Saran Isolasi, purifikasi, identifikasi, dan optimasi medium fermentasi antibiotik yang dihasilkan oleh aktinomisetes laut
bioactive microbial metabolites . New York: Kluwer Academic Publisher
Group. Crueger W, Crueger A. 1984. Biotechnology: A Textbook of Industrial
Microbiology , Madison: Science Tech. Inc Publishers.
Dan A, Szabo G. 1973. Induction production of beta-galactosidase in Streptomyces griseus
. Acta Biol Acad Sci Hung. 241:1-10. Das S, Lyla PS, Ajmal-Khan S. 2006. Marine microbial diversity and ecology:
importance and future perspective. Curr Sci 9010: 1325-1335. Daza A, Martin FJ, Dominguez A, Gil JA. 1989. Sporulation of several species of
Streptomyces in submerged culture after nutritional downshift. J.Gen
Microbiol 135: 2483-2491.
Demain AL. 2000. Small bugs, big business: The economic power of the microbe. Biotechnol adv
18:499-514. Desriani. 2003. Penapisan isolat Streptomyces sp penghasil protein penghambat
β- Laktamase Thesis. Bogor: Institut Pertanian Bogor, Program
Pascasarjana. Dewick PM.1997. Medicinal natural products, a biosynthetic approach. Third
avenue, New York, USA, 153-173. Dhanasekaran D, Selvamani S, Panneerselvam, Thajuddin. 2009. Isolation and
characterization of actinomycetes in Vellar Estuary, Annagkoil, Tamil Nadu. Afr J Biotechnol 817:4159-4162.
Dharmaraj S, Ashokkumar B, Dhevendaran K. 2010. Isolation of marine Streptomyces
and the evaluation of its bioactive potential. Afr J Microbiol Res
44: 240-248. Dhananjeyan V, Selvan N, Dhanapal K. 2010. Isolation, characterization,
screening and antibiotic sensitivity of actinomycetes from locally Near MCAS collected soil samples. J Biol Sci 106: 514-519.
Dunstan GH, Avignone–Rossa C, Langley D, Bushell ME. 2000. The Vancomycin biosynthetic pathway is induced in oxygen-limited
Amycolatopsis orientalis ATCC 19795 cultures that do not produce
antibiotic. Enzyme Microb Technol 277: 502-510.
Facciotti MCR, Schmidell W. 2004. The effect of dissolved oxygen concentration control on cell growth and antibiotic retamycin production in Streptomyces
olindensis so20 . Braz J Chem Eng 0221 185-192.
Feling RH, Buchanan GO, Mincer T J, Kauffman CA, Jensen PR, Fenical W. 2003. Salinosporamide A: a highly cytotoxic proteasome inhibitor from a
novel microbial source, a marine bacterium of the new genus Salinospora. Angew Chem Int Ed Engl
42:355-357. Furtado NAJC, Pupo MT, Carvalhho I, Campo VL, Duarte MCT, Bastos JK.
2005. Diketopiperazines produced by an Aspergillus fumigatus Brazillian strain. Braz Chem Soc 166B:1448-1453.
Garcia-Ochoa F, Gomez E. 2009. Bioreactor scale-up and oxygen transfer rate in microbial processes: An overview. Biotechnol Adv. 27:153–176
Glick BR, Pasternak JJ. 2003. Molecular biotechnology, principles and application of recombinant DNA
. Washington: ASM Press. Goodfellow. M.,1983. Ecology of Actinomycetes. Ann.Rev. Microbiol. 1983.
37:189-216. Goodfellow M, Haynes JA. 1984. Actinomycetes in marine sediment. Dalam
Ortiz-ortiz L, Bojalil LF, Vakoleff V ed. Biological, Biochemical, and Biomedical aspect of Actinomycetes.
Acad. Press Inc, Orlando.Fla. Goodfellow M, William ST. Mordarski M.1988. Actinomycetes in Biotechnology.
New York: Academic Press. Graz CJM, Hunt A, Jamie H, Grant G, Milne P. 1999. Antimicrobial activity of
selected cyclic dipeptide. Pharmazie. 5410: 772-5 Graz CJM, Grant GD, Brauns SCA, Hunt A, Jamie H, Milne PJ. 2000. CDPs in
the induction of maturation for cancer therapy. J Pharm Pharmacol 52: 75-
82. Guo Q, Daosen G, Zhao B, Xu J, Li R. 2007. Two cyclic dipeptides from
Pseudomonas fluorescens GcM5-1A carried by the pine wood nematode and
their toxicities to Japanese black pine suspension cells and seedlings in vitro. J Nematol
. 393: 243–247. Hanka LJ, Rueckert PW, Cross T. 1985. A method for isolating strains of the
genus Streptoverticillium from soil. FEMS Microbiol Lett.303: 365-368.
Haque R, Mondal S. 2010. Study on the development of high yielding neomycin resistant strain of streptomyces fradiae for improved production of
neomycin by using optimal levels of Minerals. Int.J.Drug Dev. Res. 21:33-39.
Hoque MM, Noor R, Nurun N, Khan MR, Khan ZUM. 2003. Maltase activity of Streptomyces roseolus isolated from Bangladesh soil. Bangladesh J
Bot .20:31-35
Haslam E.1986. Secondary Metabolism, fact or fiction. Nat. Prod. Rep 3: 217– 249.
Hassan MA, Moustafa Y, El-Naggar, Said WY. 2001. Physiological factors affecting the production of an antimicrobial substance by Streptomyces
violatus in batch cultures. Egypt J Biol. 3: 1-10.
Hayakawa M, Hideo N. 1987. Efficacy of artificial humic acid as a selective nutrient in HV agar used for the isolation of soil actinomycetes. J Ferment.
Technol 656: 609-616.
Hogg S. 2005. Essential microbiology. England: John Wiley and Son Inc. Horan AC. 1999. Secondary metabolite production, actinomycetes, other than
Streptomyces . Di dalam: Flickinger MC, Drew SW, editors. Encyclopedia
of bioprocess technology: fermentation, biocatalysis and bioseparation. New York: John Wiley Sons, Inc.
Hozzein WN, Ali MI, RabieW. 2008. A new prefential medium for enumeration and isolation of desert actinomycetes. World J Microbiol Biotechnol 24:
1547-1552. Hoskisson PA, Hobbs G, Sharples GP. 2000. Response of Micromonospora
echinospora NCIMB 12744 spores to heat treatment with evidence of a
heat activation phenomenon. Lett Appl Microbiol 30:14–117. Ibarz A, Castell-Perez E, Barbosa-Cánovas GV. 2005. Newtonian and Non-
Newtonian Flow. Di dalam: Barbosa-Cánovas, G.V. 2005. Food Engineering: Encyclopedia of Life Support Systems
. UNESCO. Iwen and Peter C. 2004. Identification of Microbial Pathogens Using Nucleic
Acid Sequenceing. LA: New Orleans.
James PDA dan Edwards C. 1997. The effects of temperature on growth and production of the antibiotic granaticin by a thermotolerant Streptomycete. J
Gen Microbiol 135: 1997-2003.
Judoamidjojo M, Abdul AD, Endang GS. 1992. Teknologi Fermentasi. Jakarta: Rajawali Press.
Kanoh K, Matsuo Y, Adachi K, Imagawa K, Nishizawa M, Shizuri Y. 2005. Mechercharmycins A and B, Cytotoxic Substances from Marine-derived
Thermoactinomyces sp. YM3-251. J Antibiot 584: 289–292.
Karwowski JP.1986. The selective isolation of Micromonospora from soil by cesium chloride density gradient ultracentrifugation. J Ind
Microbiol 1:186-181.
Kazakevich Y, Lobrutto R. 2007. HPLC for pharmaceutical scientists. New Jersey: A John Wiley Sons Inc.
Kelekom A. 2002. Secondary metabolites from marine microorganisms. Annals Brazil Acad Sci
741: 151–170. Kirk PL. 1950. Kjeldahl method for total nitrogen. Anal Chem 22 2: 354–358.
Kumar, Kannabiran K. 2010. Diversity and optimization of process parameters for the growth of Streptomyces VITSVK9 spp. isolated from Bay of Bengal,
India. J Nat Env Sci 12:9-18. Kuster E. 1958 The actinomycetes. di dalam: Burger A, Raw F. 1967. Soil
Biology . London: Acad Press.
Lam KM. 2006. Discovery of novel metabolites from marine Actinomycetes. Curr Opin Microbiol
9:245–251. Lautru S, Gondry M, Genet R, Pernodet JL. 2002. Biosynthesis of
diketopiperazine metabolites independent of nonribosomal peptide synthetases. Chem Biol 9:1355–1364.
Liang JG, Chu XH, Chu J, Wang YH, Zhuang YP, Zhang SI. 2010. Oxygen uptake rate OUR control strategy for improving avermectin B1a
production during fed-batch fermentation on industrial scale 150 m3. Afr J Biotechnol
942 7186-7191.
Liangzhi.L.I., Bin. Q.I.A.O., Yingjin Y. 2007. Nitrogen Sources Affect Streptolydigin Production and Related Secondary Metabolites Distribution
of Streptomyces lydicus AS 4.2501. Chin J Chem.Eng. 153:403-410. Locci R, Sharples GP. 1983 Morphology. di dalam: Goodfellow M., Mordarski
M, Williams ST. 1984. The biology of the actinomycetes. London: Academic Press.
Luckner M.1990. Secondary metabolism in plants and animals. Third edition. Berling: Springer Verlag.
Mangunidjaja. D dan Suryani A. 1994. Teknologi Bioproses. Jakarta: Penebar Swadaya.
Martin JF, Demain AL. 1980. Control of antibiotic biosynthesis. 1980. Microbiol Rev
. 230-251. Mason RL, Gunst RF, Hess JL. 1989. Statistical design and analysis of
experiments with applications to engineering and sciences. New York:
John Wiley Sons. Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of
reducing sugar. Anal Chem 31:426-428. Milne PJ, Oliver DW, Roos HM. 1992. Cyclodipeptides: Structure and
conformation of cyclotyrosyl--prolyl. J Crystallog Spect Res. 226:643-9, doi 10.1007.
Mincer TJ, William F, Paul RJ. 2005. Culture-dependent and culture-independent diversity within the obligate marine actinomycete genus Salinispora. Appl
Environ Microbiol 7111 P: 7019–7028.
Montgomery DC. 1997. Design and analysis of experiments. 4th Edition. New York: John Wiley and Sons.
Moat AG, Foster JW, Spector MP. 2002. Microbial physiology 4
th
edition . New
York: John Wiley Sons inc Publication. Morello JA, Paul AG, Helen EM. 2002. Laboratory manual and workbook in
microbiology applications to patient care . New York: The McGraw
−Hill Companies.
Nedialkova D and Mariana N. 2005. Screening the antimicrobial activity of actinomycetes strains isolated from Antartica. J Cult Collect. 4:29-35.
Okami Y, Hotta K. 1988. Search and discovery of new antibiotic, p.33-67. Di dalam: Goodfellow M, Williams ST, Mordarski M. Actinomycetes in
Biotechnology . New York: Academic Press. Inc.
Omura S.1986. Phylosophy of new drug discovery. Microbiol Rev 503 259-279. Pelaez F. 2006. The historical delivery of antibiotics from microbial natural
products-Can history repeat? Biochem Pharmacol 71: 981-990. Pisano MA, Michael JS, Madelyn ML. 1986. Application of pretreatments for the
isolation of bioactive actinomycetes from marine sediments. Appl Microbiol Biotechnol
25:285-288. Pisano MA, Sommer MJ, Brancaccio L. 1989. Isolation of bioactive
actinomycetes from marine sediments using rifampicin. Appl Microbiol Biotechnol
. 31:609-612. Prescott, Harley, Klein. 2002. Microbiology. Fifth Edition. New York: The
McGraw −Hill Companies.
PT. Data Consult. 2004. The market for parmaceutical products and materials in Indonesia. Jakarta: PT.Data Consult.
Rahayuningsihl M, Syamsu K, Darwis AA, Purnawati R. 2007. Penggandaan skala prouksi bioinsektisida Bacillus thuringiensis var . israelensi untuk
membasmi jentik nyamuk Aedes aegypti. J. Ilmu Pertanian Indonesia. 122:12-130.
Rhee KH. 2004. Cyclic dipeptides exhibit synergistic, broad spectrum antimicrobial effects and have anti-mutagenic properties
. Int J Antimicrob
Agent . 245:423–427.
Riegdlinger J, Reicke A, Zahner H, Krismer B, Bull AT, Maldanado LA, Ward AC, Goodfellow M, Bister B, Bischoff D. 2004. Abyssomicins, inhibitors
of the para-aminobenzoic acid pathway produced by the marine Verrucosispora
strain AB-18-032. J Antibiot 57:271-279. Ruohang W, Webb C. 1995. Effect of cell concentration on the rheology of
glucoamylase fermentation broth. Biotechnol Tech.9:55-58. Sanchez S et al. 2010. Carbon source regulation of antibiotic production. J
Antibiot 63: 442-459.
Seigler DS. 1998. Plant Secondary Metabolism. London: Kluwer Academic Publisher.
Seong CN, Ji HC, Keun-shik B. 2001. Improve selective isolation of rare actinomycetes from forest soil. J Microbiol 391: 17-23.
Shindo K, Michiko M, Hiroyuki K. 1995. Studies on cochleamycins, novel antitumor antibiotics. J Antibiot 493: 249-253.
Shuler ML Kargi F. 1992. Bioprocess engineering. New Jersey: Prentice-Hall Inc.
Sousa MFVQ, Lopes CE, Junior NP. 2001. A chemically defined medium production of Actinomycin D by Streptomyces parvulus. Brazilian arch
biol technol 44N3: 227-231.
Srinivasan MC., Laxman RS, Deshpande MV. 1991. Physiology and nutritional aspects of actinomycetes : an overview. World J Microbol Biotechnol 7:
171-184. Stanbury PF, Whitaker A. 1987. Principles of Fermentation Technology. New
York: Pergamon Press. Stierle A, Cardellina JH, Strobel GA. 1988. Maculosin, a host-specific
phytotoxin for spotted knapweed from Alternaria alternata. Proc Nat Acad Sci
. 8521: 8008-8011. Strohl W.1999. Secondary metabolites, antibiotic. Di dalam: Flickinger M,
Stephen WD. Encyclopedia: Bioprocess technology, fermentation, biocatalysis, and bioseparation.
Volumes 1-5. New York: John wiley and sons Inc.
Takahashi Y, Satoshi O.2003. Isolation of new actinomycete galurs for the screening of new bioactive compounds. J Gen Appl Microbiol 49:141-154.
Tanaka K. 2001. P-I3 - kinase p85 is a target molecule of proline-rich antimicrobial peptide to suppress proliferation of ras - transformed cells. Jpn
J Cancer Res. 92: 959-967.
Tarui N, Ikeura Y, Natsugari H, Nakahama K. 2001. Microbial synthesis of three metabolites of a tachykinin receptor antagonist, TAK-637. J Biosci
Bioeng. 923:285-287
Torssell KBG. 1997. Natural Product Chemistry; A mechanistic, biosynthetic and ecological approach.
Swedish: Apotekarsocieteten-Swedish Pharmaceutical Press.
Tuffile CM, Pinho F. 1970. Determination of oxygen transfer coefficients in viscous streptomycete fermentations. Di dalam: Stanbury PF, Whitaker A.
1987. Principles of Fermentation Technology. New York: Pergamon Press.
Ulgas KO, Mavituna F. 1993. Actinohordin production by Streptomyces coelicolor
A32: kinetic parameter related to growth, substrate uptake and production. Appl Microbiol Biotechnol 43:457-462.
Umezawa H, Takita T, Shiba T. 1978. Bioactive peptides produced by microorganisms
. New York: John Wiley Sons. Voelker dan Altaba. 2001. Nitrogen source governs the pattern of growth and
prostinamycein production in Streptomyces pristinaespiralis. Microbiol 147:2447-2459.
Vogel HC dan Todaro CL. 1996. Fermentation and biochemical engineering handbook; principles, process design and equipment.
New Jersey: Noyes Publications.
Wang DIC, Cooney CL, Demain AL, Dunhill P, Humprey AE, Lily MM. 1979. Fermentation and Enzym Technology
. London: Willey Interscience. Wirakartakusumah MA. 1989. Prinsip Teknik Pangan. PAU Pangan dan Gizi
IPB, Bogor. Yuwono dan Triwibowo. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction.
Perbit ANDI. Yogyakarta.
Lampiran 1 Kurva standar HPLC analitik untuk penentuan konsentrasi siklotirosil-prolil.
Kurva Standar HPLC siklotirosil-prolil
y = 16663x + 145389 R
2
= 0.99
0.00 10000000.00
20000000.00 30000000.00
40000000.00 50000000.00
60000000.00
500 1000
1500 2000
2500 3000
3500
Konsentrasi antibiotik mg.L
-1
L u
as ar ea
k ro
m ato
g ram
H P
L C
Konsentrasi siklotirosil-prolil
mg L
-1
Luas area kromatogram
HPLC 3250 54297969
1625 27028277 812,5 14223325
406,3 6364325 203,1 4037020
101,6 2024768
50,8 893794 25,4 292393
12,7 244598
Jenis kolom : Sunfire C18 column 4,6 x 250 mm,
Shiseido Co. Ltd., Tokyo, Japan Kondisi operasi :
Fasa gerak
: metanol-air
0-100 elusi linier gradien selama 25 menit, dilanjutkan elusi
isokratik 100 metanol selama 10 menit. Kecepatan alir
: 1 mL menit
-1
Volume injeksi : 10
μL Panjang gelombang detektor :
λ 210 nm Suhu
kolom :
30°C Tekanan kolom
: 1267 psi Detektor
: Photo Diode Array
PDA
Lampiran 2 Metode penentuan konsentrasi gula reduksi Miller 1959. Sebanyak 1 gram sampel dimasukkan ke dalam tabung reaksi 20 mL.
Kemudian ditambahkan 1 mL HCl 4 N dan dipanaskan pada penganas air selama 30 menit. Selanjutnya didinginkan dan dinetralkan dengan menambahkan 2 mL
NaOH 2 N. Sampel diencerkan sesuai dengan perkiraan konsentrasi gula pereduksi yang terdapat di dalam sampel. Selanjutnya sampel yang telah
diencerkan ini diambil sebanyak 1 mL dan dimasukkan ke dalam tabung reaksi 20 mL. Setelah itu ditambahkan 3 mL pereaksi DNS dan diinkubasi pada penangas
air bersuhu ± 100 °C selama 5 menit. Selanjutnya didinginkan dan diukur
konsentrasi gula pereduksinya dengan cara dibaca absorbansinya menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 550 nm. Sebagai blanko dibuat sama
seperti prosedur tersebut kecuali sampel diganti dengan akuades. Kurva standar dibuat menggunakan larutan glukosa standar pada kisaran 100-350 mg L
-1
. Kurva standar glukosa standar dibuat dengan membuat larutan glukosa
standar Merck pada beberapa konsentrasi antara lain dari konsentrasi 100 mg L
-1
sampai dengan 300 mg L
-1
. Adapun kurva standar glukosa yang ditelah dibuat disajikan sebagai berikut;
Absorbansi Konsentrasi
glukosa mg L
-1
0,159 100 0,348 150
0,552 200 0,748 250
0,916 300
y = 260.97x + 57.874 R
2
= 0.99
50 100
150 200
250 300
350
0.2 0.4
0.6 0.8
1
absorbansi k
ons e
nt ra
s i gul
a ppm
Lampiran 3 Metode penentuan konsentrasi nitrogen total Kirk 1950
Sebanyak 10 mL dari setiap pengambilan 30 mL sampel dianalisis untuk uji total nitrogen. Terlebih dahulu disentrifugasi dengan 8000 x g selama 15 menit
untuk memisahkan biomassanya, fase air dipisahkan dari biomassanya. Fase air ditimbang sebanyak kurang lebih 1 g di dalam tabung destruksi ditambahkan 1
butir selenium tablet dan 10 mL H
2
SO
4
pekat, kemudian didekstruksi dalam dekstruksi Kjeldahl sampai perubahan warna menjadi bening.
Larutan H
3
BO
4
4 dipipetkan sebanyak 25 mL ke dalam labu Erlenmeyer 250 mL. Setelah menjadi bening sampel kemudian didestilasi di destilasi Kjeldahl
dengan NaOH 40 berlebih sampai selesai. Selanjutnya dititrasi dengan larutan HCl 0,05 N sampai titik akhir. Hal yang sama dilakukan untuk blanko. Nitrogen
total dapat dihitung dengan menggunakan rumus:
N total wn = Vs-Vb x N HCl x 14,01 x 100 Bobot contoh
Dengan Vs sebagai volume HCl yang digunakan untuk titrasi sampel, Vb sebagai volume HCl yang digunakan pada titrasi blanko, dan N HCl sebagai normalitas
HCl.
Lampiran 4 Metode penentuan bobot kering sel. Voelker dan Altaba, 2001
Bobot kering sel ditentukan dengan mengikuti metode menurut Voelker dan Altaba 2001 yang dimodifikasi. Sebanyak 10 mL kaldu fermentasi dari
sampel disentrifuse dengan kecepatan 8000 x g selama 10 menit. Selanjutnya sel dipisahkan dengan filtratnya menggunakan kertas saring 0,22 µm Millipore dan
dicuci dengan menggunakan air demineral sebanyak dua kali. Sel dikeringkan pada suhu 110 °C selama selama 48 jam, selanjutnya dimasukkan dalam
desikator sampai diperoleh bobot konstan. Sel ditimbang dan diperoleh bobot kering sel per satuan volume.
Lampiran 5 Penentuan nitrogen total dan bobot bahan dari masing-masing sumber nitrogen yang digunakan untuk optimasi medium fermentasi
Penentuan nitrogen total dalam medium fermentasi yang digunakan dalam penelitian ini mengacu dari medium fermentasi yang digunakan oleh Kanoh et al.
2005, dengan komposisi sumber nitrogen 5 g L
-1
pepton dan 1 g L
-1
ekstrak khamir. Hasil analisis kandungan nitrogen total beberapa sumber nitrogen yang
digunakan dalam penelitian ini diperoleh data sebagai berikut;
No Sumber nitrogen
Kandungan nitrogen
1 Asam gutamat
C
5
H
9
NO
4
8,00 2 Pepton
13,21 3 Kasein
11,39 4 Ekstrak
Khamir 10,08
5 Amonium
SulfatNH
4 2
SO
4
3,59
Mengacu dari hasil analisis nitrogen total pepton dan ekstrak khamir tersebut diatas maka dalam 5 g pepton dan 1 g ekstrak khamir dalam setiap 1 l
medium diperoleh kandungan nitrogen total sebanyak 0,76 g. Dengan demikian bobot masing-masing sumber nitrogen yang digunakan dalam penyusunan
medium fermentasi adalah sebagai berikut;
No Sumber nitrogen
Bobot sumber nitrogen yang
dibutuhkan g L
-1
1 Asam gutamat
8,00 2 Pepton
5,76 3 Kasein
6,68 4 Ekstrak
khamir 7,55
5 Amonium
sulfatNH
4 2
SO
4
3,59
Lampiran 6 Urutan nukleotida fragmen gen isolat terpilih Streptomyces sp.A11 dan kedekatan homology yang dibandingkan dengan gen spesies
lainnya
CACCTTCGACAGCTCCCTCCCACAAGGGGTTGGGCCACCGGCTTCGGGTGTTACCGAC TTTCGTGACGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCAGCAAT
GCTGATCTGCGATTACTAGCAACTCCGACTTCATGGGGTCGAGTTGCAGACCCCAATC CGAACTGAGACCGGCTTTTTGAGATTCGCTCCGCCTCGCGGCATCGCAGCTCATTGTA
CCGGCCATTGTAGCACGTGTGCAGCCCAAGACATAAGGGGCATGATGACTTGACGTC GTCCCCACCTTCCTCCGAGTTGACCCCGGCAGTCTCCTGTGAGTCCCCATCACCCCGA
AGGGCATGCTGGCAACACAGAACAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACA TCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCACCACCTGTATACCGACCACAAGGGGG
GCACCATCTCTGATGCTTTCCGGTATATGTCAAGCCTTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCG TCGAATTAAGCCACATGCTCCGCTGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTT
AGCCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGGGAACTTAATGCGTTAGCTGCGGCACCGAC GACGTGGAATGTCGCCAACACCTAGTTCCCAACGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTA
TCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTAATGGCC
Lampiran 7 Kurva penentuan MIC senyawa aktif siklotirosil-prolil terhadap 4 bakteri uji
Lampiran 7a Kurva penentuan MIC senyawa aktif siklotirosil-prolil terhadap Escherichia coli
Pengukuran zona bening
I Pengukuran
zona bening II
Rata-rata diameter
zona bening x
x
2
logCkonsentrasi Konsentrasi
C senyawa aktif mg L
-1
12,21 12,11 12,16 147,8656
3,812913 6500 11,25 10,87 11,06
122,3236 3,511883 3250
9,89 9,95 9,92 98,4064
3,210853 1625 9,12 8,78 8,95
80,1025 2,909823 812,5
8,11 8,01 8,06 64,9636
2,608847 406,3 6,78 6,86 6,82
46,5124 2,30771 203,1
5,98 6,15 6,07 36,784225
2,006894 101,6 4,90 5,32 5,11
26,1121 1,703291 50,5
y = 0.017x + 1.4316 R
2
= 0.98
0.5 1
1.5 2
2.5 3
3.5 4
4.5
20 40
60 80
100 120
140 160
X
2
Log C
pada x=0 maka y= log C log C= 1,4316
LogC = Log MIC MIC =27,01
µg mL
-1
Lampiran 7b Kurva penentuan MIC senyawa aktif siklotirosil-prolil terhadap Staphylococcus aureus
ATCC 25923
Pengukuran zona bening
I Pengukuran
zona bening II
Rata-rata diameter
zona bening x
x
2
logC konsentrasi Konsentrasi
C senyawa aktif mg L
-1
7,95 8,21 8,08 65,2864
3,812913 6500 7,21 7,11 7,16
51,2656 3,511883 3250
6,14 5,96 6,05 36,6025
3,210853 1625 5,01 6,67 5,84
34,1056 2,909823 812,5
4,35 4,12 4,24 17,93523
2,608847 406,3 3,32 3,22 3,27
10,6929 2,30771 203,1
2,12 1,50 1,81 3,2761
2,006894 101,6 0,50 0,89 0,71
0,5041 1,703291 50,5
y = 0.0311x + 1.9042 R
2
= 0.97
0.5 1
1.5 2
2.5 3
3.5 4
4.5
10 20
30 40
50 60
70
x
2
log C
pada x=0 maka y= logC log C = 1,9042
Log C = Log MIC
MIC = 80,2 µg mL
-1
Lampiran 7c Kurva penentuan MIC senyawa aktif siklotirosil-prolil terhadap Bacillus subtilis
ATCC 66923
Pengukuran I zona
bening mm Pengukuran
II zona bening mm
Rata-rata diameter
zona bening x
x
2
logCkonsentrasi Konsentrasi
C senyawa aktif mg L
-1
9,51 8,91 9,21 84,82
3,812913357 6500
8,22 8,13 8,18 66,83
3,511883361 3250
7,12 6,89 7,01 49,07
3,210853365 1625
6,33 6,11 6,22 38,69
2,90982337 812,5
4,97 5,01 4,99 24,90
2,608846822 406,3
4,10 3,87 3,99 15,88
2,307709923 203,1
3,01 2,75 2,88 8,29
2,006893708 101,6
0,50 0,51 0,52 0,26
1,703291378 50,5
y = 0.0247x + 1.8675 R
2
= 0.97
0.5 1
1.5 2
2.5 3
3.5 4
4.5
20 40
60 80
1
X
2
Log C
00
pada x=0 maka y= logC log C= 1,8675
logC = LogMIC MIC =73,71 µg mL
-1
Lampiran 7d Kurva penentuan MIC senyawa aktif siklotirosil-prolil terhadap Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853
Pengukuran zona bening
I Pengukuran
zona bening II
Rata-rata diameter
zona bening x x
2
logCkonsentrasi Konsentrasi
C senyawa aktif mg L
-1
9,32 9,01 9,17 84 3,812913 6500 8,11 7,98 8,05
64,72 3,511883 3250
7,10 6,75 6,93 47,96
3,210853 1625 6,33 6,11 6,22
38,69 2,909823 812,5
5,14 5,10 5,12 26,21
2,608847 406,3 3,97 3,99 3,98
15,84 2,30771 203,1
3,12 3,32 3,22 10,37
2,006894 101,6 1,10 0,89 1,02
1,03 1,703291 50,5
y = 0.0256x + 1.8357 R
2
= 0.97
0.5 1
1.5 2
2.5 3
3.5 4
4.5
20 40
60 80
1
x
2
logC
00
pada x=0 maka y= log C log C= 1,837
log C = log MIC MIC = 68,71 µg mL
-1
Lampiran 7e Kurva penentuan MIC tetrasiklin terhadap Escherichia coli ATCC 25922
Pengukuran zona
bening I Pengukuran
zona bening II
Rata-rata diameter
zona bening
x x
2
logCkonsentrasi Konsentrasi
C senyawa aktif mg L
-1
9,08 9,23 9,16 83,8140
3,812913 6500 7,11 7,58 7,35
53,9490 3,511883 3250
7,01 7,15 7,08 50,1264
3,210853 1625 5,33 7,23 6,28
39,4384 2,909823 812,5
4,14 6,10 5,12 26,2144
2,608847 406,3 3,97 4,32 4,15
17,1810 2,30771 203,1
3,50 3,32 3,41 11,6281
2,006894 101,6 1,20 1,29 1,26
1,5876 1,703291 50,5
y = 0.0268x + 1.8064 R
2
= 0.95
0.5 1
1.5 2
2.5 3
3.5 4
4.5
20 40
60 80
1
X
2
Log C
00
pada x=0 maka y= log C log C= 1,8064
log C = log MIC MIC = 64 µg mL
-1
Lampiran 7f Kurva penentuan MIC tetrasiklin terhadap Staphylococcus aureus ATCC 25923
Pengukuran zona bening
I Pengukuran
zona bening II
Rata-rata diameter
zona bening x
x
2
logCkonsentrasi Konsentrasi
C senyawa aktif mg L
-1
5,39 5,01 5,20 27,0400
3,812913 6500 4,61 4,91 4,76
22,6576 3,511883 3250
3,81 3,96 3,89 15,0932
3,210853 1625 3,01 3,09 3,05
9,3025 2,909823 812,5
2,10 2,12 2,11 4,4521
2,608847 406,3
y = 0.0511x + 2.4082 R
2
= 0.99
0.5 1
1.5 2
2.5 3
3.5 4
4.5
5 10
15 20
25 30
x
2
log C
pada x=0 maka y= log C log C= 2,4082
log C = log MIC MIC = 256 µg mL
-1
Lampiran 7g Kurva penentuan MIC tetrasiklin terhadap Bacillus subtilis ATCC 66923
Pengukuran zona bening I
Pengukuran zona bening
II Rata-rata
diameter zona bening x
x
2
logCkonsentrasi Konsentrasi C
senyawa aktif mg L
-1
7,12 6,94 7,03
49,4209 3,812913357 6500
6,98 6,45 6,72
45,0912 3,511883361 3250
5,92 5,65 5,79
33,4662 3,210853365 1625
4,79 4,68 4,74
22,4202 2,90982337 812,5
3,52 3,72 3,62
13,1044 2,608846822
406,3 2,92 2,92
2,92 8,5264
2,307709923 203,1
y = 0.0332x + 2.1073 R
2
= 0.98
0.5 1
1.5 2
2.5 3
3.5 4
4.5
10 20
30 40
50 6
X
2
Log C
pada x=0 maka y= log C log C= 2,1073
log C = log MIC MIC = 128 µg mL
-1
Lampiran 7h Kurva penentuan MIC tetrasiklin terhadap Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853
Pengukuran zona
bening I Pengukuran
zona bening II
Rata-rata diameter
zona bening x x
2
logCkonsentrasi Konsentrasi C
senyawa aktif mg L
-1
14,32 14,26 14,29 204,2041
3,812913 6500
13,11 13,98 13,55 183,4670
3,511883 3250
12,10 12,75 12,43 154,3806
3,210853 1625
11,33 11,11 11,22 125,8884
2,909823 812,5
10,14 10,10 10,12 102,4144
2,608847 406,3
9,97 9,99 9,98 99,6004 2,30771
203,1 8,12 8,32 8,22
67,5684 2,006894
101,6 7,00 7,09 7,04
49,5616 1,703291
50,5
y = 0.0135x + 1.0968 R
2
= 0.98
0.5 1
1.5 2
2.5 3
3.5 4
4.5
50 100
150 200
250
x
2
logC
pada x=0 maka y= log C log C= 1,0968
log C = log MIC MIC = 12,5 µg mL
-1
Lampiran 8 Data perubahan parameter pH, gula reduksi, dan bobot kering sel kultur vegetatif menggunakan isolat Streptomyces sp. A11.
Jam ke-
Bobot kering sel
g L
-1
Gula reduksi
g L
-1
pH 0 0,22
10,22 7,65
8 0,62 9,57 7,56
16 2,06 8,15 6,90
24 3,29 6,51 6,65
32 4,45 4,52 6,51
40 5,35 3,21 6,12
48 6,35 2,37 5,94
56 6,86 1,79 5,85
64 6,85 1,51 5,80
Lampiran 9 Data perubahan parameter pH, gula reduksi, nitrogen total, bobot kering sel, dan konsentrasi siklotirosil-prolil pada proses fermentasi
menggunakan isolat Streptomyces sp.A11.
Jam ke-
Bobot kering sel g L
-1
Gula reduksi
g L
-1
pH Konsentrasi
siklotirosil- prolil mg L
-1
Nitrogen total mg L
-1
0 0,29 13,12 7,65
0,75 8 0,53 12,57
7,57 0,74
16 2,01 11,15 6,90
0,74 24 3,03 9,51
6,65 0,73
32 4,13 7,52 6,51
0,70 40 5,17 5,12
5,86 0,68
48 6,22 4,37 6,34
0,63 56 6,75 3,79
6,65 0,59
64 6,65 3,51 7,03 12,35
0,54 72 6,72 3,33
7,32 15,43 0,51
80 6,18 3,21 7,35 16,34
0,46 88 6,51 3,11
7,51 18,43 0,45
96 6,34 2,89 7,54 20,32
0,44 104 6,21 2,68 7,59 23,32
0,41 112 5,88 2,43 7,76 26,32
0,40 120 5,89 2,35 7,65 28,43
0,39 128 5,65 2,32 7,68 29,59
0,38 136 5,76 2,11 7,61 30,43
0,37 144 5,83 2,00 7,65 30,21
0,35
Lampiran 10 Penentuan laju pertumbuhan spesifik maksimal µmaks dan rendemen pembentukan biomassa per massa substrat Y
xs
Lampiran 10a Penentuan laju pertumbuhan spesifik maksimal µmaks
Waktu Jam
Bobot kering sel percobaan 1g L
-1
Bobot kering sel percobaan 2 g L
-1
Rata-rata X Ln
X 16 1,87
2,15 2,01 0,70
24 2,78 3,28 3,03
1,11 32 3,70
4,56 4,13 1,42
40 4,94 5,40 5,17
1,64
y = 0.0393x + 0.1166 R
2
= 0.98
0.2 0.4
0.6 0.8
1 1.2
1.4 1.6
1.8
10 20
30 40
waktu jam Ln
X
50
µmaks yang merupakan gradien dari kurva waktu jam versus lnX
menunjukkan nilai sebesar 0,04 Jam
-1
Lampiran 10b Penentuan rendemen pembentukan biomassa per massa substrat Y
xs
Waktu Jam X1 X2
Rata- rata X
S1 S2
Rata- rata S
X-Xo So-S
16 1,87 2,15
2,01 10,94
11,36 11,15 1,72 1,97
24 2,78 3,28
3,03 9,03
9,99 9,51 2,74 3,61
32 3,70 4,56
4,13 7,05
7,99 7,52 3,84 5,6
40 4,94 5,40
5,17 4,78
5,46 5,12 4,88 8
X1 = bobot kering sel percobaan 1 g L
-1
X2 = bobot kering sel percobaan 2 g L
-1
S1 = konsentrasi gula reduksi percobaan 1 g L
-1
S2 = konsentrasi gula reduksi percobaan 2 g L
-1
y = 0.6048x + 0.2973 R
2
= 0.97
1 2
3 4
5 6
1 2
3 4
5 6
7 8
So-S X
-X o
9
Y
xs
yang merupakan gradien dari kurva X-Xo versus So-S menunjukkan 0,60 gram biomassa per gram sumber karbon.
Lampiran 11 Analisis ragam dan uji lanjut Duncan perlakuan suhu fermentasi terhadap konsentrasi siklotirosil-prolil yang dihasilkan.
Aktvitas antbiotik mg L
-1
Variabel suhu
o
C Ulangan 1
Ulangan 2 Rataan Jumlah
26 12,35 10,23
11,29 22,58
28 19,98 21,96
20,97 41,94
30 29,76 30,89
30,33 60,65
32 25,21 23,76
24,49 48,97
34 19,37 20,34
19,86 39,71
total 213,85
FK 4573,18
JKP 387,91
JKT 394,28
ANOVA db JK KT F F0,05tabel
Pperlakuan 4 387,91 96,98
76,15 3,02 Ggalat
5 6,37
1,27 Ttotal
9 394,28
UJI DUNCAN 0,05
p=5 dbG=5 Ulangan=2
PembandingP-1 2 3 4 5 6
JND0,05 3,35 3,47
3,54 3,58
3,6 JNTJNDxSy 2,67
2,77 2,82
2,86 2,87
Suhu
o
C Konsentrasi
antibiotik mg L
-1
kode 26 11,29
a 34 19,86
b 28 20,97
c 32 24,49
d 30 30,33
e
Lampiran 12 Analisis ragam dan uji lanjut Duncan perlakuan pH awal medum fermentasi terhadap konsentrasi siklotirosil-prolil yang
dihasilkannya
Konsentrasi antibiotik mg L
-1
pH awal fermentasi
Ulangan 1 Ulangan 2
Rataan Jumlah 4 19,98 21,30
20,64 41,27
4,5 22,33 22,52 22,42
44,85 5 23,04 23,73
23,39 46,77
5,5 23,38 23,27 23,32
46,65 6 23,38 28,53
25,95 51,90
6,5 31,54 30,44 30,99
61,98 7 31,40 32,12
31,76 63,52
7,5 32,38 31,26 31,82
63,63 8 24,14 23,93
24,03 48,06
total 468,65
FK 12201,70 JKP 302,66
JKT 318,58 ANOVA db JK KT F
F0,05tabel Pperlakuan 8,00 302,66 37,83 21,39
3,02 Ggalat
9,00 15,92
1,77 Ttotal
17,00 318,58
UJI DUNCAN 0,05 p=9 dbG=9
Ulangan=2 Pembanding
P-1 2
3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 JND0,05
3,2 3,34 3,41 3,47 3,50 3,52 3,52 3,52
JNTJNDxSy 2,93
3,06 3,12 3,18 3,20 3,22 3,22 3,22
pH Konsentrasi
antibiotik mg L
-1
pH4 20,64 a
pH4,5 22,42 ab pH5,5 23,32 ab
pH5 23,39 ab
pH8 24,03 bc
pH7,5 31,82 bc pH6 25,95
cd pH7 31,76
d pH6,5 30,99 d
Lampiran 13 Analisis ragam dan uji lanjut Duncan penentuan sumber karbon terbaik pada proses fermentasi produksi siklotirosil-prolil dan
hasil analisis gula total sebelum dan sesudah fermentasi. Lampiran 13a Analisis ragam dan uji lanjut Duncan penentuan sumber karbon
terbaik pada proses fermentasi produksi siklotirosil-prolil
Konsentrasi antibiotik mg L
-1
Sumber karbon
Ulangan 1 Ulangan 2
Rataan Jumlah glukosa 22,83 23,17
23,00 46,00
maltosa 25,34 25,25 25,29
50,59 laktosa 13,12 12,57
12,84 25,69
sukrosa 14,51 13,58 14,05
28,09 molase 18,67 12,33
15,50 30,99
dekstrin 27,14 29,68 28,41
56,82 total
238,19 FK 4727,84
JKP 429,15 JKT 453,10
ANOVA db JK KT F F0,05tabel Pperlakuan 5 429,15 85,83 21,50 3,02
Ggalat 6
23,96 3,99
Ttotal 11
453,10 UJI DUNCAN 0,05
p=6 dbG=6 ulangan=2
PembandingP-1 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
JND0,05 3,15 3,30 3,37
3,43 3,46 3,47 JNTJNDxSy
3,74 3,92 4,01 4,08 4,11 4,12
Sumber karbon Konsentrasi antibiotik
mg L
-1
Kode Laktosa 12,84
a Sukrosa 14,05
a Molase 15,50
a Glukosa 23,00
bc Maltosa 25,29
cd Dekstrin 28,41
d
Lampiran 13b Hasil analisis gula total dari beberapa sumber karbon sebelum dan sesudah fermentasi.
Sumber karbon
Konsentrasi antibiotik
mg L
-1
Konsentrasi sumber karbon
awal mg L
-1
S0 Konsentrasi
sumber karbon akhir mg L
-1
S1 Jumlah
konsumsi mg
S0-SS0 x 100
Rasio Konsentrasi
siklo tirosil- prolil
terhadap total konsumsi
sumber karbon
Laktosa 12,84
a
12504 8470 4034
32,26 0,00318 Sukrosa 14,05
a
9196 4794 4402
47,87 0,00319 Molase 15,50
a
5909 976 4933
83,47 0,00314 Glukosa 23,00
bc
10577 830 9747
86,05 0,00224 Maltosa 25,29
bc
11842 2433 9409
79,45 0,00269 Dekstrin 28,41
d
10979 2406 8573
78,08 0,00331
Lampiran 14 Analisis ragam dan uji lanjut Duncan penentuan sumber nitrogen terbaik pada proses fermentasi produksi siklotirosil-prolil dan
hasil analisis nitrogen total sebelum dan sesudah fermentasi. Lampiran 14a Analisis ragam dan uji lanjut Duncan penentuan sumber nitrogen
terbaik pada proses fermentasi produksi siklotirosil-prolil
Konsentrasi antibiotik mg L
-1
Sumber nitrogen 1 2
Rataan Jumlah Ekstrak khamir
13,10 12,65
12,88 25,75
Pepton 23,06 22,34
22,70 45,39
Amonium sulfat 0,00
0,00 0,00
0,00 Kasein 20,17
23,12 21,65
43,29 Asam glutamat
9,74 10,25
9,99 19,98
Total 134,42
FK 1806,98 JKP 691,76
JKT 696,61
ANOVA db JK KT F F0.05tabel
Pperlakuan 4,00 691,76 172,94 178,34 3,02
Ggalat 5,00
4,85 0,97
Ttotal 9,00
696,61 UJI DUNCAN 0,05
p=5 dbG=5 ulangan=2
PembandingP-1 2,00 3,00
4,00 5,00
6,00 JND0,05 3,35
3,47 3,54
3,58 3,60
JNTJNDxSy 2,80 2,90
2,95 2,99
3,00
Sumber Nitrogen Konsentrasi antibiotik mg L
-1
Amonium sulfat a
Asam glutamat 9,99
b Ekstrak khamir
12,88 b
Kasein 21,65 c
Pepton 22,70 c
Lampiran 14b Hasil analisis nitrogen total dari beberapa sumber nitrogen sebelum dan sesudah fermentasi
Nitrogen total awal
fermentasi mg.mL
-1
Nitrogen total akhir
fermentasi mg.mL
-1
Konsentrasi siklotirosil-
prolil mg L
-1
Jumlah konsumsi
nitrogen total mg.mL
-1
Asam glutamat C
5
H
9
NO
4
0,76 0,44 9,99 0,32 Pepton 0,76
0,35 22,70
0,41 Kasein
0,75 0,34
21,65 0,41
Ekstrak khamir 0,74
0,30 12,88
0,44 Amonium sulfat NH
4 2
SO
4
0,75 0,55 0,20
Lampiran 15 Analisis ragam dan uji lanjut Duncan penentuan mineral terbaik pada proses fermentasi produksi siklotirosil-prolil.
Konsentrasi antibiotik mg L
-1
Jenis mineral Percobaan 1
Percobaan 2 rataan
jumlah Mineral I
35,23 35,76
35,50 70,99
Mineral II 31,23
32,12 31,68
63,35 Mineral III
33,22 32,98
33,10 66,20
Mineral IV 31,75
31,76 31,76
63,51 Mineral V
26,54 25,43
25,99 51,97
Blanko 25,13 24,32
24,73 49,45
total 365,47
ANOVA db JK KT F
F0.05tabel Pperlakuan 5 176,78
35,36 140,54
3,22 Ggalat
6 1,51
0,25 Ttotal
11 178,29
p=6 dbG=6 ulangan=2
Pembanding P-1 2
3 4
5 6
JND0,05 3,46 3,58
3,64 3,68
3,68 JNTJNDxSy 1,25 1,29 1,31
1,33 1,33
perlakuan Nilai tengah notasi
Blanko 24,73 a Mineral V
25,99 b
Mineral II 31,68
c Mineral IV
31,76 c
Mineral III 33,10
d Mineral I
35,50 e
FK 11130,69 JKP 176,78
JKT 178,29
Lampiran 16 Respon hasil percobaan optimalisasi proses produksi siklotirosil-prolil menggunakan isolat Streptomyces sp.A11
Dekstrin g L
-1
Pepton g L
-1
Mineral mL Notasi
X
1
X
2
X
3
X
1
X
2
X
3
Respon Predicted
value Residual
Gula reduksi
fermentasi g L
-1
Gula reduksi
akhir fermentasi
g L
-1
Konsumsi gula g L
-1
awal- akhir
Rasio respon terhadap
konsumsi gula 25 8 5 -1
-1 -1
19,13 17,19
1,94 27,99 8,87 19,12
1,00 35 8 5 1
-1 -1
19,96 20,15
-0,19 37,78 17,19 20,59
0,97 25 12 5 -1
1 -1
23,19 24,64
-1,45 28,22 7,15 21,07
1,10 35 12 5 1
1 -1
40,35 36,28
4,07 38,26 15,32 22,94
1,76 25 8 10
-1 -1
1 20,59
23,72 -3,13
27,94 7,98 19,96
1,03 35 8 10
1 -1
1 30,99
28,61 2,38 37,89 14,32 23,57
1,31 25 12 10 -1
1 1
35,67 34,54
1,13 28,17 5,56 22,61
1,58 35 12 10 1
1 1
47,11 48,11
-1,00 38,21 15,21 23,00
2,05 21,6 10 7,5
-1,68 26,00
24,65 1,35 23,12 5,43 17,69
1,47 38,4 10 7,5
1,68 35,88
38,56 -2,68 43,11 17,23 25,88
1,39 30 6,64 7,5 0
1,68 16,74
16,89 -0,15 31,98 12,46 19,52
0,86 30 13,36 7,5 0
1,68 0 38,37 39,55 -1,18 33,24 10,34
22,90 1,68
30 10 3,3 0 -1,68
2,90 23,05
-2,15 33,13 10,35 22,78
0,13 30 10
11,7 1,68
39,31 38,49
0,82 33,21 9,35 23,86
1,65 30 10 7,5 0
47,56 47,40
0,16 33,32 9,87 23,45
2,03 30 10 7,5 0
47,71 47,40
0,31 33,11 9,92 23,19
2,06 30 10 7,5 0
47,88 47,40
0,48 33,31 10,21 23,10
2,07 30 10 7,5 0
46,94 47,40
-0,46 33,21 10,14 23,07
2,03 30 10 7,5 0
47,19 47,40
-0,21 33,16 9,88 23,28
2,03 30 10 7,5 0
47,36 47,40
-0,04 33,14 9,78 23,36
2,03
Lampiran 17 Keluaran hasil analisis data menggunakan Design Expert 7 pada proses optimasi produksi siklotirosil-prolil.
Lampiran 17a Keluaran Design Expert 7 dan respon yang diperoleh
Lampiran 17b Keluaran design summary dan respon yang diperoleh
Lampiran 17 c Keluaran hasil analisis fit summary dari Design Expert 7
Lampiran 17d Keluaran hasil analisis variansi ANOVA dari DesignExpert 7
Lampiran 17e Keluaran variabel hasil optimasi menggunakan DesignExpert 7
Lampiran 18 Data pengamatan konsentrasi siklotirosil-prolil dan konsumsi gula pada proses verifikasi model percobaan di laboratorium.
Percobaan Konsentrasi
siklotirosil-prolil mgL
-1
Konsumsi gula gL
-1
Ulangan 1 49,32
22,05 Ulangan 2
50,81 23,82
Ulangan 3 48,83
21,76 Ulangan 4
51,20 23,28
Rata-rata 50,04 22,73
Rasio pembentukan siklotirosil-prolil terhadap konsumsi gula adalah sebesar 2,20 mg siklotirosil-prolil per gram gula.
ABSTRACT
ROFIQ SUNARYANTO. Isolation, Purification, Identification, and Fermentation Medium Optimization of Antibiotic Produced by Marine
Actinomycetes. Under direction of TUN TEDJA IRAWADI, ZAINAL ALIM MAS’UD, LIESBETINI HARTOTO, BAMBANG MARWOTO.
Isolation and purification of active compounds produced by marine actinomycetes has been carried out. Marine sediment samples were obtained from
3 different places in Banten West Coast, Cirebon North Coast, and Yogyakarta South Coasts. A total of 40 actinomycetes isolates were obtained 4 isolates were
active against Escherichia coli ATCC 25922, 5 isolates were active against Staphylococcus aureus
ATCC25923, 4 isolates were active against Bacillus subtilis
ATCC 66923, 4 isolates were active against Pseudomonas aeroginosa ATCC27853, 4 isolates were active against Candida albican BIOMCC00122, and
4 isolates were active against Aspergillus niger BIOMCC00134. A11 isolate showed the most active to Gram-positive and Gram-negative bacteria. Species
identification using 16S rRNA gene sequencing showed that A11 isolate is Streptomyces
sp. Elucidation of its molecular formula and structure using LC-MS,
1
H NMR,
13
C NMR, and
13
C DEPT NMR showed the antibiotic was cyclotyrosyl-prolyl, molecule formula was C
14
H
16
N
2
O
3
which has a melting point of 140 °C. Minimum Inhibitory Concentration MIC of the antibiotic was determined
against 4 bacterial test strains, namely Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853, Staphylococcus aureus ATCC 25923, and Bacillus subtilis ATCC 66923, which were inhibited at 27, 69, 80, and 74 µg
mL
-1
, respectively. Fermentation profile of Streptomyces sp. A11 showed a lag phase which
occurred until 8 hours, a log phase from 9 until 48 hours and a stationary phase from 48 until 144 hours. The growth phase showed maximum specific growth rate
μ of 0.04 hour and the rate of substrate conversion into biomass Y of 0.6
max -1
xs
gram biomass per gram substrate. The optimum temperature and pH of cyclotyrosyl-prolyl fermentation were 30 °C and 6.5-7.5, respectively.
Optimum composition of fermentation medium was determined with three independent variables: dextrin as a carbon source, peptone as nitrogen source, and
a mixture of mineral salts using Response Surface Methodology. The results showed that the three variables significantly affected the activity of cyclotyrosyl-
prolyl. Peptone gave the strongest effect compared to dextrin and mineral salts. Interaction was found between dextrin and peptone. On the contrary, no
interaction was observed between peptone and mineral salts, and between dextrin and mineral salts. Using a mathematical model, the most optimum composition of
the medium were found to be dextrin 32.55 g L , peptone 11.22 g L , and
-1 -1
mineral salt 8.65 mL, in which 51.54 g L cyclotyrosyl-prolyl was produced.
-1
Verification of the model in laboratory showed the cyclotyrosyl-prolyl activity to be 50.04 mg L . Thus, the difference between the result of the experiment and
-1
the expected response value was 2.9. Keywords: marine actinomycetes, antibiotic, Streptomyces, cyclotyrosyl-prolyl.
RINGKASAN
ROFIQ SUNARYANTO. Isolasi, Pemurnian, Identifikasi, dan Optimasi Medium Fermentasi Antibiotik yang Dihasilkan oleh Aktinomisetes Laut.
Dibawah bimbingan TUN TEDJA IRAWADI, ZAINAL ALIM MAS’UD, LIESBETINI HARTOTO, BAMBANG MARWOTO
Kebutuhan antibiotik, anti fungal, maupun anti kanker baru masih sangat diperlukan, terutama yang efektif melawan bakteri resisten, virus, protozoa, fungi
atau kanker. Untuk mendapatkan antibiotik baru, para peneliti telah banyak melakukan berbagai cara seperti eksplorasi senyawa aktif dari mikroba,
tumbuhan, maupun sintesis secara kimia. Salah satu mikroba yang banyak diteliti untuk diambil senyawa aktifnya adalah aktinomisetes.
Indonesia merupakan negara kepulauan yang memiliki bentangan laut yang luas, kurang lebih 3,1 juta km
2
atau hampir 2 kali lipat dibandingkan luas daratannya. Karakteristik laut yang bermacam-macam mengindikasikan
biodiversitas hayati yang besar, khususnya biodiversitas mikroba laut. Namun demikian potensi ini belum banyak dimanfaatkan. Penelitian ini bertujuan untuk
mendapatkan senyawa aktif yang berpotensi sebagai antibiotik dan memproduksinya dalam skala laboratorium yang dihasilkan oleh aktinomisetes
laut melalui isolasi, penapisan, pemurnian, identifikasi dan optimasi medium fermentasi.
Telah dilakukan isolasi dan penapisan aktinomisetes laut yang mampu menghasilkan senyawa antibakteri. Sampel sedimen laut diambil dari 3 tempat
berbeda yaitu di Pantai Barat Banten, Pantai Utara Cirebon, dan Pantai Selatan Yogyakarta. Hasil percobaan menunjukkan bahwa pra-perlakuan dengan
pemanasan dan pengasaman sampel serta penambahan sikloheksimid 100 μg mL
- 1
, nistatin 25 μg mL
-1
, asam nalidiksat 20 μg mL
-1
, dan rifampisin 5 μg mL
-1
mampu menekan pertumbuhan bakteri dan kapang kontaminan. Total hasil isolasi diperoleh dari sampel sedimen laut sebanyak 40 isolat aktinomisetes. Penapisan
dengan menggunakan 6 macam mikroba uji diperoleh 4 isolat yang mampu menghambat pertumbuhan Escherichia coli ATCC 25922, 5 isolat menghambat
Staphylococcus aureus
ATCC25923, 4 isolat menghambat Bacillus subtilis ATCC 66923, 4 isolat menghambat Pseudomonas aeroginosa ATCC27853, 4 isolat
menghambat Candida albican BIOMCC00122, dan 4 isolat menghambat Aspergillus niger
BIOMCC00134. Isolat A11 menunjukkan isolat yang memiliki daya hambat paling kuat
terhadap bakteri Gram-positif dan Gram-negatif sehingga isolat tersebut dipilih untuk penelitian selanjutnya. Hasil identifikasi menggunakan 16S rRNA
menunjukkan bahwa isolat A11 adalah Streptomyces sp. homology 100 kelas
Actinobacteria , ordo Actinomycetales, famili Streptomycetaceae, dan genus
Streptomyces. Fermentasi isolat A11 dilakukan selama 144 jam dengan menggunakan
medium khamir-pepton. Dari kaldu fermentasi diperoleh bobot kering sel, ekstrak sel dengan metanol, dan ekstrak supernatan dengan etil asetat berturut-turut
sebanyak 4,73 g L
-1
, 2,72 g L
-1
, 0,33 g L
-1
. Hasil uji aktivitas antimikroba bioassay menunjukkan bahwa ekstrak aktif hanya terjadi pada ekstrak
supernatannya saja, hal ini menunjukkan bahwa senyawa aktif dihasilkan secara ekstraselular. Ekstrak supernatan yang terbukti memiliki aktivitas antimikroba
selanjutnya dipurifikasi dengan menggunakan kromatografi kolom dan HPLC preparatif, selanjutnya dilakukan elusidasi struktur molekulnya. Hasil analisis
menggunakan LC-MS diketahui senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat A11 memiliki bobot molekul sebesar 260 g mol
-1
, rumus molekul C
14
H
16
N
2
O
3.
Hasil elusidasi struktur molekul menggunakan
1
HNMR,
13
C NMR, DEPT
13
C NMR, dan FTIR diketahui senyawa aktif yang dihasilkan oleh Streptomyces sp.A11
adalah siklotirosil-prolil. Senyawa aktif ini memiliki titik leleh sebesar 140
o
C. Minimum Inhibitory Concentration
MIC ditentukan menggunakan 4 mikroba uji dengan metode difusi agar kertas cakram. Hasil percobaan
menunjukkan bahwa senyawa aktif yang dihasilkan oleh Streptomyces sp.A11 memiliki MIC terhadap Escherichia coli ATCC 25922 sebesar 27
μg mL
-1
, Pseudomonas aeruginosa
ATCC 27853 sebesar 69 μg mL
-1
, Staphylococcus aureus
ATCC 25923 sebesar 80 μg mL
-1
, and Bacillus subtilis ATCC 66923 sebesar 74
μg mL
-1
. Profil fermentasi isolat Streptomyces sp. menunjukkan fase lag terjadi
sampai dengan jam ke-8, fase pertumbuhan cepat fase logaritma terjadi pada selang waktu jam ke-9 sampai dengan jam ke-48, dan fase stasioner terjadi pada
selang waktu jam ke-48 sampai dengan jam ke-144. Pada fase pertumbuhan cepat fase logaritma laju pertumbuhan maksimum
μ sebesar 0,04 jam dan
maks -1
rendemen pembentukan biomassa per massa substrat Y sebesar 0,6 g biomassa
xs
per massa substrat. Senyawa aktif diproduksi setelah memasuki fase stasioner yaitu mulai jam ke-60 yang menunjukkan bahwa senyawa aktif yang dihasilkan
tergolong dalam metabolit sekunder.
Penentuan suhu optimum pada proses fermentasi untuk menghasilkan siklotirosil-prolil dilakukan dalam rentang suhu 26 sampai dengan 34 °C. Hasil
percobaan menunjukkan bahwa suhu 30 °C merupakan suhu terbaik untuk proses fermentasi siklotirosil-prolil. Penentuan pH optimum proses fermentasi
siklotirosil-prolil dilakukan pada rentang pH 4 sampai dengan pH 8. Hasil percobaan menunjukkan bahwa kisaran pH 6,5 sampai dengan pH 7,5 adalah
kisaran pH terbaik untuk proses fermentasi siklotirosil-prolil.
Optimasi medium fermentasi dilakukan dengan menggunakan Response Surface Methodology
. Variabel bebas yang digunakan adalah dekstrin sebagai sumber karbon, pepton sebagai sumber nitrogen, dan mineral. Respon yang
ditentukan adalah konsentrasi siklotirosil-prolil. Hasil penelitian menunjukkan bahwa ketiga variabel bebas yang digunakan dalam proses optimasi medium
fermentasi ini menunjukkan pengaruh nyata terhadap siklotirosil-prolil. Model matematik yang diperoleh dalam optimasi medium fermentasi ini menghasilkan
variabel bebas optimum sebagai berikut; konsentrasi dekstrin, pepton, dan mineral berturut-turut sebesar 32,55 g L , 11,22 g L dan 8,65 mL, dengan dugaan respon
-1 -1
yang diperoleh sebesar 51,54 g L . Hasil validasi model yang dilakukan di
-1
laboratorium menunjukkan konsentrasi siklotirosil-prolil yang dihasilkan pada proses fermentasi selama 144 jam sebesar 50,04 g L . Perbedaan respon dugaan
-1
yang diperoleh dari model dengan nilai hasil percobaan sebesar 2,9 menunjukkan bahwa model yang digunakan telah sesuai.
Kata kunci: aktinomisetes laut, antibiotik, Streptomyces, siklotirosil-prolil.
I PENDAHULUAN