dulbecco’s modified eagle’s medium DMEM, fetal bovine serum FBS,
penicillin streptomycin, fungizone , trypsin
EDTA, trypan blue, phosphate buffered saline
PBS, MTT [3-4,5-dimethyl thiazol-2-yl-2-5-diphenyltetrazolium
bromide], acidified isopropanol, larutan NaCl, 8 glutaraldehyde, dan ethanol.
3.2.2 Alat
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah neraca analitik,
furnace, heating
plate ,
reaktor hidrotermal, buret, vacum, pH meter
digital, beaker glass, crucible, mortar, kertas saring, magnetic stirrer, aluminium
foil , gelas ukur, erlenmeyer, gamma
radiation sterilization dengan sumber
radiasi cobalt-60 Lampiran 6, 0.2 µm- sterile syiringe filter
Corning, Germany, 50 mL-syringe Terumo, Japan, tube 15
mL and 50 mL Falcon, USA, scrapper, mikropipet Eppendorf, Germany, tips
micropipette , tube eppendorf Axygen,
USA, hemocytometer
, inkubator
Memert, cell culture dish 35 mm×10 mm, 96-well plates NUNC, Denmark ,
mikroskop Nikon Elipse 80i, biohazard safety cabinet ESCO Micro PTE Ltd.,
water
bath ,
centrifugasi Sorvall,
vortexer Bio-rad BR 2000, shaker
Certomat, scanning electron microscope SEM, dan bio-rad microplate reader
benchmark visible spectrophotometer .
3.3 Prosedur Penelitian
Prosedur penelitian yang dilakukan terdiri atas 4 tahap yaitu sintesis BCP,
sintesis ACP, uji sitotoksisitas, dan karakterisasi. Penelitian ini diawali
dengan kalsinasi cangkang telur selama 5 jam
pada suhu
1000
o
C untuk
menghasikan CaO yang akan digunakan pada sintesis BCP dan ACP.
3.3.1 Sintesis BCP
Sintesis BCP dilakukan dengan metode hidrotermal. Larutan NH
4 2
HPO
4
0,67 M sebanyak 100 ml ditambahkan setetes demi setetes kedalam 100 ml
larutan CaO 1 M. Reaksi ini dilakukan pada suhu 300
o
C selama 8 jam dan diaduk dengan magnetic stirrer dengan kecepatan
putaran 300 rpm. Selanjutnya, hasil hidrotermal diendapkan selama 12 jam
pada suhu kamar dan disaring di dalam vakum. Sampel basah yang telah disaring
kemudian dikeringkan dalam furnace pada suhu 110°C selama 5 jam. Bubuk
kering yang diperoleh dihaluskan dengan mortar dan sintering pada 1000°C selama
6 jam.
3.3.2 Sintesis ACP
Sintesis ACP akan dilakukan dengan metode presipitasi suhu rendah. Seratus
mililiter NH
4 2
HPO
4
0,06 M akan ditambahkan setetes demi setetes ke
dalam 100 ml larutan CaO 0,1 M. Reaksi ini akan dilakukan selama 8 jam sambil
diaduk dengan magnetic stirrer pada kecepatan 300 rpm. Hasil presipitasi akan
disaring menggunakan vakum dan dikeringkan menggunakan freeze dryer
selama 2 x 24 jam.
3.3.3 Analisis Sitotoksisitas
Persiapan in vitro diawali dengan sterilisasi BCP dan ACP. Material
disimpan dalam botol kaca dan setiap botol terisi 2 mg lalu disterilisasi
menggunakan radiasi sinar gamma pada dosis 25 kGy. Sebelum melakukan
analisis in vitro seluruh alat dan bahan yang akan digunakan diseterilisasi dengan
menggunakan sinar ultraviolet UV selama 15 menit, dan seluruh prosedur
kerja dilakukan dalam biohazard cabinet.
3.3.3.1 Kultur Sel
Medium dasar untuk kultur sel adalah DMEM yang disuplemen dengan
10 FBS, penicillin streptomycin dan fungizone
. Semua komponen medium dasar tersebut dalam keadaan beku, untuk
itu perlu dicairkan terlebih dahulu menggunakan waterbath pada suhu 37°C
selama 15 menit. Sel fibroblas diambil dari tempat penyimpanan nitrogen cair
-198°C dan langsung diinkubasi di dalam medium dasar selama 24 jam pada
suhu 37°C. Selanjutnya, sel dicuci dengan
PBS dan ditambah de EDTA agar pelekatan
cawan lepas. Tryps waktu agar dapat be
diinkubasi kembali s sebelum dilakukan pr
dipindahkan ke tub ditambahkan medium da
kemudian disentrifugas 2000 rpm selama 10 me
terkonsentrasi menjadi supernatant
hasil sentri ditambahkan 5 ml me
proses homogenisasi beberapa kali agar terbe
Hasil homogenisa kedalam cawan petri
medium kultur lengkap cawan petri mencapai
tersebut dimasukan dal suhu 37
o
C selama 48 bertambah banyak, m
tersebut siap dipanen har
3.3.3.2 Menghitung K
Larutan sel seba 10 µl, dan 10 µl trypa
dalam 1,5 ml tabung epp dengan 1 ml trypsin
tan sel pada dasar psin membutuhkan
bekerja maka sel selama 10 menit
proses scrapping, ube
15 ml, dan dasar. Tube tersebut
asi dengan kecepatan menit 24°C agar sel
njadi pellet. Cairan ntrifugasi dibuang dan
edium dasar untuk i dengan pippeting
bentuk larutan sel. nisasi sel dipindahkan
ri dan ditambahkan ap hingga volum di
i 7 ml. Cawan perti dalam incubator pada
48 jam. Setelah sel maka sel fibroblas
harvesting .
ng Konsentrasi Sel
banyak 80 µl, FBS ypan blue
dicampur eppendorf
. 10 µl dari larutan
dalam tabu
dipindahkan pada papa glass
Gambar 7. Perhi dilakukan dalam papan
glass dibawah mikrosk
perbesaran 40x. Hemo mempunyai
bagian- menghitung sel seperti pa
B, C, D, dan E adalah dihitung secara di ba
optik. Perhitungan kons digunakan memenuhi per
Konsentrasi sel V
1
C
1
= V
2
C
2
Gambar 7 Skema pembagi hemocytometer g
Gambar 8 Skema 96-well plates MTT assay.
D C
A 7
abung eppendorf
pan hemocytometer rhitungan sel akan
pan hemocytometer oskop optik dengan
mocytometer glass -bagian
untuk pada Gambar 7. A,
lah letak sel yang bawah mikroskop
onsentrasi sel yang persamaan 3 dan 4:
10 10
5 3
4
gian pada papan r glass.
E B
Suspensi sel disiapkan dengan konsentrasi 2×10
5
selml dan dipindahkan pada 96 well plates sebanyak 1 ml setiap
well plate. Gambar 8 menunjukkan skema
percobaan sampel pengujian toksisitas. Serbuk BCP danACP dibubuhkan pada
well plates dan diinkubasi selama
1, 2, dan 3 hari pada setiap sampel sebagaimana skema yang ditunjukkan
pada Gambar 8. Tahap inkubasi dilanjutkan dengan pemberian larutan
MTT pada setiap well plate sebanyak 1 µl yang langsung diinkubasi kembali selama
3 jam. Serbuk MTT dilarutkan dengan menggunakan larutan NaCl. Tahap
selanjutnya adalah pemberian larutan isopropanol dan pengocokan dengan
menggunakan alat shaker selama 1 jam. Kode sampel A adalah sampel blank yang
hanya mengandung medium dasar, kode sampel B adalah sel dalam medium
kontrol, kode sampel C adalah sampel BCP yang dibubuhkan pada sel, kode
sampel D adalah sampel ACP yang dibubuhkan pada sel. Volum larutan sel
yang
dipersiapkan, yaitu
5 ml.
Konsentrasi sel yang diperoleh dari Persamaan 3 C
1
disetarakan dengan konsentrasi dan volum yang diinginkan
V
2
, C
2
menggunakan Persamaan 4 untuk memperoleh volume V
1
yang harus diambil dari 5 ml larutan sel.
Uji MTT assay menunjukkan nilai presentase perbandingan nilai absorbansi
dari sampel BCP dan ACP terhadap kontrol sebagai viabilitas fibroblas cell
line dengan menggunakan persamaan
In vitro Technologies sebagai berikut:
100 5
Jika presentase viabilitas sel jauh lebih kecil dari viabilitas sel kontrol,
maka material yang dipaparkan pada sel tersebut dinyatakan bersifat toksik.
24
3.3.3.3 Preparasi Sampel untuk
