berbeda disebabkan oleh perbedaan genetik yang dimiliki oleh masing-masing individu. Runutan hasil sekuen dari lima spesies bila dibandingkan dengan
kombinasi data sekuen dari GenBank yaitu runutan DNA menggunakan primer mat-K dengan species yang sama dari famili Meliaceae diantaranya
S. macrophylla Muellner et al. 2002, S. mahagoni Clayton et al. 2007, K. anthotheca Muellner et al.
2002, M. azedarach Abbott et al. 2009, dan A. indica Muellner et al. 2002
, secara teperinci disajikan pada Lampiran 3.
4.2.2 Keragaman antar spesies Keragaman situs restriksi secara
In Silico
Hasil sekuen diberi perlakuan pemotongan fragmen dengan 18 spesies enzim
melalui program
pDRAW32. Hasil
pemotongan kemudian
diinterpretasikan pada pada 3 gel agarose, marker Promega 100 bp DNA ladder seperti yang disajikan pada Lampiran 1 berdasarkan wilayah ITS2 dan mat-K
dapat dilihat pada Lampiran 2
,
dari analisis menggunakan primer ITS2 dan mat-K yang dipotong dengan 18 enzim secara in silico terjadi banyak pemotongan. Hasil
pemotongan tersebut menunjukkan variasi DNA polimorfisme pada setiap spesies, pola pemotongan yang dihasilkan berbeda untuk masing-masing spesies.
Setiap spesies dipotong oleh enzim yang berbeda dan memiliki enzim tertentu yang hanya memotong pada satu spesies, dapat dilihat secara terperinci pada
Tabel 7.
Tabel 7 Spesies enzim yang hanya memotong pada satu spesies berdasarkan dua region Region
Kode Spesies
Enzim ITS2
M. az M. azedarach
BstUI A. in
A.indica HpaII
K. an K. anthotheca
HhaI S. mc
S. macrophylla MseI
S. mg S. mahagoni
AluI mat-K
M. az M. azedarach
BamHI, BfaI, EcoRI, HaeIII, HinfI, MseI, RsaI, SspI, TaqI
A. in A.indica
BstUI, HpaII S. mg
S. mahagoni AluI, HindIII, HpaII, PstI
S. mc S. macrophylla
EcoRI, HpaII K. an
K. anthotheca HaeIII
Hasil pemotongan kembali dilihat jarak kekerabatan antara semua individu yang diamati yang diinterpretasikan pada dendrogram. Dendrogram yang
disajikan menunjukkan spesies yang satu klaster atau berada dalam klaster yang
berbeda, untuk spesies pada region ITS2 secara terperinci disajikan pada Gambar 9.
Gambar 9 Dendrogram hasil in silico dari lima species berdasarkan ITS2 S.mc : S. macrophylla; S. mg : S. mahagoni; K. an : K. anthotheca; A. in: A. indica;
dan M. az : M. azedarach
Hasil dari Gambar 9 dapat dilihat S. macrophylla dan S. mahagoni berada dalam satu kelompok, kelompok tersebut bergabung dengan K. anthotheca,
kelompok tersebut memiliki kerabat yang agak berjauhan dengan M. azedarach dan A. indica. Pada region mat-K menunjukkan ada dua kelompok yang terbesar
bahwa kekerabatan antara K. anthotheca dan S. mahagoni memiliki kekerabatan yang dekat dan kelompok kedua antara S. macrophylla, A. indica, dan M.
azedarach dan A. indica secara terperinci disajikan pada Gambar 10.
Gambar 10 Dendrogram hasil enzim restriksi dari sekuen DNA GenBank, S. mg : S. mahagoni Muellner et al. 2002; M. az : M. azedarach Abbott et al.
2009; A. in : A. indica Muellner et al. 2003; S. mc : S. macrophylla Muellner et al. 2002; K. an : K. anthotheca Muellner et al. 2002
Hubungan kekerabatan antara beberapa individu dalam suatu famili dapat diukur dari kesamaan sifat dengan asumsi bahwa karakter yang berbeda
disebabkan oleh perbedaan susunan genetik yang dibawa oleh masing-masing individu. Hasil yang berbeda pada dendrogram disebabkan DNA yang digunakan
A.in M. az
K. an S. mg
S.
S. mg
K. an
M. az
S. mc
A.in
berbeda dari segi primer, sehingga DNA yang dihasilkan juga berbeda, untuk ITS2 merupakan wilayah nukleus sedangkan mat-K merupakan wilayah cpDNA.
Keragaman nukleotida
Salah satu pengelompokan dari kelima individu pada region ITS2 berdasarkan perbedaan runutan nukleotida melalui analisis dendrogram yang
disajikan pada Gambar 11 menunjukkan jarak kekerabatan yang terdiri tiga klaster yaitu A. indica dan M. azedarach, disusul K. anthotheca dan S. mahagoni dan
terakhir S. macrophylla.
Gambar 11 Dendrogram dari lima species berdasarkan ITS2 S.mc : S. macrophylla; S. mg : S. mahagoni; K. an : K. anthotheca; A. in: A. indica; dan M. az : M.
azedarach
Jika dibandingkan dengan daerah ITS berdasarkan hasil penelitian Muellner 2011, jarak genetiknya menunjukkan hasil yang sesuai dengan region ITS2. K.
anthotheca dan S. macrophylla satu klaster serta A. indica dan M. azedarach berada dalam satu klaster, seperti yang disajikan pada Gambar 12.
Gambar 12 Dendrogram region ITS Muellner 2011
K. anth S. mah
S. mac A. indi
M. aze
0.00 0.05
0.10 0.15
0.20
S,mg S,mc
Dendrogram berdasarkan hasil runutan pada sekuen mat-K menunjukkan tiga klaster. Klaster M. azedarach dan A. indica berdekatan dengan K. anthotheca
kemudian klaster tersebut berdekatan dengan S. macrophylla disusul dengan S. mahagoni, seperti yang disajikan pada Gambar 13.
Gambar 13 Dendrogram berdasarkan sekuens matK dari lima species S.mc : S. macrophylla; S. mg : S. mahagoni; K. an : K. anthotheca; A. in: A. indica;
dan M. az : M. azedarach GenBank2012
Jika dibandingkan dengan region mat-K pada hasil penelitian Muellner 2003 menunjukkan M. azedarach masih satu klaster dengan A. indica, begitu
juga untuk Khaya dan Swietenia sp. Region ini pada klaster Khaya dan Swietenia sp. dikombinasikan dengan Carapa guianensis sehingga terdapat tiga spesies
dalam satu klaster, dapat dilihat secara terperinci pada Gambar 14.
Gambar 14 Jarak genetik berdasarkan region mat-K Muellner 2003
A.in M.az
K.an S.mc
S.mg
0.0 0.1
0.2 0.3
Hasil analisis jarak genetik menunjukkan bahwa untuk region ITS2 memiliki jarak genetik yang relatif tinggi dibandingkan region mat-K yakni antara
0,1067-0,5887. Spesies dengan jarak genetik yang kecil, yaitu spesies yang secara genetik sama, bersatu pertama kali Finkeldey 2005. Jika jarak genetik yang
dihasilkan relatif tinggi disebabkan objek penelitian yang digunakan adalah antar spesies dalam satu famili, namun sebetulnya sudah mendekati kekerabatan yang
dekat.
Keragaman substitusi nukleotida
Estimasi diferensiasi antara spesies disajikan pada Tabel 8 untuk region ITS2 dengan nilai yang berada pada kanan atas diagonal. Pada wilayah ini
perbedaan yang besar terdapat antara spesies S. macrophylla dengan M. azedarach yaitu sebesar 0,532, sedangkan perbedaan yang terkecil terdapat di
antara M. azedarach dan A. indica sebesar 0,095. Estimasi perbedaan antara spesies di region mat-K disajikan pada tabel yang sama dengan nilai yang berada
di kiri bawah diagonal. Perbedaan yang paling besar berada pada spesies Swietenia sp. sebesar 0,808 sedangkan perbedaan yang terkecil terdapat di antara
spesies M. azedarach dan A. indica yaitu sebesar 0,040.
Tabel 8 Rata-rata substitusi nukleotida per sites antar spesies pada wilayah ITS2 kanan atas diagonal dan mat-K kiri bawah diagonal
Spesies A. in
K. an M. az
S. mc S. mg
A. in 0,000
0,404 0,095
0,515 0,516
K. an 0,065
0,000 0,043
0,212 0,167
M. az 0,040
0,063 0,000
0,532 0,520
S. mc 0,067
0,006 0,064
0,000 0,247
S. mg 0,760
0,804 0,753
0,808 0,000
Hasil dari Tabel 8. untuk melihat kekerabatan antara M. azedarach dan A. indica bisa menggunakan ITS2 dan mat-K. Pada Swietenia sp. dan Khaya sp.
diperlukan primer yang lebih spesifik untuk melihat kekerabatannya. Klasterisasi spesies secara ringkas disajikan pada Tabel 9.
Berdasarkan jarak genetik dari keragaman fragmen maupun keragaman nukleotida terdapat tiga klaster spesies dari masing-masing dua region yang
digunakan, terdapat situasi yang sama pada masing-masing region yaitu M. azedarach dan A. indica selalu berada dalam klaster yang sama.
Tabel 9 Klaster spesies berdasarkan ITS2 dan mat-K Klaster
ITS2 Mat-K
1 M. azedarach dan A. indica
A. indica dan M. Azedarach 2
S. mahagoni dan K. anthotheca K. anthotheca dan A. indica dan M.
azedarach 3
S. macrophylla S. macrophylla, S. mahagoni
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
Kesimpulan dari penelitian ini adalah sebagai berikut: i aplikasi enzim restriksi dapat mendeteksi adanya keragaman untuk semua spesies pada sebagian
dari dua wilayah gen. ii berdasarkan variasi nukleotida, keragaman antar spesies dengan memiliki klaster yang sama yakni antara M. azedarach dan A. indica. Pada
kedua wilayah DNA, terdapat tiga kelompok kekerabatan famili Meliaceae. Perbedaan yang terkecil berdasarkan komposisi nukleotida terdapat di antara
spesies M. azedarach dan A. indica yaitu sebesar 0,040.
5.2 Saran
Eksplorasi primer yang lebih spesifik perlu dilakukan lebih lanjut untuk menduga variasi DNA pada wilayah-wilayah gen yang konservatif cpDNA.
