga diperlukan penelitian lanjutan yaitu pelabelan unsur C dan P. Selain itu analisis lebih lanjut juga perlu dilakukan untuk mengetahui jumlah kopi gen yang terintegrasi di dalam genom untuk mengetahui tingkat ekspresinya, yaitu dapat dilakukan dengan analisis Southern blot.

DAFTAR PUSTAKA

Arpaia S et al. 1997. Production of transgenic eggplant (Solanum melongena L.) resistant to Colorado potato beetle (Leptinotarsa decemlineata say). Theor Appl Genet. 95: 329−334.