A. Isolasi dan Penapisan Cendawan Mutualistik Akar
Cendawan mutualistik akar non mikoriza diisolasi dari akar tanaman, sedangkan cendawan mikoriza diisolasi dari tanah rhizosfer yang berasal dari
tanah gambut Kalimantan Tengah dan tanaman karet Jasinga, Bogor. Penapisan cendawan mutualistik akar dilakukan dengan menggunakan tanaman Centrosema
pubescens sehingga diperoleh cendawan mutualistik akar mikoriza dan non
mikoriza yang memberikan respon terbaik untuk dilakukan analisis selanjutnya.
A.1. Cendawan Mutualistik Akar Non Mikoriza
Isolasi cendawan mutualistik akar non mikoriza dilakukan dengan metode sebagai berikut: akar tanaman dicuci menggunakan air dan dipotong dengan
ukuran panjang 1 cm. Akar kemudian disterilisasi permukaannya menggunakan alkohol 70 vv selama 1 menit dan NaOCl 0.1 vv selama 15 menit. Akar
kemudian dikeringkan dengan menggunakan tissue steril. Potongan akar ditempatkan dalam media Potato Dextrose Agar PDA yang mengandung
antibiotik kemisetin 500 mgl dan rose bengal 1 bv. Media tersebut diinkubasikan pada suhu ruang selama 7 hari. Miselium cendawan yang tumbuh
selanjutnya dimurnikan sampai didapatkan isolat murni. Cendawan yang berhasil diisolasi selanjutnya diuji pada tanaman
Centrosema pubescens untuk menentukan sifat simbiosisnya. Isolat cendawan
yang tidak menyebabkan gejala penyakit pada tanaman inang dan meningkatkan pertumbuhan akan digolongkan sebagai cendawan endofit mutualistik sedangkan
yang menyebabkan penyakit pada tanaman akan digolongkan sebagai cendawan parasit.
Masing-masing cendawan ditumbuhkan pada media PD Potato Dextrose cair, diinkubasi pada suhu ruang dengan agitasi 100 rpm selama 7 hari. Miselium
cendawan dipanen, lalu disaring menggunakan kertas saring steril dan diinokulasikan pada daerah perakaran tanaman Centrosema pubescens yang
berumur 1 minggu setelah tanam MST. Tanaman ditumbuhkan dengan menggunakan media zeolit dan dipelihara di dalam rumah kaca selama 3 bulan.
Respon tumbuh tanaman yang meliputi bobot basah dan bobot kering akar, bobot basah dan bobot kering tajuk serta persen kolonisasi cendawan pada akar tanaman
diamati.
28
A.2. Cendawan Mikoriza Arbuskula CMA
Cendawan mikoriza arbuskula diisolasi menggunakan metode penyuburan trapping. Selanjutnya spora tunggal dari campuran spora yang berasal dari
biakan pot penyuburan kemudian ditumbuhkan pada akar tanaman Centrosema pubescens
dan dipelihara di dalam rumah kaca selama 3 bulan dengan pemberian pupuk Johnson yang mengandung konsentrasi P setengah dosis. Setelah 3 bulan
pemeliharaan dilakukan analisa biakan pot dengan menghitung jumlah spora, identifikasi spora dan persentase kolonisasi CMA. Spora didapatkan dengan cara
menyaring media dengan saringan bertingkat Brundett et al. 1994. Spora yang baik dipilih dan diletakkan pada kaca obyek dengan media PVLG untuk
selanjutnya diidentifikasi Schenck Perez 1990. Analisis kolonisasi cendawan pada akar dilakukan setelah proses pewarnaan
dengan biru tripan Brundrett et al. 1994. Secara garis besar teknik pewarnaan
akar dilakukan dengan cara sebagai berikut: akar dicuci, direndam dalam KOH 10 vv, kemudian KOH dibuang, dan dicuci dengan air mengalir. Selanjutnya
direndam dalam HCl 2 vv selama 12 jam. Setelah itu HCl dibuang, dan terakhir akar diwarnai dengan pewarna biru tripan. Akar selanjutnya disimpan
dalam asam gliserol 50 vv sampai dilakukan pengamatan dan penghitungan persentase kolonisasi cendawan pada akar
B. Analisis Respon Tumbuh Tanaman Inang yang Diinokulasi Cendawan Mutualistik Akar