Penapisan Aktinomisetes Penghasil Antimikroba

a b Gambar 6 Morfologi isolat Streptomyces sp. A11. a. Morfologi Streptomyces sp. A11dengan perbesaran 40x b. Morfologi Streptomyces sp. A11 tanpa perbesaran. Menurut Awad et al. 2009 morfologi Streptomyces sp. dapat dilihat dari hifa antena aerial hyphae, miselium substrat, bentuk permukaan koloni, dan warna. Namun demikian identifikasi melalui morfologi saja tidak menunjukkan hasil yang memuaskan, sehingga perlu dilakukan identifikasi secara genetik Annaliesa et al. 2001. Menurut Srinivasan et al. 1991 morfologi Streptomyces, khususnya pada hifa antena aerial hyphae dan miselium substrat bersifat karakteristik namun demikian dapat berubah bentuknya tergantung dari komposisi substrat. Identifikasi secara genetik dilakukan dengan menggunakan 16S rRNA. Analisa partial sekuens 16S rRNA dari isolat A11 dibandingkan dengan sekuens seluruh bakteri yang ada didalam database Gen-Bank dengan menggunakan program BLAST yang diakses dari website http:www.ncbi.nlm.nih. gov. BLAST. Dengan menggunakan 16S rRNA diperoleh informasi bahwa isolat A11 memiliki kekerabatan terdekat dengan Streptomyces sp. homology 100 kelas Actinobacteria , ordo Actinomycetales, famili Streptomycetaceae, dan genus Streptomyces. Urutan nukleotida fragmen gen dan kedekatan homology yang dibandingkan dengan gen spesies lainnya disajikan dalam Lampiran 6. Analisis dengan pohon filogenik Gambar 7 yang dikumpulkan dari beberapa data spesies genus Streptomyces diketahui bahwa isolat ini mempunyai kedekatan dengan S. tanashiensis subsp.cephalomyceticus yang dikenal banyak menghasilkan senyawa antimikroba. Isolat S. tanashiensis subsp. cephalomyceticus dikenal mampu mensintesis TAK-637 tachykinin receptor antagonist Tarui et al. 2001. Jika dibandingkan dengan Streptomyces indonesiaensis yang berasal dari Indonesia, isolat A11 justru lebih dekat dengan S. tanashiensis subsp. Cephalomyceticus, S. Microflavus, S. Africanus, Parastreptomyces abscessus , dan Streptoallomorpha polyantibiotica. Gambar 7 Pohon filogenik isolat A11 yang didentifikasi sebagai Streptomyces sp. Setelah dilakukan identifikasi secara morfologi dan filogenik pada isolat Streptomyces sp. A11, tahap selanjutnya adalah mengetahui aktivitas antibakteri yang dimiliki oleh isolat tersebut. Uji aktivitas antibakteri dilakukan pada ekstrak supernatan maupun ekstrak biomassanya. Ekstrak aktif ditunjukkan pada ekstrak supernatan dan tidak ditunjukkan pada ekstrak biomassa Tabel 7. Hal ini menunjukkan bahwa senyawa aktif yang diproduksi oleh isolat A11 bersifat ekstraselular. Hasil uji aktivitas antimikroba menunjukkan bahwa isolat A11 merupakan isolat yang memiliki aktivitas antibakteri paling kuat, baik bakteri Gram-positif maupun Gram-negatif Gambar 8. A B C D Gambar 8 Daya hambat senyawa aktif terhadap A Bacillus subtilis ATCC 66923, B Escherichia coli ATCC 25922, C Staphylococcus aureus ATCC25923, D Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 Tabel 7 Uji aktivitas antimikroba ekstrak supernatan dan biomasa hasil fermentasi isolat Streptomyces sp. A11 Diameter zona bening mm Sampel Uji Staphilococcus aureus ATCC 25922 Bacillus subtilis ATCC 66923 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 Escherichia coli ATCC 25922 Candida albicans BIOMCC0 0122 Aspergillus niger BIOMCC00 134 Ekstrak biomasa - - - - - - Ekstrak supernatan 10,39 24,43 9,64 9,55 - - kontrol rifampisin 500 ppm 21,27 44,57 10,08 10,12 - - Diameter kertas cakram : 6 mm Hal yang sama ditunjukkan pada kromatogram HPLC, yaitu kromatogram hasil analisis ekstrak biomassa tidak menunjukkan adanya puncak, sedangkan kromatogram hasil analisis ekstrak supernatan menunjukkan beberapa puncak yang salah satu puncak tersebut adalah senyawa aktif. Kromatogram hasil analisis ekstrak biomassa dan supernatan disajikan dalam Gambar 9. Pada tahap selanjutnya ekstrak yang digunakan untuk proses pemurnian dan elusidasi struktur molekul hanya digunakan ekstrak supernatannya saja. b AU 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 Minutes 5.00 10.00 15.00 20.00 12 .10 4 a menit menit Gambar 9 Kromatogram hasil analisis ekstrak supernatan a dan biomassa b yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11

IV.4. Pemurnian dan Identifikasi Senyawa Aktif yang Dihasilkan oleh

Streptomyces sp.A11 Sebanyak 5 l kaldu fermentasi yang telah mengalami perlakuan sonifikasi untuk memecah sel, disentrifugasi pada kecepatan 14000 x g selama 15 menit. Sel beserta supernatan dipisahkan, dan masing-masing diekstraksi dengan pelarut organik dan dikeringkan sampai diperoleh bobot konstan. Sebanyak 5 l kaldu fermentasi diperoleh bobot kering sel sisa ekstraksi sebanyak 4,73 g L -1 , bobot kering ekstrak sel dengan metanol sebanyak 2,72 g L -1 dan bobot kering ekstrak supernatan dengan etil asetat sebanyak 0,33 g L -1 . Ekstrak supernatan yang terbukti menunjukkan aktivitas antimikroba selanjutnya dipurifikasi dengan menggunakan kromatografi kolom dan HPLC preparatif. Fraksi-fraksi yang dihasilkan dalam proses purifikasi dengan kromatografi kolom dan HPLC prepratif ditampung dan masing-masing fraksi diuji aktivitas antibakterinya untuk menentukan fraksi mana yang memiliki aktivitas. Selanjutnya untuk mengetahui profil kromatogram hasil pemurnian maka fraksi aktif dianalisis menggunakan HPLC analitik. Hasil HPLC analitik menggunakan kolom Water Column symmetry C18 4,6 x 250 mm, Part No.WAT054275 menunjukkan bahwa senyawa aktif hasil pemurnian memiliki kemurnian yang relatif tinggi Gambar 10a. Senyawa aktif ini dicirikan dengan waktu retensi 12,1 menit dan memiliki serapan maksimum pada panjang gelombang 210 dan 274,5 nm Gambar 11b. Menurut Kumar et al. 2009 sebagian besar antibiotik golongan peptida memiliki serapan panjang gelombang maksimum pada 210-230 dan 270-280 nm. Serapan pada panjang gelombang 220-230 nm berhubungan dengan karakteristik serapan ikatan peptida. Kromatogram HPLC analitik dan spektrum serapan UV vis antibiotik yang telah dimurnikan disajikan dalam Gambar 10a 10b. a AU 0.00 1.00 2.00 Minutes 5.00 10.00 15.00 20.00 12 .0 6 1 AU 0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 nm 250.00 300.00 350.00 210.6 274.5 b menit a Gambar 10 a Kromatogram HPLC analitik senyawa aktif murni hasil isolasi. b Spektrum serapan UV vis senyawa aktif murni hasil isolasi. Senyawa aktif murni yang diperoleh selanjutnya ditentukan bobot molekul dan struktur molekulnya menggunakan LC-MS, 1 HNMR, 13 C NMR, DEPT 13 C NMR, dan FTIR. Dari hasil analisis menggunakan LC-MS diketahui bahwa senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat A11 memiliki bobot molekul sebesar 260 g mol -1 , pada LC-MS mz M+H + ditunjukkan sebesar 261 Gambar 11 . Dari database program LCT Premier-XE Waters menunjukkan bahwa senyawa ini memiliki 14 atom karbon, 16 atom hidrogen, 2 atom nitrogen, dan 3 atom oksigen. Gambar 11 Spektrum LC-MS mz 261 M+H + senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11. Selanjutnya hubungan tata letak atom karbon dan atom hidrogen ditentukan menggunakan 1 HNMR, 13 CNMR, DEPT 13 CNMR. Spektrum 1 HNMR yang diperoleh dari Bruker AV-500 500 MHz dengan tetramethylsilane TMS sebagai standar internal dalam pelarut metanol-D4 dan memberikan data sebagai berikut; δ H : 4,4 t, 1H, 4,01H, dd, 2,1 2H, m, 1,8 2H, m, 3,5 2H, dd, 3,1 2H, dd, 7,0 2H, d, 6,7 2H, d, dan δ C : 170,8 s, 58,0 d, 167,0 s, 60,1 d, 29,4 t, 22,5 t, 45,9 t, 37,7 t, 127,7 s, 132,1 d, 116,3 d, 157,7 s. Spektrum 1 HNMR dan 13 CNMR ditunjukkan pada Gambar 12a dan 12b.

12. a

12.b Gambar 12 Spektrum 1 HNMR a dan spektrum 13 CNMR b senyawa aktif yang dihasilkan oleh isolat Streptomyces sp.A11.