Identifikasi Mikroba Menggunakan 16S rRNA
tiap mikroba prokariot. Sehingga daerah 16S rRNA digunakan untuk mengklarifikasi makhluk hidup ke dalam kelompok yaitu archaea, bakteri, dan
prokarya. Ribosomal RNA rRNA merupakan salah satu jenis molekul RNA yang unik disamping duta RNA mRNA dan transfer RNA tRNA. RNA
berperan dalam pembentukan kerangka ribosom yang merupakan organel penting dalam proses translasi RNA menjadi asam amino Gick dan Pasternack 2003.
Saat ini RNA telah banyak dijadikan sebagai sumber analisis filogenik dan pengklasifikasian makluk hidup. Hal ini disebabkan molekul rRNA bersifat
homologi baik secara fungsional maupun evolusinya pada organisme yang berbeda Broun-Howland et al. 1992.
Tahapan dasar untuk identifikasi molekuler dengan menggunakan analisis sekuen adalah sebagai berikut;
1. Isolasi DNA atau RNA.
Deoxyribonucleic acid atau disingkat DNA merupakan bahan penyusun
gen, yaitu penurun sifat yang meneruskan informasi dari induknya Campbell et al. 2002. DNA terdapat di dalam inti sel terutama pada
kromosom. Molekul DNA juga ditemukan pada organel-organel sel seperti sel pada mitokondria dan kloroplas. Ada beberapa tahapan dalam
melakukan isolasi DNA, pertama isolasi jaringan, pelisisan dinding sel ekstraksi DNA, dan presipitasi. Presipitasi dilakukan untuk
mengendapkan protein sehingga terpisah dari ikatan DNA. 2.
PCR Polymerase Chain Reaction. Reaksi polimerasi berantai atau lebih dikenal dengan PCR merupakan
suatu metode amplifikasi fragmen DNA secara cepat dan dapat menghasilkan DNA dalam jumlah besar. Secara prinsip PCR merupakan
proses berulang, setiap siklusnya dibagi menjadi 3 tahapan, yaitu pertama tahap denaturasi yaitu DNA terputus dan membentuk DNA rantai tunggal,
kedua tahap penempelan annealing, yaitu primer menempel pada bagian DNA template yang berkomplementer urutan basanya, ketiga tahap
amplifikasi, yaitu tahap penggandaan. Setelah tahap ketiga selesai, maka akan terjadi lagi secara berulang secara terus menerus. Tahapan ini terus
berulang 20 sampai dengan 30 kali Yuwono dan Triwibowo 2006.
3. Elektroforesis Gel.
Elektroforeses gel merupakan suatu teknik untuk memisahan makromolekul DNA atau protein berdasarkan ukuran dan muatan
listrikCambell et al. 2002. Setiap bakteri memiliki 16S rRNA yang merupakan suatu sub unit dari RNA ribosom. Gen 16S rRNA memiliki
nukleotida yang relatif pendek yaitu sekitar 1500 bp. Munculnya pita band tunggal pada daerah 1500 bp, maka dapat diketahui bahwa gen 16
S rRNA telah diamplifikasi. 4.
Sekuensing. Metode sekuensing merupakan metode pengurutan basa nukleotida pada
DNA dan mendapatkan data berupa ukuran nukleotida dari fragmen DNA. Sekuensing DNA akan menghasilkan sekuen yang digambarkan sebagai
untaian abjad lambang nukleotida-nukleotida penyusun DNA, yaitu ”A” nukleotida berbasa adenin, ”T”nukleotida berbasa timin, ”G”nukleotida
berbasa guanin, dan ”C”nukleotida berbasa sitosin. Campbell et al. 2002.
5. BLAST Basis Local Aligment and Search Tool.
Basis data merupakan kumpulan informasi yang disimpan di dalam komputer secara sistematik sehingga dapat diperiksa menggunakan
program komputer untuk memperoleh informasi basis data tersebut. Salah satu basis data untuk BLAST adalah NCBI yang merupakan Gen Bank.
Data ini dapat dibuka melalui website http:www.ncbi.nih.nlm.gov
yang dapat digunakan untuk membandingkan hasil gen yang telah disekuen.