Varma et al. 1999 dalam penelitiannya tidak mempelajari struktur simbiosis lebih lanjut yang terjadi diantara ke 2 simbion pada tingkat selular, sehingga ada
atau tidaknya invaginasi plasma membran sel inang yang memungkinkan terjadinya transfer nutrisi seperti pada simbiosis mutualisme mikoriza arbuskula
tidak dapat diketahui.
B. Analisis Proses Kolonisasi dan Peningkatan Pertumbuhan oleh Cendawan Endofit Akar
Pertumbuhan cendawan pada akar tanaman inang dapat dipelajari dengan menggunakan 2 metode yaitu metode pewarnaan cendawan pada akar dan
menggunakan gen penanda khusus diantaranya GFP Green Fluorescent Protein
.
B.1 Pewarnaan Cendawan pada Akar
Metode pewarnaan akar merupakan metode yang memanfaatkan zat pewarna staining untuk mewarnai jaringan cendawan sehingga struktur
cendawan pada akar tanaman dapat dikenali. Terdapat dua macam metode pewarnaan yaitu non vital staining dan vital staining.
Pada metode non vital staining, pewarna yang digunakan diantaranya ialah biru tripan dan chlorazol black E yang akan bereaksi dengan dinding sel
cendawan baik yang hidup maupun yang mati, sehingga tidak dapat membedakan jaringan cendawan yang hidup dan yang mati. Selain itu metode ini tidak dapat
digunakan untuk mengenali cendawan yang bersimbiosis dalam sistem yang hidup.
Metode vital staining
dapat digunakan untuk mewarnai struktur cendawan yang hidup. Pewarna yang digunakan dapat berupa substrat bagi enzim hidrolisis
fluorescein diacetate atau akseptor elektron yang akan berubah warna pada saat terjadinya reduksi garam tetrazolium atau substrat bagi reaksi lainnya alkalin
fosfatase Tisserant et al. 1993. Efektivitas pewarna tersebut bergantung pada penetrasinya ke dalam sel dan dipengaruhi oleh suberinasi dinding sel tanaman
atau ketebalan dinding sel tanaman tersebut. Pada metode vital staining, kuantifikasi cendawan pada sistem simbiosis hidup juga tidak bisa dilakukan
23
sama halnya dengan metode non vital staining. Hal ini disebabkan pada metode tersebut, perlu adanya preparasi yang akan merusak sistem simbiosis tersebut.
B.2 Gen Penanda Khusus
Gen penanda seleksi seperti GFP telah banyak digunakan dalam berbagai penelitian pada sejumlah besar organisme baik pada prokariot maupun eukariot
Chalfie et al. 1994, Cubbit et al. 1995. Menurut Lorang et al. 2001 gen GFP dapat digunakan sebagai alat untuk menganalisa interaksi yang terjadi antara
cendawan dan tanaman. Penggunaan gen penanda GFP pada cendawan telah banyak dilakukan, misalnya pada Candida albicans Cormack et al. 1997
digunakan untuk membedakan protein yang berhubungan dengan sifat patogenisitas yang dihasilkan oleh tipe liar dan mutan pada sel inang. Gen GFP
juga digunakan untuk mempelajari aliran sitoplasma yang berperan dalam pertumbuhan dan pertunasan pada khamir Niedenthal et al. 1996. Pada
cendawan penyebab penyakit blas pada padi, gen GFP digunakan sebagai gen penunjuk reporter gene untuk mempelajari virulensi dari cendawan tersebut Xu
et al . 2002. Gen GFP digunakan untuk mempelajari proses kolonisasi
Aspergillus fumigatus sebagai cendawan patogen manusia Langfelder et al.
2001, Ustilago maydis sebagai cendawan patogen pada tanaman jagung Spelling 1996, Aspergillus flavus sebagai cendawan perusak biji-bijian dan penghasil
aflatoksin yang disimpan di dalam gudang Du et al. 1999. Gen GFP juga telah dipakai pada cendawan yang berpotensi dalam bidang industri seperti pada
Aspergillus niger untuk memonitor sekresi enzim glukoamilase dan selulase
Gorgon et al. 2000, dan pada Penicillium griseoroseum untuk deteksi produksi enzim pektinolitik yang diperlukan industri tekstil dan makanan Lopes et al.
2004. Gen
GFP ialah gen yang berasal dari ubur-ubur Aequorea victoria. GFP
merupakan polipeptida dengan 238 asam amino, berukuran 27-kDa menyerap cahaya pada panjang gelombang maksimum 395 dan 475 nm serta memancarkan
cahaya pada panjang gelombang maksimum 508 nm. Gen GFP tipe liar yang berasal dari A. victoria tidak efisien ditranslasikan pada genom cendawan,
tanaman maupun hewan Spelling 1996, Cormack 1997, Ferna´ndez-A´balos
1998, Maor 1998. Modifikasi bentuk GFP dengan optimasi penggunaan kodon
24
dapat meningkatkan aktivitas fluoresen dan mengurangi photobleaching Cubbit 1995, Crameri 1996, Siemering 1996. Beberapa jenis GFP mengalami modifikasi
seperti sGFP yaitu dengan cara substitusi serin menjadi treonin pada asam amino ke-65 S65T dapat mengekspresikan protein dan dapat ditranslokasikan pada
genom eukariot. Beberapa keuntungan gen GFP sebagai penanda seleksi terutama pada sel
hidup dibandingkan penanda lainnya ialah seperti β-glucoronidase GUS,
chloramphenicol acetyltransferase CAT, β- galactosidase LacZ atau luciferase
LUC. Keuntungan tersebut meliputi stabilitas sedikit atau tanpa adanya photobleching
, tidak memerlukan kofaktor atau substrat untuk aktifitasnya, dapat berpendar dan dapat diamati langsung tanpa memerlukan protein substrat
ataupun kofaktor Chalfie et al. 1994.
Gen GFP
dapat diintegrasikan ke dalam genom cendawan melalui beberapa cara yaitu elektroforasi, penggunaan lithium asetat dan pembentukan
speroplas. Menurut Riach Kinghorn 1996, keberhasilan transformasi gen pada cendawan ditentukan oleh beberapa faktor yaitu produksi speroplas dan
regenerasinya, promotor dan vektor yang digunakan dalam proses tansformasi dan stabilitas integrasi gen tersebut.
Menurut Hashiba 1992 speroplas cendawan dapat diproduksi dengan mengggunakan enzim digesti. Tingkat efektifitas metode ini dipengaruhi oleh
tingkat pertumbuhan cendawan, waktu inkubasi dan jenis enzim yang digunakan. Plasmid merupakan molekul penting yang berperan pada teknologi
molekular DNA rekombinan. Plasmid berperan sebagai vektor pembawa gen GFP yang akan dimasukkan ke dalam sel inang. Ekspresi gen GFP di dalam sel inang
diatur oleh adanya promotor. Promotor yang cukup kuat telah dikembangkan dari fungi Aspergillus nidulans untuk ekspresi gen yang bertanggung jawab dalam
produksi protein ekstraselular. Promotor yang telah berhasil dikembangkan diantaranya ialah alcA, tpiA, toxA dan A. niger glukoamilase gla Cullen et al.
1991, Fowler et al. 1990, Sesma Osbourne 2004, Smith et al. 1990. Promotor- promotor tersebut telah digunakan secara efektif dalam tujuan-tujuan industri dan
studi genetika dari berbagai macam cendawan Sun et al. 2002.
25
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan pada bulan Februari 2006 sampai April 2007 di Laboratorium dan rumah kaca bagian Mikologi Gunung Gede, Departemen
Biologi FMIPA IPB dan Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi PPSHB IPB.
Bahan
Bahan yang digunakan ialah sampel akar tanaman dan tanah yang berasal dari lahan gambut Kalimantan Tengah dan kebun karet Jasinga Bogor, Jawa
Barat. Pengujian respon tumbuh tanaman inang oleh cendawan mutualistik akar menggunakan tanaman pertanian, kehutanan, perkebunan dan tanaman obat.
Pupuk Johnson digunakan sebagai perlakuan berbagai taraf P. Pewarna biru tripan dan gen GFP digunakan untuk analisis tahapan kolonisasi dan plasmid pCamb-
GFP digunakan sebagai vektor pembawa GFP.
Analisis molekular menggunakan primer spesifik sGFPf 5’-
CGACGTAAACGGCCACAAGT
-3’, sGFPr 5’-
GTCCATGCCGTGAGTGATCC
- 3’,
Nos f 5’-
GAATCCTGTTGCCGGTCTTGCG
-3’, dan Nosr 5’-
CGGGACTCTAATCATAAAAACC
-3’, digunakan untuk mengidentifikasi keberadaan gen penyandi sGFP dan terminator Nos dari genom cendawan
transgenik Aspergillus
-GFP serta primer Ubqf 5’-
CCAGGACAAGATGATGTGCC
-3’ dan Ubqr 5’-
AAGAAGCTGAAGCATCCAGC
- 3’ digunakan untuk mengamplifikasi gen penyandi ubiquitin sebagai kontrol
internal.
Metode Penelitian
Secara garis besar penelitian ini dibagi menjadi 2 bagian Gambar 2 yaitu : 1.
Isolasi dan penapisan cendawan mutualistik akar mikoriza dan non mikoriza hingga diperoleh isolat potensial untuk diuji pada berbagai
tanaman inang.
26
2. Analisis proses kolonisasi cendawan mutualistik akar dengan
menggunakan metode pewarna biru tripan dan gen penanda .
I Gambut dan Kebun karet
Tanah Akar
Isolasi dan penapisan cendawan mutualistik akar mikoriza
Gambar 2 Bagan alur penelitian Analisis respon tumbuh
tanaman inang isolat
cendawan mutualistik akar isolat CMA
Transformasi
Cendawan mutualistik akar-GFP
Speroplast
Proses kolonisasi
Analisis Kolonisasi Cendawan Mutualistik Akar Non Mikoriza GFP
Pewarna biru tripan
Penggunaan gen penanda GFP
Pewarna biru tripan Isolasi dan penapisan cendawan
mutualistik akar non mikoriza
II
Uji stabilitas gen GFP pada cendawan
27
A. Isolasi dan Penapisan Cendawan Mutualistik Akar