20
Pengujian Bilangan Peroksida Metode Titrimetri BSN, 1998
Susu yang akan diukur bilangan peroksidanya, lemaknya terlebih dahulu diekstraksi menggunakan pelarut heksana. Susu dimaserasi dengan heksana selama
24 jam. Filtrat yang ada ditampung dan dipekatkan dengan rotary evaporator. Residu dimaserasi lagi sampai fltrat yang tertampung berwarna jernih. Ekstrak pekat yang
diperoleh dikumpulkan dan ditimbang untuk mengetahui rendemen ekstrak. Ekstrak lemak susu sebanyak 3-5 g dimasukkan ke dalam erlenmeyer 300 ml.
Campuran larutan dari 20 ml asam asetat glasial, 25 ml metanol 95 dan 55 ml kloroform ditambahkan sebanyak 30 ml, kemudian ditambahkan 1 g kristal kalium
iodida, larutan dihomogenkan dengan cara digoyang dan disimpan ditempat gelap selama 30 menit. Air suling bebas CO
2
aquades ditambahkan sebanyak 50 ml, dihomogenkan kembali, kemudian dititrasi dengan larutan standar natrium tiosulfat
0,02 N. Larutan kanji yang digunakan sebagai indikator ditambahkan ketika warna kuning larutan hampir hilang dan titrasi dilanjutkan hingga warna biru menghilang.
Jumlah ml larutan natrium tiosulfat yang terpakai untuk menitar dicatat. Titrasi juga dilakukan terhadap blanko. Nilai peroksida yang terdapat di dalam sampel
dihitung dengan rumus:
Keterangan: V1 =
volume natrium tiosulfat untuk titrasi sampel ml V0 =
volume natrium tiosulfat untuk titrasi blanko ml T =
normaslitas natrium tiosulfat N m =
bobot sampel g
Elektroforesis
Metode elektroforesis yang digunakan mengacu pada metode Laemmli 1970. Tahapan proses terbagi atas pembuatan gel dan pewarnaan.
a. Pembuatan gel.
Pembuatan gel diawali dengan pembuatan larutan stok SDS-PAGE.
Larutan A yaitu larutan stok akrilamid yang terdiri dari 75 g akrilamid 30 wv, 2 g bis dan 250 ml H
2
O. Larutan A ini ditaruh di botol gelap dan disimpan pada suhu 4
°
C. Bahan pembuat gel yang digunakan adalah
21 Amonium Peroksodisulfat APS sebanyak 1 g yang dilarutkan dalam 10 ml
H
2
O. Pembuatan buffer reservoir yang terdiri dari 28,8 g glisin 0,192 M, 6 g tris buffer 0,025 M, lalu ditambahkan HCl hingga dicapai pH 8,3, kemudian
ditambahkan 2 g SDS 0,1 wv, dan ditepatkan volumenya hingga 2 liter. Pembuatan larutan B yaitu stok buffer gel pemisah yang terdiri dari 1 g SDS
dan 45,5 g tris buffer 1,4 M, kedua campuran ini dilarutkan dan dtepatkan pHnya hingga 8,8 menggunakan HCl, dan ditambahkan aquades hingga
volumenya 250 ml. Stok buffer gel pengumpul yang digunakan terdiri dari 15,1 g tris bufer 1,4 M dan dilarutkan dengan HCl hingga pH 6,8, kemudian
ditambahkan 1 g SDS dan ditepatkan volumenya hingga 250 ml. Persiapan dilanjutkan dengan pembuatan stok double strength buffer
sampel yang terdiri dari 2 ml mercapto, 4 ml gliserol, 0,3 g tris buffer, 2 ml Bromfenol Blue 0,1 wv dalam air, kemudian campuran ini dilarutkan
dengan aquades pada volume kurang dari 20 ml, ditambahkan HCl hingga pH menjadi 6,8, kemudian ditambahkan 0,92 g SDS dan ditepatkan volumenya
hingga 20 ml. Gel dibuat dengan cara mengombinasikan larutan stok yang telah dibuat sebelumnya. Kombinasi larutan dalam pembuatan gel meliputi
6,25 ml larutan stok akrilamid, 4,1 ml buffer gel pemisah, 4,4 ml aquades, 0,15 ml SDS 10 wv, 10 ml APS 10 wv dan 25 ml TEMED.
b. Pewarnaan
Larutan pewarna yang digunakan adalah pewarna perak silver staining. Bahan pembuat pewarna perak ini terdiri dari larutan fiksasi
fixation solution, larutan pencuci washing solution, larutan pemeka sensitizing solution untuk membuat lebih sensitif, larutan pewarna staining
solution dan larutan pengembang developing solution untuk memunculkan pita protein. Larutan fiksasi terdiri dari 125 ml metanol 50, 30 ml asam
asetat 12, 0,125 ml formalin 0,05, dan dilarutkan dengan 95 ml aquabides, kemudian disimpan pada suhu ruang. Larutan pencuci terdiri dari 100 ml
etanol 20 dan 400 ml aquabides, disimpan pada suhu ruang. Larutan pemeka sensitizing solution yang digunakan adalah 0,05 g Na
2
S
2
O
3
yang dilarutkan dalam 250 ml aquabides, disimpan pada suhu ruang. Larutan
pewarna terdiri dari 0,1 g AgNO
3
dilarutkan dengan 50 ml aquabides dan
22 ditambahkan 38 ml formalin, kemudian disimpan pada suhu 4
°
C. Larutan pengembang terdiri dari 3 g Na
2
CO
3
, 25 ml formalin, 1 ml Na
2
S
2
O
3
dan dilarutkan dalam 50 ml aquabides. Khusus untuk larutan pewarna dan larutan
pengembang harus dalam keadaan segar. Pembuatan gel yang telah selesai dilakukan, dilanjutkan dengan
pewarnaan staining. Gel direndam dalam larutan fiksasi selama 2 jam sambil diagitasi pelan-pelan dan didiamkan sampai semalam. Gel kemudian
dicuci dengan larutan pencuci washing solution selama 20 menit tanpa diagitasi, pencucian ini diulang hingga 3 kali. Gel dibilas dengan aquabides
selama 10 detik, lalu direndam dalam larutan pemeka sensitizing solution selama 1 menit, dan dibilas kembali dengan aquabides sampai tiga kali
dengan masing-masing selama 20 detik. Gel direndam dalam AgNO
3
0,1 dan diinkubasi di dalam refrigerator selama 20 menit. Gel dicuci kembali
dengan aquabides selama 20 detik dan diulang 2 kali. Gel dipindahkan ke wadah lain dan dicuci kembali dengan aquabides selama 10 detik. Gel
direndam dalam larutan pengembang developing solution hingga pewarnaan cukup. Gel diangkat dan didiamkan selama 5 menit, kemudian dicuci kembali
dengan aquabides. Hasil dari gel yang telah selesai mendapatkan perlakuan pewarnaan kemudian discanning.
Diagram Alir Proses Penelitian Penelitian Pendahuluan
a. Penentuan Optimasi UV
