3.3 Prosedur Penelitian
Metode yang digunakan dalam penelitian ini adalah teknik PCR. Secara umum prosedur penelitian teknik PCR disajikan pada Gambar 5. Tahap penelitian
terdiri dari tiga tahap analisis yaitu analisis sekuen ITS2, analisis fragmen ITS2 dan analisis fragmen mat-K secara in silico.
3.3.1 Analisis Sekuen ITS2 Ekstraksi DNA
Kegiatan ekstraksi dan isolasi DNA dari daun dilakukan dengan menggunakan metode CTAB cetyl trimethyl ammonium bromide yang
dimodifikasi untuk mendapatkan DNA yang cukup murni. Contoh daun 2x2 cm
2
digerus di dalam pestel bersih, lalu dipindahkan ke dalam tube 1,5 mL dan ditambahkan 500−700 larutan penyangga ekstrak dan 100 µL PVP 2. Hasil
gerusan kemudian dikocok dengan vortex agar menjadi homogen, selanjutnya diinkubasi dalam waterbath selama 60 menit pada suhu 65
C. Untuk mengikat DNA ditambahkan kloroform 500 µL dan fenol 10 µL, lalu dikocok sampai
homogen. Sentrifugasi dilakukan untuk memisahkan fase air dan fase bahan organik supernatan pada kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit.
Supernatan diambil dan dipindahkan ke dalam tube baru, lalu ditambahkan isopropanol dingin 500 µL dan NaCl 300 µL. Campuran supernatan dengan
isopropanol dingin dan NaCl disimpan dalam freezer selama 60 menit untuk mendapatkan supernatan DNA. Kegiatan selanjutnya adalah pencucian DNA
dengan menambahkan etanol 100 sebanyak 300 µL lalu disentrifugasi pada kecepatan 11.000 rpm selama 10 menit. Cairan etanol dibuang dengan hati-hati
agar supernatan DNA tidak ikut terbuang, pelet DNA disimpan di dalam desikator selama ±15 menit, selanjutnya ditambahkan larutan penyangga TE 20 µL, setelah
itu dikocok dan disentrifugasi kembali. Langkah tersebut dilakukan sampai mendapatkan DNA yang murni, jika belum mendapatkan DNA yang bersih dan
masih memiliki banyak kotoran perlu diulangi kembali langkah-langkah seperti yang telah dijelaskan di atas. DNA yang bersih dapat diuji melalui tahap
elektroforesis pada gel agarose yang dilakukan pada setiap akhir dari suatu teknik analisis genetik. Agarose yang digunakan memiliki konsentrasi yang berbeda pada
setiap pengujian kualitas DNA sesuai pada teknik yang sedang dilakukan.
Sampel daun
Ekstraksi DNA
Ya
Elektroforesis agarose 1
PCR
Sekuen Restriksi enzim
secara in silico
Analisis Data Tidak
Ya
Tidak Elektroforesis
agarose 2 5 jenis : S. mc, S.
mg, M. az, A. in, dan K. an
CTAB Doyle and Doyle 1990
-ITS2 PCR Banks 1985
5 jenis sampel ITS2
18 enzim sesuai pada 1.2
-BioEdit v.7.0.9 -ClustalW2 EBI-EMBL
-TreeviewX -PopGene, NTSYs dan
pDRAW32
Gambar 5 Bagan alur penelitian di laboratorium S. mc = S. macrophylla; S. mg = S. mahagoni; K. an = K. anthotheca; A. in = A. indica; M. az =M. azedarach
Pengujian Kualitas DNA
DNA hasil ekstraksi kemudian uji kualitas dengan menggunakan teknik elektroforesis agarose 1 wv. Gel ini dibuat dengan melarutkan agarose
sebanyak 0,33 g ke dalam 33 µL larutan TAE tris HCl-acetic acid-EDTA. Kemudian campuran dipanaskan di dalam microwave sampai mendidih. Larutan
gel kemudian dituangkan ke dalam cetakan gel. Cetakan gel tersebut telah dipasang sisircomb yang berfungsi untuk membuat sumur gel. Setelah gel
membeku, sisir dicabut dan gel beserta cetakannya diletakkan di dalam bak elektroforesis yang telah berisi larutan penyangga TAE. DNA hasil ekstraksi
diambil sebanyak 3 µL dan ditambah 2 µL blue juice 10X, selanjutnya dilakukan proses elektroforesis dengan menggunakan aliran listrik dengan tegangan 100 V
selama 1 jam. Gel
yang sudah
dielektroforesis dilakukan
pewarnaan dengan
merendamkan gel di dalam larutan Ethidium Bromida EtBr, yaitu campuran 10
µL EtBr dan 190 mL aquades selama 15 menit. Kemudian profil DNA hasil ekstraksi dideteksi dengan menggunakan UV transilluminator.
Proses Amplifikasi DNA dengan Teknik PCR polymerase chain reaction
DNA hasil ekstraksi diamplifikasi dengan menggunakan primer ITS2. Menurut Marder 2001, primer diperlukan karena DNA polimerase tidak dapat
memulai replikasi tanpa terjadi penempelan primer terlebih dahulu terhadap DNA target. Adapun urutan nukleotida dari primer tersebut terdapat pada Tabel 2.
Tabel 2 Primer yang digunakan untuk amplifikasi DNA Gen
Posisi gen Sekuen primer 5-3
Suhu annealling
°C Sumber
ITS2 Second Internal
Transcribed Spacer
5’-GCT GCG TTC TTC ATC GAT GC-
3’ 48
White et al. 1990
Secara umum proses PCR menggunakan lima komponen utama yang dicampurkan ke dalam tube 0,2 mL. Komponen yang diperlukan untuk teknik
PCR terdapat pada Tabel 3.
Tabel 3 Komposisi bahan-bahan yang digunakan untuk PCR No
Komponen Volume µL
1 Cetakan DNA
2,5 2
Forward Primer 1,9
3 Reverse Primer
1,9 4
Nucleas free water 3,5
5 Green Go Taq Master Mix Kit
10,0 Jumlah
19,8
Proses PCR dilakukan melalui tiga tahapan yaitu denaturation, annealing, dan extention. Pada proses ini suhu yang dipakai berbeda-beda tergantung pada
teknik, bahan kimia dan primer yang digunakan. Pengaturan suhu untuk PCR terdapat pada Tabel 4.
Tabel 4 Tahapan-tahapan dalam proses PCR Tahapan
Suhu °C Waktu menit
Jumlah Siklus Pre-denaturation
95 3
- Denaturation
95 1
- Annealing
48 1
36 Extention
72 1
1 Final Extention
72 10
-
Hasil PCR kemudian dianalisis dengan melakukan elektroforesis gel agarose 2 wv dalam larutan buffer TAE 1x. Setelah running selesai dilakukan distaining
dalam larutan Ethidium Bromide EtBr.
Sequencing DNA
Proses sequencing dilakukan setelah DNA hasil amplifikasi diukur kualitasnya dengan cara dielektroforesis pada gel agarose 2. DNA hasil
amplifikasi tersebut kemudian dikirim ke PT. Genetika Science Indonesia di Singapura bersama primer yang telah digunakan dalam proses amplifikasi.
Kemudian dianalisis
dengan program
ClustalW2 EMBL-EBI
http:ebi.ac.ukToolsmsaclustal-w2, software BioEdit dan TreeViewX Hall 2007 serta analisis keanekaragaman menggunakan software DNAsp versi 3.5
Rozas dan Rozas 1999 digunakan untuk mencari nilai keragaman nukleotida. 3.3.2 Analisis Fragmen ITS2 secara
In Silico
Sekuen DNA dimasukkan pada program pDRAW32 yang dikembangkan oleh AcaClone Software http:www.acaclone.com. Masing-masing sekuen
DNA kemudian dipotong menggunakan 18 enzim restriksi. Setelah dipotong kemudian ditampilkan dengan elektroforesis gel agarose 2 .
3.3.3 Analisis Fragmen matK
Kategori