denaturasi, dua rantai DNA akan terpisah dan masing-masing rantai DNA akan digunakan sebagai cetakan pada proses PCR. DNA yang memiliki struktur
kompleks dapat didenaturasi pada suhu 100
o
C selama beberapa menit namun kemampuan aktivitas enzim Taq DNA polymerase menjadi turun.
2 Tahap penempelan atau annealing Penempelan primer pada DNA cetakan disebut annealing. Besarnya suhu
annealing tergantung pada panjang dan jumlah basa G dan C dalam primer serta konsentrasi garam dalam buffer.
3 Tahap pemanjangan atau extention Reaksi polimerisasi nukleotida oleh enzim Taq DNA polymerase extention
dimulai dari ujung 5’α-fosfat dan berakhir pada ujung 3’ gugus hidoksil H. Suhu extention yang digunakan berkisar antara 70-74
o
C karena pada selang suhu tersebut enzim Taq DNA polymerase bekerja optimum. Lamanya tahap extention
1−2 menit. Waktu extention yang terlalu lama akan menghasilkan produk amplifikasi yang tidak spesifik Saiki et al. 1998. Secara terperinci tahapan PCR
disajikan pada Gambar 1.
Gambar 1 Ilustrasi siklus PCR, 1 denaturasi, 2 annealing, 3 extention, 4 siklus ke-1 selesai Rice 2009
2.4 Sequencing DNA
Sequencing DNA adalah proses penentuan urutan dari basa A, T, G, dan C dalam sepotong DNA. Pada intinya, DNA digunakan sebagai cetakan untuk
menghasilkan serangkaian fragmen yang panjangnya berbeda satu sama lain oleh satu basa. Fragmen kemudian dipisahkan berdasarkan ukuran dan basis di akhir
diidentifikasi menciptakan urutan asli DNA Twyman 2003 dalam Elviana 2010. Aplikasi utama dari sequencing DNA dalam studi sistematik adalah: i
evolusi gen, termasuk studi dari proses yang menghasilkan level variasi sequence urutan basa, studi asal-muasal alel baru atu lokus baru, serta investigasi
pemusatan convergence dan seleksi, ii studi intraspesifik populasi, termasuk pelacakan organisme dan genealogi alel dalam spesies dan variasi geografik,
aliran gen gen flow, hibridasi, serta konservasi genetika, dan iii studi interspesifik populasi, seperti rekonstruksi filogenetik untuk mengevaluasi pola
dan proses evolusi makro Hillis et al. 1996b dalam Elviana 2010.
2.5 Second Internal Transcribed Spacer ITS2
Daerah pada ITS2 dipilih untuk kandidat DNA barcode karena sekuen dari ITS2 berpotensi untuk penanda filogenetik dan secara luas digunakan untuk
rekonstruksi filogenetik pada kedua genus dan pada tingkat spesies Chen 2010. Secara terperinci dapat dilihat pada Gambar 2 bahwa posisi ITS2 termasuk dari
kandidat untuk barcoding namun masih dalam proses penelitian.
Gambar 2 Gen dari tiga genom pada tanaman sebagai kandidat untuk barcoding Chen 2010
ITS merupakan penanda pada DNA yang bersifat universal, penanda tersebut mampu teramplifikasi pada semua organisme tidak termasuk pada
vertebrata. Keuntungan dari ITS adalah dalam membandingkan penanda plastid
pada keturunan biparental memiliki tingkat penggandaan yang tinggi daripada keturunan dari induk betina Muir et al. 2001 dalam Koch et al. 2008.
ITS terus menjadi daerah yang lazim digunakan untuk rekonstruksi filogenetik, angka publikasi sekuen ITS meningkat tiga kali lipat semenjak tahun
2003 Koch et al. 2008 daerah ITS terdiri dari ITS1 dan ITS2 yang terletak di antara ekson 5.8S dan ujung ITS1 dibatasi oleh ekson 18S, sedangkan ujung ITS2
dibatasi oleh ekson 26S, daerah tersebut merupakan daerah yang memiliki tingkat conserved yang tinggi Koch et al. 2008
Tingkat penggandaan yang tinggi merupakan sebuah alasan bagi aplikasi ITS yang luas dalam sistem molekular Rogers dan Bendich 1987 dalam Koch et
al. 2008. Seleksi dari daerah kandidat barcoding pada daerah conserved dapat diselesaikan melalui wilayah ITS. Jika dibandingkan dengan gen 5.8S, ITS1 dan
ITS2 lebih tersedia pada sekuen utama. Selain itu ITS2 lebih conserved daripada ITS1 dan dapat memenuhi untuk perunutan pada tingkat genus Hershkovitz dan
Lewis 1996 dalam Koch et al. 2008. Daerah ITS secara terperinci disajikan pada Gambar 3.
Gambar 3 Diagram daerah internal transcribed spacer Koch 2008
2.6 Maturase-K mat-K
