BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Alat-alat
1. Spektrofotometer
1
H-NMR JeolDelta2NMR
500MHz 2. Spektrofotometer FT-IR
Shimadzu 3. Spektrofotometer UV-Vis
4. Rotarievaporator Buchi R-114
5. Labu Rotarievaporator 1000 mL SchootDuran
6. Ekstraktor 5000 mL SchootDuran
7. Kolom Kromatografi Pyrex
8. Alat Destilasi 9. Lampu UV
254 nm356 nm UVGL 58 10. Neraca Analitis
Mettler AE 200 11. Corong Kaca
12. Corong Pisah 500 mL Pyrex
13. Gelas Ukur Pyrex
14. Labu Takar 250 mL
Pyrex 15. Tabung Reaksi
Pyrex 16. Botol Vial
15 mL 17. Gelas Erlenmeyer
Pyrex 18. Gelas Beaker
Pyrex 19. Statif dan Klem
20. Penangas Air 21. Batang Pengaduk
22. Chamber 23. Pipa Kapiler
24. Spatula 25. Pipet Tetes
Universitas Sumatera Utara
3.2 Bahan-Bahan
1. Daun Senduduk Merah 2. Metanol
Destilasi 3. Etil Asetat
Teknis 4. N-Heksana
Teknis 5. Kloroform
Teknis 6. Aquadest
7. Pereaksi Benedict 8. HCl 6
9. FeCl
3
5 10. NaOH 10
11. Serbuk Mg 12. HCl
p
13. H
2
SO
4p
14. Kapas 15. Silika Gel
70-230 mesh ASTM E.Merck. KgA 16. Plat KLT silika gel 60 F
254
E.Merck.Art 554
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun tumbuhan senduduk merah yang diperoleh dari Lau Debuk-debuk, Desa Semangat Gunung, Berastagi, Kabupaten Karo, Sumatera
Utara.Daun senduduk merah dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun senduduk merah sebanyak 1600 g.
Universitas Sumatera Utara
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Senduduk Merah
Serbuk daun senduduk merah diidentifikasi dengan menggunakan cara uji Fitokimia. Untuk membuktikan adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun senduduk
merah maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna sebagai
berikut:
1. Dimasukkan ± 10 gram serbuk daun senduduk merah yang telah dikeringkan ke dalam dua gelas Erlenmeyer
2. Ditambahkan 25 mL metanol ke dalam gelas Erlenmeyer 3. Didiamkan selama 1 jam
4. Disaring 5. Dimasukkan ekstrak sampel ke dalam tabung reaksi
6. Ditambahkan pereaksi FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam 7.
3.3.3 Ekstraksi Daun Tumbuhan Senduduk Merah
Serbuk daun Senduduk Merah ditimbang sebanyak 1600 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 10 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama
24 jam. Maserat ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol.Kemudian diuapkan hingga semua pelarut
metanol menguap. Lalu dilakukan pemisahan tanin dengan cara melarutkan fraksi pekat metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian di rotarievaporator lalu
diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap.Lalu fraksi pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol dan di ekstraksi partisi berulang-ulang dengan n-heksana
sampai lapisan n-heksana bening.Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga
diperoleh ektrak pekat lapisan metanol.Fraksi metanol di uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict, lalu dihidrolisis dengan menggunakan HCl 6 sambil di panaskan
diatas penangas air selama ± 1 jam.Kemudian disaring dan filtrat yang diperoleh di ektraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali. Ekstrak kloroform dipekatkan
dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 1,4 g.
Universitas Sumatera Utara
3.3.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak kloroform dengan menggunakan fase diam silika gel 60F
254
Merck. Analisis ini bertujuan untuk mencari sistem dan perbandingan pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom. Fasa gerak
yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 vv.
Dimasukkan 10 ml campuran larutan fase gerak n-heksana: etil asetat 90:10 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Di totolkan ekstrak pekat
kloroform pada plat KLT kemudian dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, lalu di tutup dan di elusi. Plat yang telah di
elusi, di keluarkan dari bejana, lalu di keringkan. Di amati noda yang terbentuk dibawah sinar UV, kemudian difiksasi dengan
pereaksi FeCl
3
5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana:etil
asetat dengan perbandingan 80:20, 70:30, 60:40, 50:50 vv.
3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40
70-230 mesh ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n- heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 vv.
Dirangkai alat kromatografi kolom. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen
lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dilarutkan 1,4 g
ekstrak pekat kloroform dengan pelarut kloroform, kemudian dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-
heksana:etil asetat 90:10 vv secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas.
Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 80:20 vv, 70:30 vv, dan 60:40 vv. Hasil yang diperoleh
Universitas Sumatera Utara
ditampung dalam botol vial setiap ± 10 mL, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk pasta.
3.3.6 Pemurnian
Senyawa yang telah diperoleh dari hasil isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan etil asetat lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang
diperoleh sudah murni atau belum. Setelah itu dilakukan kembali kromatografi kolom dengan fase gerak yang seragam yaitu n-heksana : etil asetat dengan perbandingan
60:40 vv. Hasil isolasi direkristalisasi dengan menggunakan etil asetat dan n-heksana hingga diperoleh senyawa murni yang dibuktikan dengan noda yang tunggal pada uji
KLT.
3.3.7 Uji kemurnian Hasil isolasi dengan Kromatografi Lapis tipis KLT
Uji kemurnian pasta dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana:etil asetat 70:30 vv. Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi lapis tipis, lalu
dijenuhkan. Ditotolkan pasta yang sebelumnya dilarutkan dengan etil asetat pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi lapis tipis yang
telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, diamati di bawah sinar UV, dan difiksasi dengan
menggunakan pereaksi FeCl
3
5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida.
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
Analisis kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan uji dengan tiga jenis spektrofotometer yaitu Spektrofotometer UV-Visible, Spektrofotometer Inframerah
FT-IR, dan Spektrofotometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR.
Universitas Sumatera Utara
3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Vis
Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Vis diperoleh dari Laboratorium Kimia Organik Bahan AlamInstitut Teknologi Bandung ITB, Jawa Barat dengan
menggunakan pelarut metanol dan diperoleh data yang dapat dilihat pada Gambar 4.1.
3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan
menggunakan KBr dan diperoleh data yang dapat dilihat pada Gambar 4.2.
3.3.8.3Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Analisis dengan alat Spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan
menggunakan pelarut Aseton-d6 dan diperoleh data yang dapat dilihat pada Gambar 4.3.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Bagan Uji Flavonoida
- Ekstraksi dengan pelarut metanol
Serbuk daun tumbuhan senduduk merah
Melastoma sanguineum Sims di ekstraksi dengan metanol
disaring dimasukkan ke dalam 1 tabung reaksi
Tabung I
ditambahkan pereaksi FeCl
3
5 diamati perubahan warna
Larutan Hitam diamati warna larutan
Positif Flavonoida
Universitas Sumatera Utara
- Ekstraksi dengan pelarut etil asetat
Serbuk daun tumbuhan senduduk merah
Melastoma sanguineum Sims di ekstraksi dengan etil asetat
disaring dimasukkan ke dalam 1 tabung reaksi
Tabung I
ditambahkan pereaksi FeCl
3
5 diamati perubahan warna
Larutan Hitam diamati warna larutan
Positif Flavonoida
Universitas Sumatera Utara
3.5 Bagan Penelitian
1600 gram serbuk daun senduduk merah Melastoma sanguineum Sims
diuji Flavonoida dimaserasi dengan metanol hingga terendam
didiamkan selama ± 24 jam diulangi sebanyak 5 kali
disaring Ekstrak metanol
diuji dengan FeCl
3
5 dipekatkan dengan rotarievaporator
Ekstrak pekat metanol diuapkan hingga semua pelarut metanol habis menguap
dilarutkan dengan etilasetat secara berulang-ulang sampai bening disaring
Ekstrak Etilasetat Residu
diuji dengan FeCl
3
5 dipekatkan dengan rotarievaporator
Ekstrak pekat etilasetat dilarutkan dengan metanol
diekstraksi partisi dengan n-heksana hingga bening Lapisan metanol
Lapisan n-heksana non flavonoid
tidak dilanjutkan diuji dengan FeCl
3
5 dipekatkan dengan rotarievaporator
dihidrolisa dengan HCl 6 sambil dipanaskan selama 60 menit sambil diaduk
didinginkan disaring
Ekstrak metanol asam Residu
senyawa gula diekstraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali
Lapisan kloroform lapisan metanol
asam dipekatkan dengan rotarievaporator
Ekstrak pekat kloroform Sisa Sampel
Ampas
diuapkan hingga seluruh etilasetat menguap
diuji dengan FeCl
3
5
s
Universitas Sumatera Utara
Lanjutan
Ekstrak pekat kloroform diuji dengan FeCl
3
5 diuji KLT untuk mengetahui eluen yang sesuai
dikolom kroatografi dengan fase diam silika gel dan fase gerakeluen n-heksana : etilasetat 90:10; 80:20; 70:30; 60:40 vv
ditampung tiap fraksi sebanyak ± 10 mL dalam botol vial
diuji Kromatografi Lapis Tipis digabung fraksi dengan harga Rf yang sama
Fraksi 1-9 90:10 vv
Fraksi 10-35 80:20 vv
Fraksi 36-45 70:30 vv
Fraksi 46-55 60:40 vv
Fraksi 56-63 60:40 vv
Hasil negatif
Dianalisis dengan spektrofotometer UV-Vis,
spektrofotometer Inframerah FT-IR
spektrometer
1
H-NMR Hasil positif
Hasil positif Hasil positif
Hasil positif diuji FeCl
3
5 diuji FeCl
3
5 diuji FeCl
3
5 diuji FeCl
3
5 diuji FeCl
3
5
Hasil Analisis Senyawa Murni
Dianalisis Kromatografi Lapis Tipis dengan eluen n-heksana : etil asetat
60:40 vv Dikolom kromatografi dengan
fase diam silika gel dan fase gerak eluen n-heksana : etil asetat 60:40 vv
Diuji Kromatografi Lapis Tipis
Digabung fraksi dengan harga Rf yang sama fraksi 1-9
60:40 vv fraksi 10-20
60:40 vv
Hasil positif Hasil positif
Direkristalisasi
Dianalisis Kromatografi Lapis Tipis
Diuapkan
Universitas Sumatera Utara
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1. Hasil Penelitian
Kategori