EFEKTIVITAS KONSORSIUM MIKROB FILOSFER DAN RIZOSFER DALAM MENINGKATKAN PERTUMBUHAN

cekaman lingkungan. Bahan tanah diambil dari kedalaman 0 - 20 cm. Sebanyak 1 g tanah secara aseptik disuspensikan ke dalam larutan garam fisiologis lalu dibuat seri pengenceran hingga 10 -6 , dan diinkubasi dalam medium ATCC No. 14 per liter medium : 0.2 g KH 2 PO 4 ; 0.8 g K 2 HPO 4 ; 0.2 g MgSO 4 .7H 2 O; 0.1 g CaSO 4 .2H 2 O; 2.0 mg FeCl 3 ; Na 2 MoO 4 .2H 2 O trace; 0.5 g ekstrak kamir; 20 g sukrosa dan 15 g bakto agar dengan pH 7.2, Inkubasi dilakukan selama tujuh hari pada temperatur 28 o C. Koloni bakteri yang membentuk slime tebal mucoid menunjukkan adanya eksopolisakarida Laksmita 2011. Uji respon hipersensitif Konsorsium mikrob filosfer dan rizosfer diuji reaksi hipersensitivitasnya pada tanaman tembakau Nicotiana tabacum L. yang berumur ± 3 bulan, menurut metode Schaad et al. 2001 yang dimodifikasi. Pengujian ini dilakukan untuk mengetahui konsorsium yang berpotensi patogen. Masing-masing konsorsium diperbanyak pada media yeast dextrose carbonate YDC selama 48 jam. Kemudian konsorsium mikrob disuspensikan dalam air suling steril hingga larutannya terlihat keruh 10 8 – 10 9 Spkml. Selanjutnya inokulum disuntikan ke dalam jaringan daun melalui tulang daun sekunder. Perlakuan kontrol dibuat dengan cara daun hanya diinokulasi dengan air suling steril. Pengamatan terhadap munculnya hipersensitivitas dilakukan setelah 3 x 24 jam Ni Made 2008. Bila ada konsorsium yang berpotensi menyebabkan patogen, akan diuji masing-masing anggota penyusun konsorsium untuk mengetahui isolat yang berpotensi patogen. Uji kemampuan isolat menghasilkan hormon tumbuh tanaman. Fitohormon yang dihasilkan oleh mikrob dikonsentrasikan pada tiga jenis, yaitu auksin, giberelin dan sitokonin yang dianalisis dengan menggunakan HPLC High Performance Liquid Chromatography. Pengujian kemampuan konsorsium dalam menghasilkan IAA Indole Acetic Acid dan GA 3 giberelin secara kuantitatif dengan menggunakan metode dari Unyayar et al. 1996. Konsorsium diinokulasikan pada media NB + metanol 20 ml dan diinkubasikan dalam suhu ruang selama 24 jam pada mesin kocok 200 rpm. Supernatan dievaporasi pada mesin evaporasi pada suhui 35 o C. Ekstrak ditambah dengan HCl 2 M hingga pH 2.5. Selanjutnya ekstrak disaring, kemudian diinjek ke HPLC. Fase gerak asetonitril 12 dengan panjang gelombang 265 nm. Selain IAA dan GA 3 , kemampuan konsorsium untuk memproduksi sitokinin juga dianalisis dengan HPLC. Ekstrak dilarutkan dengan 0.1 M KH 2 PO 4 pada pH 2.4, sentrifuse 8000 rpm pada suhu 4 o C selama 15 menit. Supernatan ditampung dalam botol yang berisi 1 g polyvenil polypirolidone. Supernatan dikocok lalu disaring, hasil penyaringan difiltrasi dengan Sep-Pak C18 air 10 ml + sampel dan MeOH 80 10 ml, Kemudian dibilas dengan air secukupnya. Larutan diinjek ke HPLC, fase gerak metanol 80. Hasil pengukuran diperoleh dengan menghitung luas area contoh per luas area standar dikali konsentrasi standar dikali volume larutan per bobot sampel Hidayati 2004. Analisis Data Data yang diperoleh diolah dengan analisis ragam dan apabila ada beda nyata dilajutkan dengan uji jarak berganda Duncan pada taraf 5. Data diolah menggunakan program computer SAS Statistical Analysis System for windows versi 9.1 Matjik Sumertajaya 2006. Hasil Kurva standar Kurva standar yang digunakan untuk masing-masing konsorsium, yaitu : Konsorsium mikrob filosfer Fs25 adalah Y = 141.0x + 27.10, konsorsium mikrob filosfer Fs2 adalah Y = 73.84x + 49.55, konsorsium mikrob filosfer Fm48 adalah Y = 90.72x + 115.9, konsorsium mikrob rizosfer R15 adalah Y = 12.02x + 104.0, konsorsium mikrob rizosfer R43 adalah Y = 98.73x + 49.37 dan konsorsium mikrob rizosfer R44 adalah Y = 54.07x + 32.44. Komponen pertumbuhan Inokulasi kombinasi konsorsium filosfer dan mikrob rizosfer berpengaruh nyata terhadap pertumbuhan tanaman padi, yaitu peubah tinggi tanaman umur 30 dan 60 HST, jumlah anakan umur 60 HST, jumlah daun umur 90 HST, bobot segar dan bobot kering tanaman pada saat panen, tetapi tidak berpengaruh nyata terhadap peubah jumlah anakan umur 30 HST. Hasil uji lanjut DMRT pada taraf α 5 disajikan pada Tabel 10. Tabel 10. Rata-rata tinggi tanaman cm, jumlah anakan batang, jumlah daun helai, bobot segar g dan bobot kering g saat panen. Perlakuan Tinggi tan. 30 HST Tinggi tan. 60 HST ∑ anakan 30 HST ∑ anakan 60 HST F0R0 kontrol F1R1 Fs25 + R15 F1R2 Fs25 + R43 F1R3 Fs25 + R44 F2R1 Fs2 + R15 F2R2 Fs2 + R43 F2R3 Fs2 + R44 F3R1 Fm48 + R15 F3R2 Fm48 + R43 F3R3 Fm48 + R44 50.200e 57.517a 53.167cd 52.617cd 53.383cd 53.750bcd 54.250bcd 52.000ed 54.600bc 55.850ab 71.383b 71.600b 72.150b 71.617b 77.217a 71.883b 70.917b 74.100ab 72.983ab 75.967ab 9.333a 9.667a 10.667a 10.667a 11.000a 10.333a 11.333a 10.167a 9.167a 10.000a 11.500b 15.833ab 15.500ab 16.000ab 16.000ab 15.667ab 18.833a 19.167a 17.500a 15.667ab Perlakuan ∑ daun 60 HST Bobot segar Bobot kering F0R0 kontrol F1R1 Fs25 + R15 F1R2 Fs25 + R43 F1R3 Fs25 + R44 F2R1 Fs2 + R15 F2R2 Fs2 + R43 F2R3 Fs2 + R44 F3R1 Fm48 + R15 F3R2 Fm48 + R43 F3R3 Fm48 + R44 48.000b 69.833a 66.333a 57.667ab 64.833ab 59.167ab 67.333a 69.000a 57.167ab 57.500ab 138.510b 159.500ab 158.080ab 141.890b 207.430a 156.500ab 176.620ab 187.020ab 171.190ab 156.960ab 27.506abc 29.316abc 27.264abc 23.290c 37.312a 25.586bc 35.582ab 36.388ab 28.500abc 32.987abc Keterangan : Rata-rata yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak beda nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf nyata 0,05.,HST = hari sesudah tanam, Fs25 = konsorsium filosfer daun sedang Pterospermum celebicum Miq., Fs2 = konsorsium filosfer daun sedang Ageratum cnyzoides L.,Fm48 = konsorsium filosfer daun muda Elmerrillia ovalis Miq. Dandy.,R15 = konsorsium rizosfer Physalis angulata L.,R43 = konsorsium rizosfer Eupatorium odoratum L.,R44 = konsorsium rizosfer Cyathula prostata L. Blume. Inokulasi kombinasi konsorsium tidak konsisten pengaruhnya terhadap pertumbuhan fase vegetatif tanaman padi. Meskipun pengaruhnya terhadap pertumbuhan sangat variatif, semua perlakuan berbeda nyata dengan kontrol, kecuali peubah bobot segar tanaman. Komponen hasil Tabel 11. Rata-rata jumlah anakan produktif, bobot segar malai, jumlah biji bernas, bobot biji per rumpun dan bobot 1000 biji pada saat panen Perlakuan Jumlah anakan produkrif Bobot segar malai g Jumlah biji bernas butir Bobot biji per rumpun g Bobot 1000 biji g F0R0 kontrol F1R1 Fs25 + R15 F1R2 Fs25 + R43 F1R3 Fs25 + R44 F2R1 Fs2 + R15 F2R2 Fs2 + R43 F2R3 Fs2 + R44 F3R1 Fm48 + R15 F3R2 Fm48 + R43 F3R3 Fm48 + R44 5.6667b 7.3333ab 8.5000a 7.5000ab 7.6667ab 8.5000a 8.8333a 9.1667a 8.5000a 6.8333ab 17.674b 20.510ab 23.919a 21.549ab 22.734ab 23.218ab 25.220a 26.432a 25.264a 19.949ab 446.50d 607.67bcd 675.50abc 611.83bcd 669.83abc 673.00abc 666.50abc 832.50a 814.67bc 588.67cd 10.478c 17.623b 19.643ab 17.742b 19.844ab 20.200ab 19.467ab 25.313a 24.780a 18.008b 23.466b 29.002a 29.079a 28.998a 29.625a 30.015a 29.208a 30.406a 30.418a 30.959a Keterangan : Rata-rata yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak beda nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf nyata 0,05., Fs25 = konsorsium filosfer daun sedang Pterospermum celebicum Miq.Fs2 = konsorsium filosfer daun sedang Ageratum cnyzoides L., Fm48 = konsorsium filosfer daun muda Elmerrillia ovalis Miq. Dandy., R15 = konsorsium rizosfer Physalis angulata L., R43 = konsorsium rizosfer Eupatorium odoratum L., R44 = konsorsium rizosfer Cyathula prostata L. Blume. Inokulasi kombinasi konsorsium berpengaruh nyata terhadap jumlah anakan produktif, bobot segar malai, jumlah biji bernas, bobot biji per rumpun, kecuali bobot 1000 biji pada saat panen. Hasil uji lanjut DMRT pada taraf α 5 disajikan pada Tabel 11. Inokulasi kombinasi konsorsium Fm48 dan R15 meningkatkan hasil tanaman padi lebih baik dibanding dengan perlakuan lainnya, kecuali bobot 1000 biji dan berbeda nyata dibandingkan dengan kontrol. Analisis kandungan klorofil Perlakuan inokulasi kombinasi konsorsium berpengaruh nyata terhadap kandungan klorofil daun tanaman padi. Hasil uji lanjut DMRT pada taraf α 5 disajikan pada Tabel 12. Inokulasi kombinasi konsorsium Fm48 dan R15 meningkatkan kandungan klorofil lebih banyak pada daun tanaman padi dan berbeda nyata dibandingkan dengan kontrol. Tabel 12. Rata-rata jumlah klorofil a, klorofil b dan total klorofil Perlakuan Klorofil a mgg Klorofil b mmg Total klorofil mmg F0R0 kontrol F1R1 Fs25 + R15 F1R2 Fs25 + R43 F1R3 Fs25 + R44 F2R1 Fs2 + R15 F2R2 Fs2 + R43 1.8072b 2.2057ab 2.3259ab 2.4202ab 2.7188a 2.7691a 0.7042b 0.9990ab 0.9043ab 0.9519ab 1.0937a 1.0765a 2.5114b 3.5306ab 3.2302ab 3.3721ab 3.8124 a 3.8456 a F2R3 Fs2 + R44 F3R1 Fm48 + R15 F3R2 Fm48 + R43 F3R3 Fm48 + R44 2.6874a 2.8932a 2.7908a 2.6506a 1.0514a 1.1430a 1.1247a 1.0611ab 3.7389a 4.0362a 3.9155a 3.7117a Keterangan : Rata-rata yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak beda nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf nyata 0,05. , Fs25 = konsorsium filosfer daun sedang Pterospermum celebicum Miq.,Fs2 = konsorsium filosfer daun sedang Ageratum cnyzoides L.,Fm48 = konsorsium filosfer daun muda Elmerrillia ovalis Miq. Dandy.,R15 = konsorsium rizosfer Physalis angulata L.,R43 = konsorsium rizosfer Eupatorium odoratum L.,R44 = konsorsium rizosfer Cyathula prostata L. Blume. Analisis total populasi mikrob pada media tanam Inokulasi kombinasi konsorsium berpengaruh nyata terhadap total mikrob pada media tanam tanaman padi. Hasil uji lanjut DMRT pada taraf α 5 disajikan pada Tabel 13. Inokulasi kombinasi konsorsium Fs25 dan R43 mengandung total mikrob lebih banyak pada media tumbuh, meskipun tidak berbeda nyata dengan perlakuan lainnya, kecuali dengan kontrol. Tabel 13. Rata-rata total mikrob pada media tanam Perlakuan Total mikrob pada media tanam 10 -6 Spk F0R0 kontrol F1R1 Fs25 + R15 F1R2 Fs25 + R43 F1R3 Fs25 + R44 F2R1 Fs2 + R15 F2R2 Fs2 + R43 F2R3 Fs2 + R44 F3R1 Fm48 + R15 F3R2 Fm48 + R43 F3R3 Fm48 + R44 10.67b 34.17ab 48.17a 27.00ab 35.17ab 33.33ab 31.50ab 41.33ab 37.17ab 38.50ab Keterangan : Rata-rata yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak beda nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf nyata 0,05. , Fs25 = konsorsium filosfer daun sedang Pterospermum celebicum Miq.,Fs2 = konsorsium filosfer daun sedang Ageratum cnyzoides L.,Fm48 = konsorsium filosfer daun muda Elmerrillia ovalis Miq. Dandy.,R15 = konsorsium rizosfer Physalis angulata L.,R43 = konsorsium rizosfer Eupatorium odoratum L.,R44 = konsorsium rizosfer Cyathula prostata L. Blume.,Spk = satuan pembentuk koloni. Analisis kandungan dan serapan hara Kandungan hara N pada media tanam dan serapan hara N pada akar dan tajuk Inokulasi kombinasi konsorsium tidak berpengaruh nyata terhadap kandungan hara N pada media tanam dan serapan hara N pada akar, tetapi berpengaruh nyata terhadap serapan hara N pada tajuk. Hasil uji lanjut DMRT pada taraf α 5 disajikan pada Tabel 14. Inokulasi kombinasi Fm48 dan R15 meningkatkan penyerapan hara lebih banyak dibanding perlakuan lainnya, meskipun tidak berbeda nyata dibanding dengan perlakuan lainnya, kecuali perlakuan inokulasi kombinasi konsorsium Fs25 dan R44. Tabel 14. Rata-rata kandungan hara N pada media tanam, serapan hara N pada akar dan serapan hara N pada tajuk Perlakuan Hara N pada media tanam Serapan hara N pada akar g Serapan hara N pada tajuk g F0R0 kontrol F1R1 Fs25 + R15 F1R2 Fs25 + R43 F1R3 Fs25 + R44 F2R1 Fs2 + R15 F2R2 Fs2 + R43 F2R3 Fs2 + R44 F3R1 Fm48 + R15 F3R2 Fm48 + R43 F3R3 Fm48 + R44 0.09290a 0.10217a 0.10680a 0.10680a 0.10217a 0.11607a 0.10680a 0.15323a 0.14860a 0.14857a 0.04483a 0.07637a 0.05490a 0.04980a 0.06867a 0.03730a 0.06827a 0.06730a 0.06180a 0.05330a 0.08157ab 0.09760ab 0.08157ab 0.07933b 0.12587ab 0.09150ab 0.09590ab 0.13967a 0.08827ab 0.11463ab Keterangan : Rata-rata yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak beda nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf nyata 0,05. , Fs25 = konsorsium filosfer daun sedang Pterospermum celebicum Miq., Fs2 = konsorsium filosfer daun sedang Ageratum cnyzoides L. Fm48 = konsorsium filosfer daun muda Elmerrillia ovalis Miq. Dandy.,R15 = konsorsium rizosfer Physalis angulata L.,R43 = konsorsium rizosfer Eupatorium odoratum L.,R44 = konsorsium rizosfer Cyathula prostata L. Blume. Kandungan hara P pada media tanam dan serapan hara P pada akar dan tajuk Inokulasi kombinasi konsorsium berpengaruh nyata terhadap kandungan hara P pada media tanam, serapan hara P pada akar dan serapan hara P pada tajuk. Hasil uji lanjut DMRT pada taraf α 5 disajikan pada Tabel 15. Tabel 15. Rata-rata kandungan hara P pada media tanam, serapan hara P pada akar dan serapan hara P pada tajuk Perlakuan Hara P pada media tanam Serapan hara P pada akar g Serapan hara P pada tajuk g F0R0 kontrol F1R1 Fs25 + R15 F1R2 Fs25 + R43 F1R3 Fs25 + R44 F2R1 Fs2 + R15 F2R2 Fs2 + R43 F2R3 Fs2 + R44 F3R1 Fm48 + R15 F3R2 Fm48 + R43 F3R3 Fm48 + R44 3.39390d 4.28420c 4.67360bc 5.23000ab 4.06160c 4.28420c 5.11880ab 4.61800bc 4.72930bc 5.67510a 0.012933b 0.013267b 0.013033b 0.011867b 0.016667ab 0.012800b 0.020867a 0.019033ab 0.018867ab 0.014733ab 0.026367bc 0.026033bc 0.025533bc 0.021900c 0.039600a 0.024900bc 0.033567abc 0.036867ab 0.026033bc 0.032433abc Keterangan : Rata-rata yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak beda nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf nyata 0,05.,Fs25 = konsorsium filosfer daun sedang Pterospermum celebicum Miq.,Fs2 = konsorsium filosfer daun sedang Ageratum cnyzoides L. Fm48 = konsorsium filosfer daun muda Elmerrillia ovalis Miq. Dandy.,R15 = konsorsium rizosfer Physalis angulata L.,R43 = konsorsium rizosfer Eupatorium odoratum L.,R44 = konsorsium rizosfer Cyathula prostata L. Blume. Inokulasi kombinasi konsorsium Fm48 dan R44 mengandung hara P lebih banyak pada media tanam. Perlakuan inokulasi kombinasi konsorsium Fs2 dan R44 menyerap lebih banyak hara P pada akar dan inokulasi kombinasi konsorsium Fs2 dan R15 menyerap hara P lebih banyak pada tajuk. Serapan hara K pada media tanam dan serapan hara K pada akar dan serapan hara K pada tajuk Inokulasi kombinasi konsorsium berpengaruh nyata terhadap serapan hara K pada akar dan tajuk tetapi tidak berpengaruh nyata terhadap kandungan hara K pada media tanam . Hasil uji lanjut DMRT pada taraf α 5 disajikan pada Tabel 16. Inokulasi kombinasi konsorsium Fs2 dan R44 menyerap hara K lebih banyak pada akar dan inokulasi kombinasi konsorsium Fm48 dan R15 menyerap hara K lebih banyak pada tajuk. Tabel 16. Rata-rata kandungan hara K pada media tanam, serapan hara K pada akar dan serapan hara K pada tajuk Perlakuan Hara K pada media tanam me100 g Serapan Hara K pada akar Serapan hara K pada tajuk F0R0 kontrol F1R1 Fs25 + R15 F1R2 Fs25 + R43 F1R3 Fs25 + R44 F2R1 Fs2 + R15 F2R2 Fs2 + R43 F2R3 Fs2 + R44 F3R1 Fm48 + R15 F3R2 Fm48 + R43 F3R3 Fm48 + R44 0.05667a 0.06333a 0.07000a 0.06667a 0.06000a 0.05667a 0.06667a 0.06000a 0.07000a 0.08333a 0.61660b 0.36880bc 0.50670bc 0.33380bc 0.77380ab 0.41590bc 1.11500a 0.29680bc 0.07360c 0.05740c 0.39930b 0.77420ab 0.41300b 1.01670ab 0.53840ab 0.87480ab 0.45480b 1.35110a 0.62380ab 1.00140ab Keterangan : Rata-rata yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak beda nyata berdasarkan uji DMRT pada taraf nyata 0,05. ,Fs25 = konsorsium filosfer daun sedang Pterospermum celebicum Miq.,Fs2 = konsorsium filosfer daun sedang Ageratum cnyzoides L. Fm48 = konsorsium filosfer daun muda Elmerrillia ovalis Miq. Dandy.,R15 = konsorsium rizosfer Physalis angulata L.,R43 = konsorsium rizosfer Eupatorium odoratum L.,R44 = konsorsium rizosfer Cyathula prostata L. Blume. Uji eksopolisakarida Hasil uji eksopolisakarida menunjukkan bahwa inokulasi kombinasi konsorsium Fm48 dan R15 mengandung lebih banyak mukoid pada medium dibanding dengan perlakuan lainnya. Hasil uji eksopolisakarida disajikan pada Tabel 17. Tabel 17. Jumlah slime tebal mukoid yang terbentuk pada medium Perlakuan Pengenceran 10 -3 10 -6 F0R0 kontrol F1R1 Fs25 + R15 F1R2 Fs25 + R43 F1R3 Fs25 + R44 F2R1 Fs2 + R15 1 3 1 F2R2 Fs2 + R43 F2R3 Fs2 + R44 F3R1 Fm48 + R15 F3R2 Fm48 + R43 F3R3 Fm48 + R44 2 1 13 1 1 1 Keterangan : Fs25 = konsorsium filosfer daun sedang Pterospermum celebicum Miq., Fs2 = konsorsium filosfer daun sedang Ageratum cnyzoides L., Fm48 = konsorsium filosfer daun muda Elmerrillia ovalis Miq. Dandy., R15 = konsorsium rizosfer Physalis angulata L., R43 = konsorsium rizosfer Eupatorium odoratum L., R44 = konsorsium rizosfer Cyathula prostata L. Blume. Uji respon hipersensitif Uji respon hipersensitif pada tanaman tembakau menunjukkan bahwa, konsorsium R15 berpotensi menyebabkan penyakit pada tanaman, yang ditandai dengan terjadinya infeksi pada daun berwarna kuning. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 7. Konsorsium Fs25 negatif Konsorsium Fs2 negatif Konsorsium Fm48 negatif Konsorsium R15 positif Konsorsium R43 negatif Konsorsium R44 negatif Kontrol positif Kontrol negatif Uji Hipersensitif HR Gambar 7. Uji reaksi hipersensitif konsorsium mikrob pada daun tanaman tembakau. Konsorsium R15 menunjukkan gejala nekrosis Uji respon hipersensitif terhadap anggota konsorsium R15 pada tanaman tembakau menunjukkan bahwa, isolat R151, R152 dan R154 berpotensi menyebabkan penyakit pada tanaman. Hal ini dapat dilihat pada Gambar 8. R151 R152 R153 R154 Gambar 8. Uji reaksi hipersensitif anggota konsorsium mikrob R15 pada daun tanaman tembakau. Isolat R151, R152 dan R154 menunjukkan gejala nekrosis Kemampuan konsorsium menghasilkan hormon tumbuh tanaman Kedua konsorsium mikrob filosfer Fm48 dan mikrob rizosfer menghasilkan hormon tumbuh tanaman, seperti auksin, sitokinin dan giberelin, disajikan pada Tabel 18. Kandungan hormon IAA konsorsium Fm48 dan R15 secara kuantitatif adalah sedang, sebaliknya kandungan giberelin konsorsium adalah tinggi. Agustin et al. 2010 melaporkan kandungan IAA pada rizosfer jagung sebesar 67.30 ppm, kacang tanah 67.30 ppm dan karamunting 22.29 ppm. Hasil penelitian Gusmaini et al. 2013, isolat bakteri endofit mengandung IAA 205.4 – 585.7 ppm dan giberelin 39 – 60 ppm. Tabel 18. Hasil uji kandungan hormon konsorsium mikrob filosfer dan rizosfer Fitohormon Konsorsium mikrob Filosfer Fm48 ppm Rizosfer R15 ppm Auxin - IAA Sitokinin - Zeatin - Kinetin Giberelin 185.382 121.126 135.047 211.776 178.513 118.775 137.424 193.855 Keterangan : Fm48 = konsorsium mikrob filosfer Fm48 dari daun muda tumbuhan Elmerrillia ovalis Miq Dandy, R15 = konsorsium mikrob rizosfer dari rizosfer tumbuhan Physalis angulata L. Pembahasan Inokulasi konsorsium mikrob filosfer dan rizosfer nyata meningkatkan pertumbuhan dan hasil tanaman padi. Pada pertumbuhan fase vegetatif tanaman padi, inokulasi kombinasi konsorsium mikrob meningkatkan tinggi tanaman, jumlah anakan, jumlah daun dan bobot segar tanaman lebih baik dibanding dengan kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa, bahwa kombinasi kedua konsorsium mikrob, baik filosfer dan rizosfer mampu mendukung pertumbuhan tanaman melalui kemampuan isolat anggota penyusunnya menambat N 2 , melarutkan P dan mensekresikan hormon tumbuh tanaman. Ketiga peran ini mampu memacu pertumbuhan organ akar dan pucuk tanaman. Fitohormon yang disekresikan oleh mikrob berperan meregulasi pertumbuhan tanaman. Didukung oleh Hindersah dan Tualar 2004, tanaman memenuhi kebutuhannya akan hormon melalui kemampuannya untuk mensintesis hormon atau mendapatkannya dari filosfer dan rizosfer sebagai akibat dari aktivitas mikrob dalam mensintesis fitohormon. Pertumbuhan akar yang normal menjamin perkembangan tajuk yang normal. IAA meningkatkan perkembangan dan pembelahan sel tanaman. IAA merangsang perkembangan akar dan memperbanyak bulu bulu akar tanaman padi Razis Anas 2005. Hasil uji kemampuan konsorsium menghasilkan hormon tumbuh tanaman menunjukkan bahwa semua konsorsium mampu menghasilkan hormon tumbuh tanaman berupa IAA, sitokinin dan giberelin. Inokulasi konsorsium mikrob tidak nyata meningkatkan bobot kering diduga akibat distribusi asimilat ke organ tanaman. Tanaman yang lebih tinggi dan jumlah anakan yang banyak membutuhkan asimilat yang lebih banyak, sehingga bobot keringnya lebih rendah. Pertumbuhan selanjutnya dipengaruhi oleh peran konsorsium mikrob filosfer, sehubungan dengan berkembangnya jumlah dan ukuran daun dan meningkatnya eksudat akibat proses fotosistesis. Hal ini ditunjukkan bahwa perlakuan kombinasi konsorsium Fs2 dan R15 menghasilkan tinggi tanaman lebih baik. Demikian pula hubungan dengan parameter jumlah anakan pada umur 60 HST, kombinasi konsorsium Fm48 dan R15 menghasilkan jumlah anakan lebih banyak. Hal ini diduga turut berperannya konsorsium mikrob filosfer dalam menambat N 2 dari udara. Selain itu, konsorsium mikrob rizosfer juga mendukung pertumbuhan tanaman melalui kemampuannya melarutkan P. Didukung oleh pendapat Morris 2001, mikrob sebagai penghasil hormon berperan memacu pertumbuhan tanaman dan mikrob sebagai penambat N 2 berperan meningkatkan pertumbuhan tanaman. Kombinasi konsorsium Fs2 dan R15 meningkatkan bobot segar dan bobot kering tanaman. Hal ini terjadi karena adanya dukungan antara konsorsium mikrob filosfer dan rizosfer terhadap pertumbuhan vegetatif tanaman. Kandungan klorofil pada organ daun ditentukan oleh besarnya pasokan unsur ke dalam tanaman, baik melalui tanah maupun melalui daun. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kandungan klorofil pada daun tanaman yang diinokulasikan konsorsium mikrob lebih tinggi dibanding kontrol. Hal ini memperlihatkan adanya peran anggota penyusun konsorsium mikrob yang berfungsi sebagai penambat N 2 baik filosfer maupun rizosfer, sehingga mampu memasok N lebih besar bagi tanaman. Peran nitrogen ini penting dalam proses fotosintesis, yaitu memacu terbentuknya klorofil pada daun untuk menghasilkan asimilat Gardner et al. 1991. Rolfed dan Wienman 2001 menegaskan bahwa, mikrob berperan dalam siklus N bakteri amonifikasi, nitrifikasi dan denitrifikasi dan mikrob mampu menambat N 2. Klorofil pada daun sangat berperan dalam proses fotosintesis, karena berkaitan dengan pemanenan cahaya. Semakin banyak klorofil, semakin banyak energi sinar matahari yang ditangkap dan dapat digunakan tanaman untuk fotosintesis Gardner et al. 1991, dengan meningkatnya laju fotosintesis maka semakin tinggi pula pembentukan bahan kering yang terbentuk dari proses metabolisme. Rangkaian proses ini selanjutnya akan menentukan pertumbuhan dan hasil bagi tanaman padi. Selain itu, peran mikrob pelarut P memegang peran penting dalam mensuplai P tersedia bagi tanaman. Saraswati et al. 2007 menyatakan bahwa mikrob melepaskan senyawa organik yang mampu mengkelat logam yang mengikat P menjadi tersedia bagi tanaman. Fosfor merupakan komponen struktural dari sejumlah senyawa penting, seperti molekul pentransfer energi ADP dan ATP, NAD, NADPH dan senyawa sistem informasi genetik DNA dan RNA, untuk membran sel fosfolipid dan fosfoprotein Gardner et al. 1991. Mikrob menghasilkan asam-asam organik seperti asam formiat, asetat, propionate, laktat, glikolat, fumarat, tartat, suksinat dan sitrat. Asam organik tersebut dapat melarutkan bentuk bentuk fosfat yang sukar larut menjadi bentuk tersedia bagi tanaman Rao 1982; Whitelaw 1999. Kehadiran mikrob pada media tanam mempengaruhi pertumbuhan tanaman. Semakin tinggi populasi mikrob pada media tanam, semakin baik pengaruhnya terhadap pertumbuhan tanaman. Media tanam yang diinokulasi dengan konsorsium Fm48 dan R15 dengan konsorsium Fs25 dan R43 mengandung populasi mikrob paling tinggi. Mikrob pada media tanam akan berinteraksi dengan tanaman dan menghasilkan nutrisi bagi tanaman. Didukung oleh pendapat Ristiati et al. 2008, mikrob tanah dapat berfungsi sebagai agen biokemik dalam pengubahan senyawa organik yang kompleks menjadi senyawa anorganik mineralisasi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa total mikrob pada tanah yang diberikan konsorsium mikrob lebih besar dibanding kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa mikrob yang yang diinokulasikan dapat hidup dan berkembang pada media tumbuh tanah, yang pada gilirannya berpotensi membantu proses pertumbuhan tanaman. Hasil tanaman padi yang dicapai dalam percobaan ini menunjukan bahwa kombinasi konsorsium Fm48 dan R15 menghasilkan jumlah anakan produktif, bobot segar malai, jumlah biji bernas, bobot biji per tanaman lebih tinggi. Selain itu, kombinasi kedua konsorsium menghasilkan persentase biji hampa lebih rendah dan bobot 1000 biji yang paling tinggi, meskipun tidak berbeda nyata. Tanaman memperoleh hara dari mikrob penyusun konsorsium terutama unsur N. Sejalan dengan pendapat Gardner et al. 1991, nitrogen merupakan bahan penyusun asam amino, amida, basa bernitrogen seperti purin dan protein serta bahan penyusun klorofil. Defisiensi N membatasi pembesaran sel dan pembelahan sel serta mengganggu proses pertumbuhan yang menyebabkan tanaman kerdil, menguning dan berkurangnya berat kering hasil panen. Kemampuan mikrob mensekresikan hormon mampu memacu semua pertumbuhan awal tanaman, baik arsitekstur akar maupun menginisiasi pemunculan pucuk daun muda Egamberdieva 2008. Konsorsium mikrob mendukung pertumbuhan fase vegetatif lebih baik. Hal ini dapat terlihat hubungannya dengan hasil tanaman. Pertumbuhan awal akan mendukung pertumbuhan fase generatif yang tetap dipengaruhi peran konsorsium mikrob. Analisis kandungan hara pada media tanam dan analisis serapan hara pada akar dan tajuk memberikan gambaran tentang ketersediaan hara di tanah dalam kaitannya dengan kemampuan tanaman menyerap hara tersebut untuk proses metabolismenya. Hara yang tersedia di tanah diharapkan mampu dimanfaatkan oleh tanaman, dengan demikian semakin tinggi kandungan hara di tanah semakin tinggi hara yang diserap oleh tanaman untuk pertumbuhan dan perkembangannya. Besarnya serapan hara pada tanaman yang diinokulasikan konsorsium diharapkan lebih meningkat, akibat adanya peran mikrob membantu tanaman mensuplai hara seperti N dan P. Inokulasi kombinasi konsorsium Fm48 dan R15 tidak nyata pengaruhnya terhadap kandungan hara N pada media tanam dan serapan hara N pada akar, tetapi meningkatkan serapan hara N pada tajuk. Inokulasi kombinasi konsorsium Fm48 dan R15 meningkatkan serapan hara N pada tajuk lebih baik dibanding perlakuan lainnya. Hal ini menggambarkan peran konsorsium mikrob filosfer Fm48 memiliki anggota penyususn yang mampu menambat N 2 dari udara dan mamasok kebutuhan N bagi tanaman. Inokulasi kombinasi konsorsium mikrob nyata pengaruhnya terhadap ketersediaan hara P pada media tanam, serapan hara P pada akar dan tajuk. Hasil penelitian menunjukkan bahwa kandungan P pada media tanam yang tinggi selaras dengan tingginya P yang diserap oleh akar dan tajuk. Serapan hara P pada akar yang lebih tinggi ditunjukkan oleh perlakuan inokulasi kombinasi konsorsium Fm48 dan R15, menjadi indikator adanya peran konsorsium mikrob rizosfer menambat N 2 dari udara. Hasil penelitian menunjukan adanya korelasi antara inokulasi konsorsium mikrob filosfer dan mikrob rizosfer dengan meningkatnya total populasi mikrob pada media tanam. Meningkatnya kandungan klorofil pada daun dan meningkatnya serapan hara pada akar dan tajuk. Unsur K berperan sebagai katalisator, sehingga kehadiran unsur K akan meningkatkan penyerapan unsur N dan P. Selain itu, unsur K sangat mobil dan berada di seluruh jaringan tanaman sesuai dengan perannya. Ada korelasi antara tingginya unsur N dan P pada akar dan tajuk tanaman diikuti dengan tingginya unsur K pada organ tersebut. Hal ini ditunjukkan pada perlakuan inokulasi konsorsium Fm48 dan R15. Serapan hara K pada tajuk lebih tinggi dibanding perlakuan lainnya, menggambarkan bahwa aktivitas metabolisme tanaman pada daun sangat tinggi yang mendukung pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Kalium terutama berfungsi sebagai aktivator suatu enzim atau kofaktor sekitar 46 enzim Gardner et al. 1991; Salisbury Ross 1992. Uji eksopolisakarida menunjukkan bahwa perlakuan inokulasi konsorsium Fm48 dari dan R15 membentuk mukoid lebih banyak. Anggota penyusun konsorsium mikrob rizosfer tersebut mampu menghasilkan senyawa organik berupa eksopolisakarida. Menurut Laksmita 2011, eksopolisakarida bakteri dapat berinteraksi dengan partikel tanah melalui pembentukan jembatan polimer, sehingga memiliki peran dalam pembentukan mikroagregat tanah. Adanya eksopolisakarida mampu meningkatkan kemampuan pembentukan agregat tanah Lynch Elliot 1988 dan melindungi mikrob dari berbagai cekaman lingkungan. Uji respon hipersensitif menunjukkan bahwa semua konsorsium mikrob filosfer dan mikrob rizosfer tidak menunjukkan gejala nekrosis bercak kuning pada daun tembakau, kecuali konsorsium R15 menunjukkan adanya nekrosis. Selanjutnya, uji respon hipersensitif terhadap isolat anggota penyusun konsorsium R15 menunjukkan, isolat R151, R152 dan R154 menunjukkan gejala nekrosis. Konsorsium R15 berpotensi menyebabkan penyakit bagi tanaman, namun tidak menyebabkan penyakit pada tanaman padi. Ahmad et al. 2001 melaporkan bahwa, kemampuan bakteri patogen menghasilkan respon hipersensitif tanaman bukan inang berkorelasi dengan kemampuan bakteri tersebut menyebabkan penyakit pada tanaman inang yang rentan. Simpulan Kombinasi konsorsium mikrob filosfer dan rizosfer efektif meningkatkan pertumbuhan dan hasil tanaman padi. Kombinasi konsorsium Fm48 dari daun muda tumbuhan Elmerrilia ovalis Miq. Dandy dengan konsorsium R15 dari rizosfer tumbuhan Physalis angulata L. paling efektif meningkatkan pertumbuhan dan hasil tanaman padi. Kombinasi konsorsium mikrob filosfer Fm48 dan rizosfer R15 mampu menghasilkan mukoid eksopolisakarida pada medium. Konsorsium mikrob rizosfer R15 berpotensi menyebabkan penyakit pada tanaman tetapi tidak menyebabkan penyakit terrhadap tanaman padi. Kedua konsorsium mampu mensekresikan hormon tumbuh tanaman.

6. IDENTIFIKASI SECARA MOLEKULER DAN UJI BIOKIMIA KONSORSIUM MIKROB FILOSFER DAN RIZOSFER

YANG EFEKTIF MENINGKATKAN PERTUMBUHAN DAN HASIL PADI Abstrak Identifikasi molekuler konsorsium mikrob yang telah terbukti efektif meningkatkan pertumbuhan dan hasil tanaman padi penting untuk dilakukan. Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi kombinasi konsorsium mikrob phyllosphere Fm48 dari daun muda tumbuhan Elmerrillia ovalis Miq. Dandy dengan konsorsium mikrob rizosfer R15 dari rizosfer tumbuhan Physalis angulata L. berdasarkan sequen gen 16S rRNA-nya dan mengkarakterisasi sifat morfologi dan biokimia mikrob tersebut. Penelitian dilaksanakan mulai bulan Desember 2013 hingga Januari 2014 di laboratorium Bioteknologi Lingkungan Indonesian Centre for Biodiversity and Biotechnology ICBB Situ Gede, Bogor. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsorsium Fm48 terdiri atas lima anggota penyusun konsorsium yaitu Fm481 dengan identitas terdekat adalah Serratia sp. SE-3 homologi 95.5, Fm482 dengan identitas terdekat adalah Enterobacter sp. NII-24a homologi 96.4, Fm483 dengan identitas terdekat adalah Enterobacter sp. MS5 homologi 96,2, Fm484 dengan identitas terdekat adalah Klebsiella oxytoca LRC162 homologi 96.5 dan Fm485 dengan identitas terdekat adalah Acinetobacter sp. Fsh11 homologi 94.7. Konsorsium R15 terdiri atas empat anggota penyusun konsorsium yaitu R151 dengan identitas terdekat adalah Stenotrophomonas maltophilia homologi 96.4, R152 dengan identitas terdekat adalah Stenotrophomonas sp. SCU-B130 homologi 97.6, R153 dengan identitas terdekat adalah Bacillus cereus. EGU64 homologi 68 dan R154 dengan identitas terdekat adalah Stenotrophomonas sp. SCU-B130 homologi 95.9. Kata kunci : homologi, morfologi, strain, karakterisasi Abstract Molecular identification of microbial consortia that have been shown to be effective in improving growth and yield of rice plants is important. This study was aimed at identifying the combination of Fm48, a phyllosphere microbial consortium from young leaves of Elmerrillia ovalis Miq. Dandy with R15, a rhizosphere microbial consortium of Physalis angulata L. on the basis of their 16S rRNA gene sequences and characterizing their morphological and biochemical properties. The research was conducted from December 2013 to January 2014 in the Laboratory of Environmental Biotechnology, Indonesian Centre for Biodiversity and Biotechnology ICBB Situ Gede, Bogor. The results showed that Fm48 consortium was composed of five members: Fm481 with the nearest identity was Serratia sp. SE-3 95.5 homology, Fm482 with the nearest identity was Enterobacter sp. NII-24a 98.7 homology, Fm483 with the nearest identity was Enterobacter sp. MS5 96.2 homology, Fm484 with the nearest identity was Klebsiella oxytoca LRC162 96.5 homology and Fm485 with the nearest identity was Acinetobacter sp. Fsh11 94.7 homology. Consortium R15 was found to consist of four members: R151 with the nearest identity was Stenotrophomonas msltophilia 96.4 homology, R152 with the nearest identity was Stenotrophomonas sp. SCU-B130 97.6 homology, R153 with the nearest identity was Bacillus cereus EGU64 86 homology and R15 4 with the nearest identity was Stenotrophomonas sp. SCU- B130 95.9 homology. Keywords : homology, morphology, strain, characterization Pendahuluan Identifikasi konsorsium diperlukan untuk mengenali komposisi kelompok organisme yang serupa yang hidup bersama dan saling berinteraksi secara sinergis antar mikrob, baik yang terjadi pada mikrob di permukaan daun filosfer atau mikrob di rizosfer. Identifikasi secara molekuler sangat menentukan keakuratan identifikasi, karena tergantung pada DNA yang diekstraksi Suwanto 1994. Gen RNA ribosomal paling banyak digunakan sebagai penanda molekuler. Pada prokariot, 16S rRNA yang paling sering digunakan digunakan sebagai penanda molekuler karena molekul ini ditemukan di semua prokariot dengan fungsi yang identik Pangastuti 2006. Pada penelitian sebelumnya, telah dilakukan uji kombinasi konsorsium mikrob filosfer Fm48 dari daun muda tumbuhan Elmerrillia ovalis Miq. Dandy dengan konsorsium mikrob rizosfer R15 dari rizosfer tumbuhan Physalis angulata L. Kombinasi kedua konsorsium efektif meningkatkan pertumbuhan dan hasil tanaman padi. Untuk mengetahui komposisi penyusun konsorsium dan peran mikrob penyusunnya dilakukan identifikasi dan karakterisasi. Analisis sekuen gen 16S ribosom RNA sebagai alat untuk identifikasi molekuler merupakan cara identifikasi yang saat ini umum digunakan untuk bakteri dengan keakuratan tinggi. Pendekatan molekuler ini telah banyak digunakan untuk aplikasi identifikasi dan filogeni bakteri yang mengarah ke pembentukan besar database prokariot yang sangat besar Drancourt et al. 2000. Janda dan Abbott 2007 menyatakan bahwa penggunaan urutan gen 16S rRNA untuk mempelajari taksonomi dan filogeni bakteri yang paling umum digunakan berdasarkan sejumlah alasan : 1 berlaku untuk hampir semua bakteri, 2 fungsi gen 16S rRNA dari waktu ke waktu tidak berubah, 3 perubahan urutan acaknya lebih akurat dengan ukuran waktu evolusi; dan 4 gen 16S rRNA 1.500 bp ukurannya cukup besar untuk tujuan informatika. Penelitian ini bertujuan mengidentifikasi anggota konsorsium mikrob filosfer dan rizosfer secara molekuler serta mengkarakterisasi sifat fisiologi dan biokimia mikrob serta menguji peran masing-masing anggota terhadap pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Bahan dan Metode Tempat dan waktu Penelitian dilaksanakan mulai bulan Desember 2013 hingga Januari 2014 di laboratorium Bioteknologi Lingkungan Indonesian Centre for Biodiversity and Biotechnology ICBB Situ Gede, Bogor. Bahan dan alat Bahan yang digunakan terdiri atas bahan-bahan untuk identifikasi mikrob secara molekuler dan uji biokimia, bahan-bahan untuk uji kemampuan menambat N 2 , uji kemampuan melarutkan P dan uji hemolisis. Alat yang digunakan terdiri dari : Alat-alat untuk media biakan, identifikasi mikrob dan uji biokimia, uji kemampuan menambat N 2 , uji kemampuan melarutkan P dan uji hemolisis. Metode Identifikasi mikrob secara molekuler. Metode isolasi DNA mengacu pada publikasi Atashpaz et al. 2010 yang telah dimodifikasi. Gen 16S rRNA diamplifikasi menggunakan mesin Polymerase Chain Reaction PCR, dice mini TAKARA. Primer yang digunakan adalah 16F27 primer 5’AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’, R1492 5’-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACTT- 3’ Santosa 2001. PCR master mix Thermo scientific dreamtaq green PCR Master mix2x disiapkan dalam volume akhir 50 µl yang mengandung 25 µl PCR master mix, 5 µl 1 µM primer forward, 5 µl 1 µM primer reverse, 1 µl ekstrak DNA dan air bebas nuclease sampai volume akhir tercapai. Proses amplifikasi dilakukan sebagai berikut : denaturasi awal selama 3 menit pada suhu 95 o C, denaturasi pada suhu 95 o C selama 30 detik, annealing pada suhu 48 o C selama 30 detik dan pemanjangan rantai pada suhu 72 o C selama 1.5 menit. Setelah 30 siklus berakhir, ditambah dengan pemanjangan rantai pada akhir pada suhu 72 o C selama 10 menit. Produk PCR dielektroforesis pada gel agarose 1.5 dengan tambahan pewarna ethidium bromide menggunakan buffer TAE Tris-acetate-EDTA 1x. Produk PCR dikirim ke PT. Genetika Science Indonesia, Jakarta untuk disekuen. Hasil sekuen DNA dibandingkan dengan sekuen pada database European Bioinformatic Institute EBI menggunakan piranti FASTA 3 pada situs http :www.ebi.ac.uk. Morfologi koloni mikrob. Isolat ditumbuhan pada media padat NB dalam cawan petri. Lalu diinkubasi selama 24 jam dalam inkubator pada suhu 35 o C. Setelah mikrob tumbuh dan membentuk koloni diamati morfologi koloninya. Koloni mikrob yang diamati meliputi warna, bentuk koloni, elevasi kenampakan dari samping, bentuk pinggiran tepi dan tekstur permukaan Hadioetomo 1993. Selanjutnya pengamatan morfologi sel bakteri meliputi bentuk sel, ukuran sel dan pewarnaan Gram Schaad et al. 2001. Pewarnaan Gram. Suspensi bakteri dioleskan pada kaca obyek kemudian difiksasi. Selanjutnya diberi pewarna primer, yaitu ungu kristal lalu didiamkan selama 1 menit. Preparat dibilas dengan air menggunakan botol semprot, lalu dikeringkan bagian pinggir kaca obyek degan tisu sambil dikeringanginkan. Selanjutnya diberi larutan iodium dan didiamkan selama 2 menit dan dibilas dengan air menggunakan botol semprot. Preparat dicuci dengan pemucat warna etanol 95, tetes demi tetes selama 30 detik atau sampai zat warna ungu kristal tidak terlihat, kemudian dicuci dengan air menggunakan botol semprot dan dikeringanginkan. Selanjutnya diberi pewarna tandingan Safranin selama 30 detik, lalu dibilas dengan air menggunakan botol semprot dan dikeringanginkan. Preparat kemudian diamati menggunakan mikroskop pada pembesaran 1000 kali. Bila bakteri berwarna biru gelap atau ungu berarti Gram + dan bakteri berwarna merah berarti Gram - Hadioetomo 1993. Uji biokimia. Bahan yang digunakan adalah oxidase strip, Microbact 24E, reagent set D Ind, VP, TDA, Nitrat, mineral oil. Biakan murni disiapkan dengan umur 18 jam, test oksidase dilakukan dengan cara koloni tunggal digoreskan pada oxidase strip selama 5 – 10 detik, bila hasilnya berwarna ungu mudabiru berarti +, bila tidak berwarna berarti -. Koloni bakteri sebanyak 2 – 3 koloni dilarutkan dalam 6 ml NaCl 0.85 steril, lalu divortex sampai homogen. Microbact 24E, diambil dan dibuka sealnya, isikan 3 tetes suspensi bakteri ke dalam tiap lubang. Pada lubang lysine, ornithine, H 2 S lubang 1, 2, 3 ditambah 2 tetes mineral oil. Pada lubang arginine lubang 24 ditambah 2 tetes mineral oil, kemudian seal ditutup kembali, inkubasi pada suhu 37 o C selama 18 – 24 jam. Setelah inkubasi 18 – 24 jam, hasil dibaca dengan panduan tabel warna. Pada lubang ONPG 7 setelah dibaca hasilnya, pada lubang yang sama bertutut-turut ditambah 1 tetes Nitrat A dan 1 tetes Nitrat B untuk menentukan hasil nitrat. Pada lubang IND indol, 8 ditambahkan 2 tetes indol kovaks segera dibaca, pada lubang VP 10 berturut-turut ditambah 1 tetes VP1 dan 1 tetes VP2 hasilnya dibaca setelah 15 menit, pada lubang TDA 12 ditambah 1 tetes TDA hasilnya dibaca setelah 30 menit. Test motilitas. Medium motilitas semi padat dibuat dengan komposisi per 100 ml : beef extract 0.3 g, peptone 1 g, NaCl 0.5 g, Agar 0.4 g, aquades 100 ml. pH larutan diatur 7.3. Lalu dipanaskan dan dimasukkan dalam tabung reaksi sebanyak 4 – 5 ml, kemudian disteril pada pada suhu 121 o C selama 15 menit. Test dilakukan dengan cara memasukkan kultur isolat dengan menggunakan jarum ose yang ditusukkan tepat di tengah media hingga ke bagian bawah media. Selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 o C. Setelah diinkubasi diamati, apabila terbentuk turbid keruh di sekitar tusukan jarum ose menunjukkan motilitas isolat yang diuji positif Mac Faddin 1979. Uji kemampuan isolat menambat N 2. Uji kemampuan isolat untuk menambat N 2 secara kualitatif dilakukan dengan cara menumbuhkan isolat pada media NFb Nitrogen free bromthymol dengan komposisi per liter : asam malat 5.0 g, K 2 HPO 4 0.5 g, MgSO 4 .7H 2 O 0.2 g, NaCl 0.1 g, CaCl 2 .2H 2 O 0.02 g. larutan unsur minor 2 ml CuSO 4 .5H 2 O 0.4 g, ZnSO 4 .7H 2 O 0.12 g, H 3 BO 3 1,13 g, Na 2 MoO 4 1,0 g, MnSO 4 .H 2 O 1.5 g per liter air suling, larutan bromthymol blue 0.5 dalam 2 N KOH 2 ml, FeEDTA 1.64 4 ml, vitamin 1 ml Biotin 10 mg dan Pyriodoxol-HCl 20 mg ditera menjadi 100 ml dengan pelarut air suling dan agar 1.75 g. pH larutan diatur hingga 6.8 dengan pemberian KOH. 10 ml larutan kultur murni disuspensikan dalam 90 ml larutan garam fisiologis steril NaCl 0,85 dalam air suling, lalu lakukan pengenceran hingga 10 7 . 1 ml larutan ditambahkan ke media NFb dan diinkubasi selama 1 minggu. Pelaksanaan diulang sebanyak tiga kali. Setelah satu minggu terjadi perubahan warna dari hijau menjadi biru dan membentuk pelikel putih di bawah permukaan. Penambatan N 2 oleh mikrob yang akan menyebabkan kenaikan pH media karena membentuk NH 4 + . Setelah beberapa hari pH meningkat lebih dari 1.0 unit Saraswati et al. 2007. Aktivitas dari mikrob penambat N 2 secara tidak langsung diukur berdasarkan pengurangan gas asetilen menggunakan Gas Chromatoghraphy GC. Isolat ditumbuhkan pada media bebas N. Kemudian 0.5 – 1 ml sampel dimasukkan ke dalam tabung inkubasi berkapasitas 30 ml. Selanjutnya ditambahkan asetilen dan diinkubasi selama 1 – 2 jam. 1 ml gas disedot dan diinjeksi ke Gas Chromatoghraphy. Jumlah dari produksi etilen digunakan untuk menghitung N 2 yang ditambat oleh isolat. Hasil pengukuran pada beberapa konsentrasi diperoleh peak area yang digunakan untuk membuat persamaan regresi kurva baku yang dijadikan acuan dalam perhitungan konsentrasi gas etilen dalam sampel. Penghitungan konsentrasi gas etilen dilakukan dengan cara membandingkan peak area gas dalam sampel yang akan dihitung konsentrasinya dengan peak area gas standar yang sudah diketahui konsentrasinya Hidayati 2014. Uji kemampuan isolat melarutkan P. Uji kemampuan isolat melarutkan P dilakukan dengan menggunakan medium padat Pikovskaya, mengandung 5 g glukosa, 5 g Ca 3 PO 4 2 , 0.5 g NH 4 2 SO 4 , 2 g KCl, 0.1 g MgSO 4 .7H 2 O, 0.001 g MnSO 4 , 0.001 FeSO 4 , 0.5 g yeast ekstrak, 20 g agar dan aquades 1000 ml. Secara aseptik ambil koloni yang dengan ose steril, goreskan pada media agar, dan inkubasi pada suhu kamar selama 1-3 hari. Adanya zona bening di sekitar bakteri mengindikasikan adanya kemampuan isolat bakteri melarutkan fosfat Saraswati et al. 2007. Uji hemolisis. Pengujian hemolisis digunakan untuk menguji bakteri yang memiliki aktifitas hemolitik atau berpotensi patogen terhadap manusia dan hewan. Isolat murni bakteri ditumbuhkan pada media blood agar, kemudian diinkubasi selama 18 – 24 jam pada suhu 37 o C. Adanya zona yang dihasilkan oleh isolat yang ditumbuhkan mengindikasikan bahwa isolat berpotensi patogen Lay 1994. Hasil Hasil amplifikasi gen 16S rRNA menggunakan PCR Polymerase Chain Reaction isolat kultur tunggal anggota penyusun konsorsium mikrob filosfer FM48 dan mikrob rizsosfer R15 disajikan pada Gambar 9. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 kb Gambar 9. Hasil amplifikasi produk PCR isolat bakteri 1kb DNA Ladder bp : 250, 500, 750, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 5000, 6000, 8000, 10000 . 1= Fm481, 2 =Fm482, 3=Fm483, 4=Fm484, 5=Fm485, 6=R151, 7=R152, 8=R153, 9=R154 1500 1000 750 500 250 Identifikasi anggota konsorsium mikrob filosfer Fm48 Identifikasi molekuler berbasis sekuen gen 16S rRNA anggota konsorsium mikrob filosfer Fm48, disajikan pada Gambar 10. Konsorsium Mikrob Filosfer Fm48 Fm48 1 95.5 16S rRNA homolog dengan Serratia sp. SE-3 Fm48 2

98.7 16S rRNA homolog dengan

Enterobacter sp. NII-24a Fm483 96.2 16S rRNA homolog dengan Enterobacter sp. MS5 Fm484 96.5 16S rRNA homolog dengan Klebsiella oxytoca LRC 162 Fm485 94.7 16S rRNA homolog dengan Acinetobacter sp. Fsh11 Gambar 10. Konsorsium mikrob filosfer beserta anggota penyusun konsorsium Morfologi koloni Karakter morfologi koloni isolat kultur tunggal anggota penyusun konsorsium Fm48 disajikan pada Tabel 19. Tabel 19. Karakter morfologi koloni isolat anggota penyusun konsorsium Fm48 Kode Isolat Spesies homolog Strain Homologi Morfologi koloni Fm481 Serratia sp. SE-3 95.5 Berwarna merah, berbentuk bulat, permukaan cembung, tepi rata, tekstur basah smoot Fm482 Enterobacter sp. NII-24a 98.7 Berwarna krem susu, berbentuk bulat, permukaan cembung, tepi rata, tekstur basah Fm483 Enterobacter sp. MS5 96.2 Bening, berwarna krem, permukaan tidak terlalu cembung, tepi rata, tekstur basah Fm484 Klebsiella oxytoca LRC162 96.5 Berwarna krem, berbentuk bulat, tepi rata, permukaan cembung, tekstur basah Fm485 Acinetobacter sp. Fsh11 94.7 Bening, berbentuk bulat kecil, tepi rata, agak cembung, tekstur basah Keterangan : Fm48 = konsorsium mikrob filosfer dari daun muda tumbuhan Elmerrillia ovalis Miq. Dandy,