Hidrolisa Prosedur yang digunakan untuk hidrolisis asam dari flavonoid glikosida adalah, Spektroskopi Ultraviolet UV-Vis

proses akhir pelarut akan berdifusi keluat dari sel bersama dengan metabolit Sarker, 2007. Ekstraksi dianggap selesai bila tetesan terakhir memberikan reaksi negatif terhadap senyawa yang diekstraksi. Untuk mendapatkan larutan ekstrak pekat, biasanya pelarut ekstrak diuapkan dengan menggunakan alat rotari evaporator Harborne, 1996.

2.6.2 Partisi

Metode pemisahan yang mungkin paling sederhana adalah partisi, yang banyak digunakan sebagai tahap awal pemurnian ekstrak.Partisi menggunakan dua pelarut tak bercampur yang ditambahkan kedalam ekstrak tersebut, hal ini dapat dilakukan secara terus menerus dengan menggunakan dua pelarut yang tak bercampur yang kepolarannya meningkat. Partisi biasanya dilakukan melalui dua tahap: 1. Airpetroleum eter ringan heksana untuk menghasilkan fraksi nonpolar di lapisan organik 2. Airdiklorometan atau airkloroform atau airetil asetat untuk membuat fraksi agak polar di lapisan organik. Ini merupakan metode pemisahan yang mudah dan mengandalkan kelarutan bahan alam dan bukan interaksi fisik dengan medium lain Heinrich et al, 2009.

2.6.3 Hidrolisa Prosedur yang digunakan untuk hidrolisis asam dari flavonoid glikosida adalah,

sebanyak 2 mg sampel flavonoid glikosida dicampur dengan asam klorida 6 sebanyak 5 ml dengan jumlah metanol yang sangat sedikit pada sampel untuk membuat proses hidrolisis menjadi sempurna. Larutan dipanaskan selama 45 menit lalu didinginkan, kemudian ekstrak sepenuhnya dilarutkan dengan eter. Penguapan dari larutan akan mengendapkan ramnosa dan glukosa. Lapisan eter, setelah dikeringkan dengan menggunakan natrium sulfat akan didapatkan aglikon flavonoid setelah diuapkan Mabry et al, 1970. Dengan cara ini berbagai jenis glikosida dapat saling dibedakan dan bila terjadi pemutusan gula, aglikon, gugus basil dan lain-lain dapat dipisahkan dan diidentifikasi. Universitas Sumatera Utara

2.6.4 Kromatografi

Saat ini kromatografi adalah teknik pemisahan yang paling umum dan sering digunakan dalam bidang kimia analisis dan dimanfaatkan untuk analisis baik secara kualitatif dan kuantitatif atau bahkan analisis preparatif. Teknik kromatografi telah berkembang dan digunakan untuk memisahkan dan mengkuantifikasi komponen- komponen yang kompleks, baik organik maupun anorganik Sudjadi, 2007. Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan yang pertama kali dipakai untuk memisahkan zat-zat warna tanaman.Pemisahan dengan teknik ini dijalankan dengan mengadakan manipulasi atas dasar perbedaan sifat-sifat fisik dari zat-zat yang menyusun suatu campuran Adnan, 1997. Semua teknik kromatografi pada dasarnya menggunakan dua fasa, yaitu fasa tetap dan fasa bergerak. Pemisahan tergantung pada gerakan relatif dari kedua fasa tersebut. Kromatografi dapat digolongkan sesuai dengan sifat dari fasa tetap, jika berupa zat padat dikenal sebagai kromatografi serapan absorption chromatography dan jika berupa zat cair dikenal sebagai kromatografi partisi partition chromatography Sastrohamidjojo, 1985. Proses Sorpsi Sorpsi merupakan proses pemindahan solut dari fasa gerak ke fasa diam, sedangkan proses sebaliknya pemindahan solut dari fasa diam ke fasa gerak disebut desorpsi. Keduanya terjadi secara terus-menerus selama pemisahan karena sistem kromatografi berada dalam keadaan kesetimbangan dinamis. Solut akan terdistribusi diantara dua fasa yang sesuai dengan perbandingan distribusinya untuk menjaga keadaan yang setimbang. Beberapa mekanisme yang terlibat pada proses sorpsi yaitu adsorpsi, partisi, pertukaran ion, dan eksklusi ukuran. Adsorben Silika gel merupakan jenis adsorben fase diam yang penggunaannya paling luas. Permukaan silika gel terdiri atas gugus Si-O-Si dan gugus silanol Si-OH. Gugus silanol bersifat sedikit asam dan polar sehingga dapat membentuk ikatan hidrogen dengan solut-solut yang agak polar sampai sangat polar. Universitas Sumatera Utara Adanya air dari atmosfer yang diserap oleh permukaan silika gel mampu mendeaktifkan permukaannya karena air akan menutup sisi aktif silika gel. Hal ini dapat diatasi dengan memanaskan pada suhu 105 C, meskipun demikian reprodusibilitasnya sulit dicapai kecuali jika suhu dan kelembapan benar-benar dijaga secara hati-hati. Semakin polar solut maka akan semakin tertahan kuat ke dalam adsorben silika gel ini Sudjadi, 2007.

2.6.4.1 Kromatografi Lapis Tipis

Dalam kromatografi lapis tipis, fase diamnya merupakan penjerap berukuran kecil dengan diameter partikel antara 10-30µm. Semakin kecil ukuran partikel fase diam, maka semakin baik kinerja efisiensi dan resolusi kromatografi lapis tipis. Penjerap yang sering digunakan adalah silika dan serbuk selulosa, sementara mekanisme sorpsi yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorbsi. Fase gerak yang dikenal sebagai pelarut pengembangakan bergerak sepanjang fase diam akibat adanya pengaruh kapiler pada pengembangan secara menaik ascending ataupun pengaruh gravitasi pada pengembangan secara menurun descending Sudjadi, 2007. 2.6.4.2Kromatografi Kolom Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada bagian atas kolom penjerap yang berada dalam tabung kaca. Pelarut sebagai fasa gerak dibiarkan mengalir melalui kolom. Pita senyawa pelarut bergerakmelalui kolom dengan laju berbeda, memisah, dan dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari alas kolom Gritter, 1991. Untuk menghasilkan data yang ada manfaatnya, kecepatan elusi harus dibuat konstan.Kecepatan elusi tergantung dari ukuran partikel bahan isian, dimensi dari kolomnya, viskositas cairannya dan tekanan yang dipakai untuk mengalirkan zat pelarut Adnan, 1997. Universitas Sumatera Utara 2.6.5 Kristalisasi Kristalisai adalah pengendapan kristal dari larutan yang terbuat dari bhan tertentu. Selama proses pembentukan kristal, molekul akan cenderung menjadi melekat kristal tumbuh terdiri dari jenis yang sama molekul karena cocok dalam kisi kristal untuk molekul struktur yang sama daripada molekul yang lain. Jika proses kristalisasi diperbolehkan untuk terjadi dalam mendekati kondisi kesetimbangan, preferensi molekul untuk deposit pada permukaan terdiri dari molekul seperti akan menyebabkan peningkatan dalam kemurnian bahan kristal. Sehingga proses rekristalisasi adalah salah satu metode yang paling penting tersedia bagi ahli kimia untuk pemurnian padatan Pasto, 1992. 2.6.5.1 Rekristalisasi Amorf yang diperoleh dari hasil isolasi dilarutkan kembali dengan EtOAc, diaduk hingga semua amorf larut sempurna.Kemudian ditambahkan n – heksana secara perlahan – lahan hingga pembentukan kembali senyawa yang lebih murni dari sebelumnya dan jatuh di dasar wadah.Didekantasi larutan bagian atas wadah. Lalu diuapkan sisa pelarut dari amorf hingga diperoleh kristal yang benar – benar bebas dari pelarut Jacobs, 1974. 2.7 Teknik Spektroskopi Teknik analisis spektroskopi berasaskan antaraksi radiasi elektromagnet dengan komponen atom atau molekul yang menghasilkan fenomena bermakna sebagai parameter analisis. Pada spektroskopi pembangkit sinyal adalah hasil antaraksi energi radiasi elektromagnet dengan elektron dalam atommolekul analit. Teknik analisis spektroskopi berasaskan antaraksi radiasi elektromagnet dengan komponen atom atau molekul yang menghasilkan fenomena bermakna sebagai parameter analisis. Karena pada setiap teknik spektroskopi antaraksi radiasi elektromagnet dengan komponen atom molekul khas dan tidak semuanya sama, uraian teknik analisis didahului dengan mekanisme antaraksi tersebut, serta fenomena yang dipakai sebagai parameter analisisnya Satiadarma , 1995.

2.7.1 Spektroskopi Ultraviolet UV-Vis

Penyerapan sinar ultraviolet dan tampak oleh suatu molekul organik akan menghasilkan transisi diantara tingkat energi elektronik pada molekul tersebut. Transisi tersebut pada umumnya antara orbital ikatan atau orbital pasangan electron bebas orbital anti ikatan Supratman, 2010. Universitas Sumatera Utara Spektrofotometer UV-Vis merupakan pengukuran panjang gelombang dan intensitas sinar ultraviolet dan cahaya tampak yang diabsorbsi oleh sampel.Spektrofotometer UV-Vis umumnya digunakan untuk menentukan jenis kromofor, ikatan rangkap terkonjugasi, serta menganalisis senyawa organik secara kuantitatif dengan menggunakan hukum Lambert-Beer Dachriyanus, 2004. Penyerapan sinar ultraviolet dan tampak oleh suatu molekul organik akan menghasilkan transisi diantara tingkat energi elektronik pada molekul tersebut, dan karenanya sering dinamakan spektrometri elektronik. Panjang gelombang serapan merupakan ukuran perbedaan tingkatan-tingkatan energi transisi elektronik dari orbital tersebut. Ciri spektrum khas spektrumialah kekuatan nisbi yang rendah pada pita I dalam dihidroflavon, dihidroflavonol, dan isoflavon serta kedudukan pita I pada spektrum kalkon, auron, dan antosianin yang terdapat pada panjang gelombang yang tinggi. Ciri ini nisbi tak berubah bahkan juga bila pola oksigenasi berubah, sekalipun rentang maksimal serapan pada jenis flavonoid yang berlainan tumpang tindih sebagai keragaman pola oksigenasi. Petunjuk mengenai rentang maksima utama yang diperkirakan untuk setiap jenis flavonoid yang disajikan pada tabel 2.1 Markam,1988 dibawah : Tabel 2.1 Rentangan Serapan Spektrum UV-Visible golongan Flavonoida No Pita II nm Pita I nm Jenis Flavonoida 1 250-280 310-350 Flavon 2 250-280 330-360 Flavonol 3-OH tersubstitusi 3 250-280 350-385 Flavonol 3-OH bebas 4 245-274 310-330 bahu Isoflavon 5 275-295 300-330 bahu Flavanon dan dihidroflavonol 6 230-270 kekuatan rendah 340-390 Khalkon 7 230-270 kekuatan rendah 380-430 Auron 8 270-280 465-560 Antosianidin dan antosianin Universitas Sumatera Utara Perubahan penyulihan pada cincin A cenderung tercerminkan pada serapan pita II, sedangkan perubahan penyulihan pada cincin B dan C cenderung lebih jelas tercermin pada serapan pita I. 2.7.2Spektroskopi InframerahFT-IR Spektrofotometer inframerah umumnya digunakan untuk menentukan gugus fungsi senyawa organik dan mengetahui informasi struktur suatu senyawa organik dengan membandingkan daerah sidik jarinya. Pengukuran spektrum inframerah dilakukan pada daerah cahaya tengah mid- infrared yaitu pada panjang gelombang 2.5 – 50µm atau bilangan gelombang 4000 – 200 cm -1 . Sehingga energi yang dihasilkan oleh radiasi ini akan menyebabkan vibrasi atau getaran pada molekul. Setiap jenis ikatan kimia dan gugus fungsi memiliki pita absorbsi inframerah yang khas dan spesifik. Karakteristik frekuensi vibrasi IR dipengaruhi oleh perubahan yang sangat kecil pada molekul sehingga sulit untuk menentukan struktur yang hanya berdasarkan pada data IR saja. Spektrum IR berguna untuk mengidentifikasi suatu senyawa dengan membandingkannya dengan spektrum senyawa standar terutama pada daerah sidik jari. Secara praktikal, spektrum IR hanya dapat digunakan untuk menentukan gugus fungsi Dachriyanus, 2004. Suatu ikatan dalam sebuah molekul dapat mengalami berbagai vibrasi molekul. Secara umum terdapat dua tipe vibrasi molekul, antara lain: 1. Streching vibrasi regangulur : vibrasi sepanjang ikatan sehingga terjadi perpanjangan atau pemendekan ikatan. 2. Bending vibrasi lenturtekuk : vibrasi yang disebabkan oleh sudut ikatan sehingga terjadi pembesaran atau pengecilan sudut ikatan. Oleh karena itu suatu ikatan tertentu dapat menyerap energi lebih dari satu panjang gelombang. Contohnya, ikatan O-H menyerap energi pada frekuensi 3330 cm - 1 , energi pada panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi regang ikatan O- H itu. Suatu ikatan O-H itu juga menyerap pada kira-kira 1250 cm -1 , energi pada Universitas Sumatera Utara panjang gelombang ini menyebabkan kenaikan vibrasi lentur. Tipe vibrasi yang berlainan ini disebut cara vibrasi fundamental Supratman, 2010.

2.7.3 Spektroskopi Resonansi Magnetik Inti Proton