Pengaruh Minuman Bubuk Kakao Lindak Bebas Lemak terhadap Aktivitas Enzim Antioksidan dan Enzim Detoksifikasi pada Eritrosit dan Plasma Manusia

PENGARUH MINUMAN BUBUK KAKAO LINDAK BEBAS

LEMAK TERHADAP AKTIVITAS ENZIM ANTIOKSIDAN

DAN ENZIM DETOKSIFIKASI PADA ERITROSIT DAN

PLASMA MANUSIA

FITRI HASANAH

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2007

PERNYATAAN MENGENAI TESIS

DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Pengaruh Minuman Bubuk Kakao Lindak Bebas Lemak terhadap Aktivitas Enzim Antioksidan dan Enzim Detoksifikasi pada Eritrosit dan Plasma Manusia adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi mana pun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Agustus 2007

Fitri Hasanah NRP F251050081

RINGKASAN

FITRI HASANAH. Pengaruh Minuman Bubuk Kakao Lindak Bebas Lemak Terhadap Aktivitas Enzim Antioksidan Dan Enzim Detoksifikasi Pada Eritrosit Dan Plasma Manusia. Dibimbing oleh MAGGY T. SUHARTONO dan FRANSISKA R. ZAKARIA

Bubuk kakao bebas lemak merupakan produk substandar dalam pengolahan kakao yang belum banyak dimanfaatkan. Kakao non fermentasi mendominasi hampir semua pengolahan kakao di Indonesia. Bubuk kakao bebas lemak non fermentasi memiliki kandungan polifenol sebesar 4,43 gr/ 100 gr. Kandungan polifenol yang berupa flavonoid ini berpotensi sebagai antioksidan dalam menangkal radikal bebas. Sistem Pertahanan Tubuh Enzimatik terhadap radikal bebas melibatkan berbagai enzim, salah satunya adalah katalase. Sistem detoksifikasi dalam tubuh melibatkan kerja enzim fase I (sitokrom P-450) dan enzim fase II (glutation S-transferase) untuk mengeluarkan toksin atau senyawa asing sehingga tidak membentuk senyawa metabolit radikal dalam tubuh. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak terhadap aktivitas enzim katalase dan sitokrom P-450 serta glutation S-transferase pada eritrosit maupun plasma manusia. Selama 25 hari sebanyak 18 responden wanita yang sehat dibagi dalam dua kelompok, yaitu kelompok kakao (n = 9) dan kelompok kontrol (n = 9), di mana kelompok kakao mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak yang diberi susu skim dan gula, sedangkan kelompok kontrol hanya mengkonsumsi minuman susu skim dan gula saja. Selama penelitian berlangsung makanan dan kesehatan responden di bawah kontrol peneliti. Pengambilan darah responden dilakukan sebelum dan sesudah pelaksanaan intervensi untuk kemudian dilakukan analisa terhadap aktivitas enzim katalase dengan metode kalorimetri dan sitokrom P-450 serta glutation S-transferase dengan metode spektrofotometri. Hasil penelitian menunjukkan bahwa konsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak selama 25 hari menghasilkan peningkatan secara nyata (p < 0,05) terhadap aktivitas enzim antioksidan katalase pada eritrosit dari 999,64 U/ mg protein menjadi 1020,03 U/ mg protein dan pada plasma dari 539,23 U/ mg protein menjadi 584,18 U/ mg protein. Peningkatan juga terjadi pada enzim glutation S-transferase pada eritrosit dari 0,083 nmol/ min/ mg protein menjadi 0,217 nmol/ min/ mg protein dan pada plasma peningkatan dari 0,129 nmol/ min/ mg protein menjadi 0,293 nmol/ min/ mg protein. Sementara itu enzim detoksifikasi sitokrom P-450 mengalami penurunan secara nyata (p < 0,05) pada eritrosit dari 5,43 nmol/ mg protein menjadi 1,59 nmol/ mg protein dan pada plasma dari 2,11 nmol/ mg protein menjadi 0,78 nmol/ mg protein. Secara keseluruhan dari hasil penelitian ini bisa disimpulkan bahwa bubuk kakao bebas lemak yang berasal dari perkebunan di Indonesia dapat meningkatkan sistem pertahanan tubuh secara enzimatis terhadap serangan radikal bebas.

Kata kunci: bubuk kakao lindak bebas lemak, katalase, sitokrom P-450, Glutation S-transferase, flavonoid, antioksidan, detoksifikasi

ABSTRACT

Fitri Hasanah. The Effects of Fat Free Bulk Cocoa Powder Drinks Consumption on Antioxidant and Detoxification Enzyme Activity in Human Erythrocyte and Plasma. Under the supervision of MAGGY T. SUHARTONO and FRANSISKA R. ZAKARIA

The fat free cocoa powder is substandard product from cocoa processing. Fat free unfermented cocoa powder have about 4,43 gr/ 100 gr of polyfenol. Cocoa is rich in flavonoid with antioxidant activity. Enzymatic defence system in humans consists of: catalase, superoxide dismutase (SOD) and glutathione peroxide (GPx). Detoxification metabolism consists of two phases that enable man to excreate out toxic from the body. This system need enzyme such as cytochrome P-450 and glutation S-transferase (GST). The aim of this research was to determine the effect of Indonesian fat free cocoa powder drink consumption on the antioxidant enzymes activity namely catalase and on the detoxification enzyme namely cytochrome P-450 and GST in human erythrocyte and plasma. Eighteen women healthy subjects were recruited and divided into two groups, control subjects (n = 9) and cacao subjects (n = 9). Cocoa powder drinks containing cocoa (50 %), skim milk (25 %) and sugar (25 %) was given to the groups. The control group received only water contain skim milk (50 %) and sugar (50 %). The criteria of the respondents were healthy according medical diagnosis and signed the informed of consent. Both cocoa and experimental group received medical check up at the beginning and at the end of the intervention. The activity of catalase was analyzed based on calorimetry and spectrofometry. Their peripheral blood were withdrawn to analyze activity of catalase, cytochrome P-450 and GST. The result showed that there was a significant increased in activity catalase of erythrocyte from 999,64 U/ mg protein to 1020,03 U/ mg protein and also on plasma from 539,23 U/ mg protein to 584,18 U/ mg protein. The activity of GST in erythrocyte was a significant increased from 0,083 nmol/ min/ mg protein to 0,217 nmol/ min/ mg protein and also on from 0,129 nmol/ min/ mg protein to 0,293 nmol/ min/ mg protein. The result showed that there was a significant decreased in cytochrome P-450 of erythrocyte from 5,43 nmol/ mg protein to 1,59 nmol/ mg protein and also on plasma from 2,11 nmol/ mg protein to 0,78 nmol/ mg protein. In conclusion, the Indonesian fat free cocoa powder has increased human defences system from free radical attact that may damage the cell.

Keyword: cocoa, flavonoid, catalase, Cytochrome P-450, Glutathione S-transferase (GST), antioxidant, detoxification

© Hak cipta milik IPB, tahun 2007

Hak cipta dilindungi

Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam bentuk apa pun, baik cetak, fotokopi, microfilm, dan sebagainya

PENGARUH MINUMAN BUBUK KAKAO LINDAK BEBAS

LEMAK TERHADAP AKTIVITAS ENZIM ANTIOKSIDAN

DAN ENZIM DETOKSIFIKASI PADA ERITROSIT DAN

PLASMA MANUSIA

FITRI HASANAH

Tesis

sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada

Departemen Ilmu Pangan

SEKOLAH PASCASARJANA

INSTITUT PERTANIAN BOGOR

BOGOR

2007

Judul Penelitian : Pengaruh Minuman Bubuk Kakao Lindak Bebas Lemak terhadap Aktivitas Enzim Antioksidan dan Enzim

Detoksifikasi pada Eritrosit dan Plasma Manusia Nama Mahasiswa : Fitri Hasanah

NRP : F251050081

Disetujui Komisi Pembimbing

Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria, MSc Ketua Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Ilmu Pangan Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof.Dr.Ir.Betty Sri Laksmi Jenie,MS Prof.Dr.Ir. Khairil Anwar Notodiputro,MS

KATA PENGANTAR

Alhamdulillahirabbil”alamin, Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga penelitian dan penulisan tesis ini dapat diselesaikan dengan baik. Judul tesis ini adalah “Pengaruh Minuman Bubuk Kakao Lindak Bebas Lemak terhadap Aktivitas Enzim Antioksidan dan Enzim Detoksifikasi pada Eritrosit dan Plasma Manusia”, yang merupakan syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Sekolah Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor.

Terima kasih penulis ucapkan kepada Tim Riset Unggulan Terpadu XII (RUT) tahap II tahun 2006 yaitu Bapak Dr. Ir. Misnawi (Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia di Jember) dan Ibu Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria, M.Sc. (Dosen Pascasarjana Ilmu Pangan IPB) atas bantuan dana penelitian.

Penghargaan dan terima kasih penulis haturkan kepada Ibu Prof. Dr. Ir. Maggy T. Suhartono sebagai ketua komisi pembimbing dan Ibu Prof. Dr. Ir. Fransiska R. Zakaria, M.Sc selaku anggota komisi pembimbing yang telah banyak memberikan dorongan, pengarahan, saran serta motivasi selama penulis menyelesaikan studi. Terimakasih juga kepada Bapak Dr. Ir. Nugraha Edi Suyatma, DEA selaku penguji yang telah banyak memberi sarannya.

Kepada semua responden atas keikhlasan dan kerjasamanya selama penelitian berlangsung juga disampaikan rasa terima kasih yang mendalam. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada tim kakao, yaitu Welli, Eris, Retno, Erni, dan Femi serta teman-teman mahasiswa pascasarjana program studi ilmu pangan khususnya angkatan 2005, dan semua pihak yang telah memberikan bantuan selama penelitian berlangsung. Terimakasih juga diucapkan kepada teman-teman di Pondok PCH atas kebersamaannya. Tak lupa untuk seluruh rekan-rekan seperjuangan di KMNU IPB, Forum WACANA IPB, PMII semoga kita bisa terus berjuang dan berkarya.

Akhirnya ungkapan terima kasih yang dalam disampaikan kepada Ayahanda Yakin Sabri HS, BA dan Ibunda Husnaini, SPd atas seluruh pengorbanan dan doa yang telah diberikan, juga kepada adik-adik dan keluarga besar di Bengkulu. Tak lupa kepada H. Mahir Moh. Soleh LC “Zaujy al-Mustaqbal bi al-Hubb wa al-Da’am wa al-Du’a” beserta keluarga. Semoga Allah SWT memberikan balasan amal baik kepada mereka semua dengan pahala yang tak terhingga.

Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Bogor, Agustus 2007

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Bengkulu pada tanggal 15 Juli 1983 sebagai anak pertama dari empat bersaudara, dari Bapak Yakin Sabri HS, BA dan Ibu Husnaini, SPd.

Tahun 2001 penulis lulus dari SMU Negeri 3 Bengkulu dan pada tahun yang sama penulis meneruskan pendidikan Sarjana di Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Universitas Muhammadiyah Malang.

Pada tahun 2005 penulis lulus dari Jurusan Teknologi Hasil Pertanian, Universitas Muhammadiyah Malang.

Tahun 2005 penulis diterima di Sekolah Pascasarjana IPB pada program studi Ilmu Pangan.

Selama menyelesaikan studi di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor, penulis aktif dalam berbagai organisasi diantaranya yaitu Keluarga Mahasiswa Nahdlatul Ulama (KMNU) SPs IPB, Forum Mahasiswa Pascasarjana IPB dan Pergerakan Mahasiswa Islam Indonesia (PMII).

DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI ... v

DAFTAR TABEL ... vi

DAFTAR GAMBAR ... vii

DAFTAR LAMPIRAN ... viii

PENDAHULUAN..……….……….... 1

Latar Belakang………...……….. 1

Tujuan Penelitian ………. 3

Hipotesis Penelitian ……….…….…………. 3

Manfaat Penelitian ……….... 4

TINJAUAN PUSTAKA ... 5

Kakao... 5

Flavonoid Pada Kakao... 8

Antioksidan... 10

Radikal Bebas dan Kerusakan Sel... 12

Sistem Pertahanan Tubuh Nonenzimatik... 15

Sistem Pertahanan Tubuh Enzimatik... 15

Metabolisme Xenobiotik dan Detoksifikasi Senyawa Beracun... 17

Metabolisme Senyawa Bioaktif... 23

Komponen Darah... 25

Eritrosit... 25

Plasma ... 26

METODOLOGI... 27

Tempat dan Waktu Penelitian... 27

Bahan dan Alat... 27

Alur penelitian ... 28

Metode Penelitian... 29

HASIL DAN PEMBAHASAN... 37

Keadaan Umum Responden... 37

Aktivitas Enzim Antioksidan Katalase pada Eritrosit... 42

Aktivitas Enzim Antioksidan Katalase pada Plasma... 47

Aktivitas Enzim Sitokrom P-450 pada Eritrosit... 53

Aktivitas Enzim Sitokrom P-450 pada Plasma... 59

Aktivitas Enzim Glutation S-transferase pada Eritrosit... 65

Aktivitas Enzim Glutation S-transferase pada Plasma... 69

SIMPULAN DAN SARAN ... 75

Simpulan... 75

DAFTAR PUSTAKA... 77

DAFTAR TABEL

Nomor Halaman

1. Kandungan polifenol produk kakao ………. 6 2. Jenis-jenis Reactive Oxygen Species dan radikal bebas

yang berperan pada kerusakan sel ... 10 3. Data antropometri responden sebelum dan sesudah intervensi ... 38 4. Menu makan pagi dan makan malam responden yang

DAFTAR GAMBAR

Nomor Halaman

1. Kakao …...……….... 6

2. Struktur kimia flavonoid ….……….……… ... 6

3. Pembagian kelas Flavonoid ……….………... 8

4. Pembagian kelas Flavonoid ... 10

5. Metabolisme Xenobiotik di tubuh ..………... 19

6. Diagram alir penelitian... 28

7. Grafik Aktivitas Enzim Katalase pada Eritrosit Kelompok Perlakuan sebelum dan sesudah intervensi ... 43

8. Grafik Aktivitas Enzim Katalase pada Eritrosit Kelompok Kontrol sebelum dan sesudah intervensi ... 43

9. Grafik Aktivitas Enzim Katalase pada Plasma Kelompok Perlakuan sebelum dan sesudah intervensi ... 48

10.Grafik Aktivitas Enzim Katalase pada Plasma Kelompok Kontrol sebelum dan sesudah intervensi ... 48

11.Grafik Kadar Sitokrom P-450 pada Eritrosit Kelompok Perlakuan sebelum dan sesudah intervensi ... 55

12.Grafik Kadar Sitokrom P-450 pada Eritrosit Kelompok Kontrol sebelum dan sesudah intervensi ... 55

13.Grafik Kadar Sitokrom P-450 pada Plasma Kelompok Perlakuan sebelum dan sesudah intervensi ... 60

14.Grafik Kadar Sitokrom P-450 pada Plasma Kelompok Kontrol sebelum dan sesudah intervensi ... 60

15.Reaksi GSH dan CDNB ... 66

16.Grafik Aktivitas Enzim Glutation S-transferase (GST) pada Eritrosit Kelompok Perlakuan sebelum dan sesudah intervensi ... 67

17.Grafik Aktivitas Enzim Glutation S-transferase (GST) pada Eritrosit Kelompok Kontrol sebelum dan sesudah intervensi ... 67

18.Grafik Aktivitas Enzim Glutation S-transferase (GST) pada

Plasma Kelompok Kontrol sebelum dan sesudah intervensi ...71 19.Grafik Aktivitas Enzim Glutation S-transferase (GST) pada

DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Halaman

1. Informed concent

Pernyataan kesediaan menjadi responden penelitian………... 88 2. Kuisioner kesehatan fisik, pola makan dan

kebiasaan konsumsi makanan jajanan ... 89 3. Jadwal penelitian ... 100 4. Data-data hasil penelitian ... 101

PENDAHULUAN

Latar Belakang

Kakao merupakan bahan pangan yang apabila diolah ke dalam bentuk produk seperti bubuk kakao memiliki citarasa yang enak sehingga banyak disukai oleh masyarakat. Lemak kakao merupakan bagian yang paling banyak diambil dari tanaman ini karena bernilai ekonomis tinggi. Pada saat pemisahan lemak kakao, bubuk kakao itu sendiri tertinggal menjadi produk substandar yang belum banyak dimanfaatkan. Padahal hasil penelitian menunjukkan bahwa bubuk kakao bebas lemak tadi memiliki kandungan polifenol yang berpotensi sebagai sumber antioksidan. Oleh karena itu masih perlu terus digali pemanfaatan kakao bebas lemak sebagai produk substandar sehingga memiliki nilai ekonomis yang tinggi pula.

Indonesia adalah negara ketiga penghasil kakao terbesar di dunia setelah Pantai Gading dan Ghana. Ada dua jenis kakao yang umum dikenal di Indonesia, yaitu kakao mulia atau edel kakao (fine/ flavour cocoa) dan kakao lindak (bulk cocoa). Kakao lindak mendominasi hampir seluruh perkebunan di Indonesia. Kualitas dari produk olahan kakao yang dihasilkan sangat tergantung kepada kualitas biji kakao dan proses pengolahan. Salah satu faktor yang sangat menentukan adalah proses fermentasi biji kakao sebelum diolah. Cita rasa coklat yang baik dapat diperolah bila kakao tersebut difermentasi dengan baik. Berdasarkan data Direktorat Jenderal Bina Produksi Perkebunan (2004), kakao Indonesia khususnya yang dihasilkan oleh petani, di pasaran internasional dihargai paling rendah, karena didominasi oleh biji-biji tanpa fermentasi. Namun demikian proses fermentasi itu sendiri menyebabkan kandungan senyawa kimia dalam biji kakao menjadi berubah terutama senyawa flavonoid yang dapat memberikan efek positif untuk kesehatan. Berdasarkan penelitian Misnawi dan Selamat (2003) kandungan polifenol dalam biji kakao menurun sampai 50% selama proses fermentasi. Berbagai cara dilakukan untuk menggali potensi kakao lokal yang non fermentasi tersebut, salah satunya dengan mengekstraksi dan memanfaatkan lemak kakao serta meneliti potensi komponen bioaktif flavonoid

pada bubuk kakao bebas lemak non fermentasi sebagai antioksidan dalam tubuh manusia.

Dalam berbagai penelitian disebutkan bahwa aktivitas antioksidan yang utama bisa diperoleh dari komponen-komponen seperti flavonoid, isoflavon, flavon, antosianin dan katekin disamping vitamin C, E dan β-karoten. Biji kakao dinyatakan sebagai bahan yang kaya akan flavonoid yang erat kaitannya sebagai zat yang mempunyai kapasitas antioksidan bagi tubuh. Penelitian pendahuluan telah dilaksanakan untuk mengidentifikasi adanya komponen flavonoid dan senyawa polifenol lainnya baik pada makanan maupun minuman termasuk pada kakao. Misnawi et al (2002) menyatakan bahwa dalam bubuk biji kakao bebas lemak mengandung polifenol sebanyak 5-18 %. Lebih lanjut Zairisman (2006) menyebutkan bahwa kandungan polifenol bubuk kakao bebas lemak jenis lindak (bulk) masak non fermentasi adalah 4,43 g/ 100 g.

Keberadaan antioksidan dalam tubuh sangat berperan penting dalam mengendalikan radikal bebas. Radikal bebas dan reactive oxygen species (ROS) berasal dari sumber alamiah di dalam tubuh dan dari luar. Kelebihan radikal bebas menyebabkan stress oksidatif yaitu keadaan dimana jumlah antioksidan lebih rendah dibandingkan jumlah radikal bebas. Kondisi ini tentunya berakibat fatal bagi kesehatan. Oleh karena itu diperlukan sistem antioksidan yang dapat melindungi tubuh dari serangan radikal bebas, dengan cara meredam dampak negatif senyawa ini atau bahkan langsung memutuskan rantai radikal bebas yang terbentuk. Salah satu system pertahanan yang dibentuk oleh tubuh adalah system enzimatik melalui enzim-enzim antioksidan misalnya katalase.

Meskipun telah banyak diketahui memiliki khasiat sebagai antioksidan bagi tubuh, flavonoid yang terkandung pada bubuk kakao bebas lemak merupakan senyawa asing atau xenobiotik yang apabila masuk ke dalam tubuh kita akan dimetabolisme melalui sistem detoksifikasi yang melibatkan enzim-enzim fase I maupun fase II, maka masih perlu dilakukan penelitian untuk melihat tingkat keamanan bubuk kakao bebas lemak ini dalam tubuh setelah dikonsumsi oleh manusia.

Penelitian pendahuluan yang telah dilakukan oleh Femi (2006), menunjukkan bahwa bubuk kakao bebas lemak dari jenis lindak (bulk) masak non fermentasi yang berasal dari perkebunan Indonesia atau kakao lokal mempunyai kapasitas sebagai antioksidan dan mempunyai potensi sifat immunodulator pada sel limfosit manusia secara in vitro. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan manusia sebagai subjeknya (in vivo). Dengan demikian dapat diketahui bagaimana tingkat keamanannya dalam tubuh apabila dikonsumsi manusia, dengan melihat pengaruhnya terhadap aktivitas enzim antioksidan katalase, sitokrom P-450 (enzim fase I) dan glutation S-transferase (enzim fase II) serta senyawa radikal bebas dalam tubuh manusia. Selain itu penelitian ini penting dilakukan karena diharapkan dapat meningkatkan citra kakao lindak non fermentasi dari Indonesia di pasar dunia.

Tujuan

1. Untuk mengetahui efek minuman bubuk kakao bebas lemak terhadap aktivitas enzim antioksidan katalase pada eritrosit dan plasma manusia.

2. Untuk mengetahui efek minuman bubuk kakao bebas lemak terhadap aktivitas enzim detoksifikasi Sitokrom P450 (enzim fase I) dan Glutation S-transferase (enzim fase II) pada eritrosit dan plasma manusia.

Hipotesis

1. Minuman bubuk kakao bebas lemak dapat meningkatkan aktivitas enzim antioksidan katalase dan enzim detoksifikasi Glutation S-Transferase (GST) pada eritrosit dan plasma manusia.

2. Minuman bubuk kakao bebas lemak tidak mengubah atau bahkan dapat menurunkan kadar sitokrom P450 pada eritrosit dan plasma manusia.

Manfaat Penelitian

Membuktikan secara ilmiah dan memberikan informasi tentang khasiat minuman bubuk kakao bebas lemak dari jenis kakao lokal lindak non fermentasi terhadap kesehatan, sehingga bubuk kakao yang merupakan produk sisa pemanfaatan lemak kakao atau substandar ini dapat dijadikan sebagai bahan pangan yang bernilai ekonomis tinggi.

TINJAUAN PUSTAKA

Kakao

Pohon kakao (Theobroma cacao L) diperkirakan mula-mula tumbuh di daerah Amazon utara sampai ke Amerika Tengah. Mungkin sampai ke Chiapas, bagian paling selatan Meksiko. Orang-orang Olmec memanfaatkan pohon dan mungkin juga membuat coklat di sepanjang pantai teluk di selatan Meksiko sekitar 1000 tahun SM. Peradaban pertama yang mendiami daerah Mesoamerika itu mengenal pohon “kakawa” yang buahnya dikonsumsi sebagai minuman. Bagi suku Aztec biji kokoa merupakan “makanan para dewa” (theobroma, dari bahasa Yunani).

Klasifikasi ilmiah kakao antara lain: dunia : Plantae

divisi : Spermatophyta sub divisi : Angiospermae kelas : Dicotyledoneae sub kelas : Dialypetaleae

bangsa : Malvales suku : Sterculiaceae marga : Theobroma Gambar 1 Buah kakao jenis : theobroma cacao L

Kakao adalah biji yang diperoleh dari pohon kakao, Theobroma cacao L,

dengan ketinggian pohon 6-12 meter. Tanaman ini dapat tumbuh dengan baik pada area 30-300 meter, pada suhu sedang yaitu berkisar 18-30 ºC dan membutuhkan kelembaban udara yang cukup dengan curah hujan 1-5 liter/ m2 per tahun (Weisburger 2001).

Rasa asli biji coklat sebenarnya pahit akibat kandungan alkaloid, tetapi setelah melalui rekayasa proses dapat dihasilkan coklat sebagai makanan yang disukai oleh siapapun. Biji coklat mengandung lemak 31%, karbohidrat 14% dan protein 9%. Protein coklat kaya akan asam amino triptofan, fenilalanin, dan tirosin. Meski coklat mengandung lemak tinggi namun relatif tidak mudah tengik

karena coklat juga mengandung polifenol (6%) yang berfungsi sebagai antioksidan pencegah ketengikan.

Tabel 1 Kandungan total polifenol produk kakao Produk Kakao Jumlah polifenol total (g /100 g) Bubuk cokelat 2,00

Cokelat batangan 0,84 Susu cokelat 0,50 Sumber: Wollgast dan Anklam (2000)

Indonesia merupakan negara ketiga penghasil kakao terbesar di dunia setelah Pantai Gading dan Ghana. Ada dua jenis kakao yang umum dikenal di Indonesia, yaitu kakao mulia atau edel kakao (fine/ flavour cocoa) yang berasal dari varietas criollo dengan buah berwarna merah dan kakao lindak (bulk cocoa)

berasal dari varietas forestero dan trinitro dengan warna buah hijau. Kakao lindak merupakan kakao kualitas kedua dan digunakan sebagai bahan komplementer dalam mengolah kakao mulia. Meskipun termasuk kualitas kedua dan digunakan sebagai bahan komplementer, jenis kakao lindak mendominasi seluruh perkebunan di Indonesia (Direktorat Jenderal Bina Produksi Perkebunan, 2004). Hal ini disebabkan karena jenis kakao ini relatif lebih tahan terhadap hama dan penyakit, dan tingkat produksinya lebih tinggi dibanding kakao mulia (Zairisman 2006, Siregar et al 2007).

Kualitas dari produk olahan kakao yang dihasilkan sangat tergantung kepada kualitas biji kakao dan proses pengolahan. Salah satu faktor yang sangat menentukan adalah proses fermentasi biji kakao sebelum diolah. Cita rasa coklat yang baik dapat diperolah bila kakao tersebut difermentasi dengan baik. Berdasarkan Direktorat Jenderal Bina Produksi Perkebunan (2004) kakao Indonesia khususnya yang dihasilkan oleh rakyat, di pasaran Internasional dihargai paling rendah, karena didominasi oleh biji-biji tanpa fermentasi. Namun demikian proses fermentasi itu sendiri menyebabkan kandungan senyawa kimia dalam biji kakao menjadi berubah, terutama senyawa flavonoid yang dapat memberikan efek positif untuk kesehatan. Berdasarkan penelitian Misnawi dan Selamat (2003) kandungan polifenol dalam biji kakao menurun sampai 50% selama proses fermentasi.

Menurut Wollgast dan Anklam (2000), kandungan polifenol total dalam produk kakao berbeda-beda. Terdapat berbagai macam produk olahan dari biji kakao yaitu chocolate liquor (pasta kakao), cocoa powder (bubuk coklat), cocoa butter (mentega kakao) dan dark chocolate. Dark chocolate mengandung 15%

chocolate liquor dan 60% cocoa butter, gula dan adiktif. Sedangkan cocoa powder (bubuk coklat) dibuat dengan menghilangkan cocoa butter dari chocolate liquor (Vinson et al. 1999). Produk olahan kakao ini digunakan untuk berbagai jenis olahan makanan, industri farmasi dan industri kosmetik. Bubuk kakao banyak digunakan sebagai bahan pembuat roti, es krim, permen dan juga untuk minuman. Cocoa butter banyak digunakan untuk industri makanan, kosmetik dan farmasi (Pusat Penelitian Kopi dan Kakao 2004).

Bubuk kakao bebas lemak dari biji kakao non fermentasi sebagai sumber flavonoid merupakan usaha yang sedang dirintis di Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia di Jember. Bubuk kakao bebas lemak tersebut adalah produk kakao yang berbentuk bubuk yang diperoleh dari pasta kakao setelah dihilangkan lemaknya. Bubuk kakao bebas lemak dibuat melalui proses sebagai berikut : biji kakao basah dicuci bersih dan dioven pada suhu 50ºC sampai kadar air 7,5%. Selanjutnya kulit ari dipisahkan, keping biji yang diperoleh dihaluskan dengan blender (penghancur biji). Pasta kakao yang diperolah kemudian dipisahkan lemaknya (defatting) dalam soxhlet apparatus menggunakan pelarut petroleum benzene (titik didih 40-60ºC). Bubuk kakao yang diperoleh kemudian dihaluskan sampai kehalusan <40 mesh dan kemudian disimpan dalam kemasan yang kedap udara (Misnawi 2005). Berdasarkan penelitian Misnawi et al (2003) dikemukakan bahwa dalam bubuk kakao bebas lemak dari biji kakao non fermentasi terdapat 120-180 g/kg polifenol. Bubuk kakao bebas lemak dari verietas bulk masak berdasarkan penelitian Zairisman (2006) mengandung total fenol sebesar 4,43 gr/ 100 gr. Kandungan polifenol kakao juga sangat tergantung pada proses pengolahan dan produk akhir. Hasil penelitian Misnawi et al. (2002b) juga mendapatkan bahwa aktifitas antioksidan polifenol biji kakao masih tetap tinggi walaupun telah dipanaskan sampai suhu 140ºC selama 45 menit.

y p a k p C d a b y j 2 p d d p 2 f Rasa yang dimilik pigmen pew akibat oksid komponen l pengawet da Flavon C6-C3-C6 d dan reaksi k aktivitas an bioflavonoid yang merup jenuh yang 2000). Flavo phenylbenzo dasarnya, ya dari dua cin piran atau p 2000). Hal i flavonoid ad

a pahit yang kinya yaitu warna alami, dasi. Adanya lemaknya se ari luar. noid merupa dan berperan

kelat pada l ntioksidanny d. Kompone akan senyaw merupakan onoid memi opyrones (ph

aitu tiga cin ncin benzena piron dengan ini dipertega dalah rangka G Flavon

g terdapat pa flavonoid. senyawa pe a flavonoid d ehingga men

akan kelomp n dalam mek

logam (Hall ya di dala en antioksida wa reaktif y

penyusun m

iliki berat

henylchromo

ncin utama y a (A dan B)

n ikatan gan as lagi oleh aian cincin ka

Gambar 2 St

noid pada k

ada kakao b Flavonoid m emberi cita r dalam kakao ngurangi ke

ok senyawa kanisme don l 2001). Fla am tubuh an ini dapat yang dapat b membran, RN

molekul ren

ones) denga yang saling

yang dihubu nda yang dis Miean dan arbon C₆C₃

truktur kimia

kakao

berkaitan den memainkan

rasa dan pel o dapat menc ebutuhan aka

a yang memp nor hidrogen avonoid umu

sehingga menetralisir bereaksi den NA dan DNA

ndah, dan p an berbagai melekat. Str ungkan mela sebut cincin

Mohamed C₆.

a flavonoid ngan kompo peran pentin lindung dari cegah keten an penamba

punyai ciri k n, penangkap umnya dike

sering jug r reaktivitas ngan asam le A (Hammer

pada dasarn variasi pad ruktur dasar alui cincin h n ”C” (Midd (2001) bahw onen kimia ng sebagai kerusakan gikan pada ahan bahan konfigurasi pan radikal enal karena ga disebut dari ROS, emak tidak rstone et al

nya adalah da struktur r ini terdiri heterosiklik dleton et al

Flavonoid yang terpenting yang ditemukan dalam kakao adalah flavanol yang terdiri dari monomer katekin dan epikatekin dan oligomer procianidin (CIC 2001).

Gambar 3 Struktur kimia katekin, epikatekin dan prosianidin pada kakao (Andersen dan Markham, 2006)

Flavonoid yang merupakan salah satu sub kelas dari polifenol mempunyai 7 kelas utama yaitu antochyanin, proantochyanin, isoflavone, flavanone, flavonol, flavanol, dan flavone.

FLAVONOID

Flavanon Flavon

Luteolin Apigenin Antosianin

Delphinidin Sianidin

Flavonol

Quercetin Kaemferol

Proantosianin

Flavanol

Epikatekin Katekin

Isoflavon

Genistein Daidzein Polimer

flavanol

ASAM FENOLIK Polifenol lainnya

(non flavonoid)

Hesperetin Tangertin

POLIFENOL

R₁=H, R₂=OH=(+)-catekin Prosianidin R₁=OH, R₂=H=(-)epikatekin

Kakao mengandung senyawa flavonoid golongan flavanol, yang memberikan efek yang menguntungkan bagi tubuh. Selain itu juga bisa mengurangi resiko mortalitas dan morbiditas kardiovaskuler, kanker dan osteoporosis dan bisa mencegah penyakit neurodegeneratif serta diabetes militus (Grassi et al 2006). Murphy et al (2003) menyatakan bahwa mengkonsumsi flavonoid dan prosianidin secara teratur dapat meningkatkan konsentrasi epikatekin dan katekin di dalam plasma tetapi tidak menyebabkan oksidasi, dan juga dapat mengurangi agregasi dan aktivasi platelet penyebab peradangan. Prosianidin kakao bermanfaat dalam modulasi respon imun dan inflamasi pada mamalia. Selain itu, prosianidin kakao dari kakao cair ataupun kering bisa terdapat dalam makanan, suplemen dan obat-obatan untuk modulasi produk gen sitokin dan kadar protein dan memberikan efek menguntungkan pada penderita penyakit asma, peradangan akibat virus atau resiko peradangan virus (Schmitz et al 2001). Prosianidin yang dikombinasikan dengan L-arginin meningkatkan pengaruh fisiologis dalam memproduksi nitrat oksida pada mamalia yang mencerna produk itu. Efeknya antara lain menurunkan tekanan darah, ketahanan terhadap penyakit kardiovaskuler dan aktivitas antikanker (Cheuvaux etal 1999).

Pada manusia, bioavailabilitas flavonoid berkisar antara 1-26 %. Pada tubuh kita flavonoid akan bersikulasi dalam plasma, terdapat sebagai glukoronida, methyl dan sulfat konjugat atau kombinasi dari ketiganya yang merupakan hasil reaksi enzim fase I dan fase II (Grassi et al 2006).

Antioksidan

Antioksidan adalah zat yang mampu memperlambat atau mencegah proses oksidasi (Schuler, 1990). Menurut Gutteridge dan Halliwell (1996), antioksidan adalah suatu substansi yang menghentikan atau menghambat kerusakan oksidatif terhadap suatu molekul target. Sementara itu menurut Cillard et al (1980) dan Schluler (1990) antioksidan adalah zat dengan kadar lebih rendah dari zat yang mudah teroksidasi, secara nyata mampu memperlambat oksidasi zat tersebut. Sebaliknya pada kadar tinggi zat antioksidan bersifat peroksidan atau meningkatkan oksidasi. Antioksidan biologis adalah zat yang mampu melindungi

sistem biologis dari kerusakan akibat kelebihan oksidasi (Krinsky 1992). Antioksidan primer adalah zat yang dapat bereaksi dengan radikal bebas atau mengubahnya menjadi produk yang stabil, sedangkan antioksidan sekunder atau antioksidan preventif dapat mengurangi laju awal reaksi rantai atau tahap inisiasi reaksi oksidasi.

Ada 2 macam antioksidan yaitu antioksidan primer dan sekunder (Winarno, 1997), yaitu :

1. Antioksidan Primer

Antioksidan primer adalah suatu zat yang dapat menghentikan reaksi berantai pembentukan radikal yang melepaskan hidrogen. Zat-zat yang termasuk golongan ini dapat berasal dari alam seperti tokoferol, lesitin, fosfatida, dan asam askorbat serta antioksidan buatan seperti BHA (Butylated hydroxyanisole), BHT (Butylated hydroxytoluene), dan PG (Propylgallate).

2. Antioksidan Sekunder

Antioksidan sekunder adalah suatu zat yang dapat mencegah kerja prooksidan sehingga dapat digolongkan sebagai sinergi. Beberapa asam organik tertentu dapat mengikat logam-logam (sequestran), misalnya satu molekul asam sitrat akan mengikat prooksidan Fe seperti sering dilakukan pada minyak kacang kedelai. EDTA (Etilendiamin tetra asetat) adalah sequestran logam yang sering digunakan dalam minyak salad.

Mekanisme kerja antioksidan dapat melalui beberapa cara, antara lain yang dilaporkan oleh Charpentier dan Cateora (1996) adalah: 1) menghambat terbentuknya radikal bebas, 2) menjadi perantara dalam netralisasi radikal bebas yang telah terbentuk (scavenger), 3) menurunkan kemampuan radikal bebas dalam reaksi oksidasi, dan 4) menghambat enzim oksidatif, misalnya sitokrom P-450. Penghambatan reaksi radikal bebas akan melidungi hepatosit normal dari kerusakan dan mengoptimalkan lingkungan bagi sel-sel hati untuk bergenerasi. Menurut Shahidi (1997), antioksidan diketahui bekerja pada berbagai tahapan oksidasi molekul lemak, yaitu dengan cara menurunkan kadar oksigen, menangkap singlet oksigen, pencegahan tahap inisiasi reaksi rantai melalui penangkapan radikal hidroksil, pengikatan ion logam katalisator, dekomposisi

produk utama menjadi senyawa non radikal dan pemutusan reaksi rantai untuk mencegah kelanjutan penarikan elektron dari substrat. Antioksidan dapat berasal dari bahan alami dan sintetik. Sumber antioksidan alami telah banyak dilaporkan berasal dari tanaman.

Menurut Papas (1999), enzim-enzim antioksidan seperti katalase, glutathion peroksidase, superokside dismutase, dan peroksidase merupakan lini pertama dari sistem pertahanan tubuh yang menahan pembentukan radikal bebas. Pada lini pertahanan kedua, antioksidan yang menangkap radikal seperti vitamin C, vitamin E, karotenoid dan flavonoid berfungsi untuk menghambat rantai inisiasi dan atau memecah rantai propagasi. Lini pertahanan ketiga dipegang oleh enzim fosfolipase, protease, transferase, dan DNA repair enzyme yang berfungsi untuk memperbaiki kerusakan membran. Lini terakhir dari sistem pertahanan tubuh adalah proses adaptasi, dimana tubuh akan memproduksi enzim antioksidan yang sesuai untuk ditransfer ke sisi tertentu pada waktu dan konsentrasi yang tepat.

Penelitian tentang antioksidan pada tanaman telah banyak dilakukan. Chipault et al (1952) menguji aktivitas antioksidan dari 32 jenis rempah-rempah dan Puspita-Nienaber et al (1992) menguji aktivitas antioksidan dari 23 jenis ekstrak rempah-rempah asal Indonesia. Nakatani (1997) meringkas hasil penelitian tentang aktivitas antioksidan senyawa fenolik dari berbagai tanaman, antara lain: rosmaridifenol, rosmarikuinon, epirosmanol, dan isorosmanol dari

rosemary; karnosol dari sage; asam hidroksibenzoat dan hidroksinamat dari

oregano; thymol dan karvarol dari thyme; kapsaicin dan hidrokapcaisin dari cabe; sesamol dan lignan dari wijen; katekin dari teh hijau; dan kurkuminoid dari kunyit. Zhu et al (2005) menyatakan bahwa katekin, epikatekin, yang diisolasi dari kakao dapat mengurangi kerentanan eritrosit terhadap radikal bebas penyebab hemolisis.

Radikal bebas dan kerusakan sel

Radikal bebas dapat menyebabkan stres oksidatif. Stress oksidatif merupakan keadaan ketidakseimbangan antara reaktif oxygen species (ROS) /

Jika radikal bebas berada dalam jumlah berlebihan dan jumlah antioksidan seluler tetap atau lebih sedikit maka kelebihannya tidak bisa dinetralkan dan berakibat pada kerusakan sel (Langseth 1995; Palmer & Paulson 1997). Kerusakan sel merupakan gangguan atau perubahan yang dapat mengurangi viabilitas dan fungsi essensial sel (Kehrer 1993). Stress oksidatif dapat menyebabkan kematian sel secara apoptosis dan nekrosis. Menurut Zitouni et al (2005), radikal bebas juga dapat mengganggu endotelium dan memacu terjadinya kerusakan membran, sebagai contohnya akan meningkatkan ekresi albumin urin dan memacu diabetes.

Reaksi tidak terkendali radikal bebas terhadap komponen sel seperti asam lemak tidak jenuh ganda (PUFA), heksosa, pentosa, asam amino dan komponen DNA menghasilkan beberapa produk seperti : Malonaldehida atau MDA, diena terkonjugasi, dikarbonil dan asam 15-hidroperoksi-5,8,4,13 eikosatetraenoik (15-HPETE). MDA merupakan melekul dialdehid yang mempunyai tiga atom karbon dan bersifat reaktif (Rice-Evan et al. 1991; Zaden et al. 1995). 1,1,3,3-tetraetoksipropan merupakan prekusor malondialdehid sehingga sebagai larutan standar dapat digunakan larutan tetraektoksipropan.

Malonaldehida atau MDA (C3H4O2) merupakan salah satu hasil

peroksidasi asam lemak tidak jenuh (ALTJ) terutama asam arakhidonat (Bird dan Draper, 1984; Frankel dan Neff, 1983). Malonaldehida atau MDA dijumpai juga sebagai produk samping biosintesis prostaglandin. Pengukuran MDA telah digunakan sebagai indeks tidak langsung kerusakan oksidatif yang disebabkan oleh peroksidasi lipida (Auroma 1997).

Peningkatan kadar Malonaldehida dapat ditekan dengan pemberian antioksidan seperti vitamin C, A, dan E dan beberapa komponen bioaktif (Cho et al. 2000; Palloza et al. 2000; Kris-Ethon & Keen 2002) yang secara keseluruhan dapat menekan proses peroksidasi lipid.

Senyawa-senyawa yang menjadi target ROS atau radikal bebas adalah molekul-molekul seluler dan ektraseluler antara lain: protein, asam lemak tidak jenuh ganda, glikoprotein, lipoprotein dan bahan-bahan penyusun DNA seperti karbohidrat dan basa purin.

Di bawah ini disajikan beberapa jenis radikal bebas dan ROS yang berperan pada kerusakan sel.

Tabel 2 Jenis-jenis Reaktif Oxygen Species dan radikal bebas yang berperan pada kerusakan sel

Radikal bebas Lambang Non radikal Lambang Hidrosil

Superoksida Nitrit oksida Lipid peroksida

OH* O2*

NO* LOO*

Hidrogen peroksida Singlet oksigen Asam hipoklorida Ozon

H2O2 1

O2

HOCl O3

(Halliwell & Gutteridge 1999).

Berdasarkan hasil penelitian, radikal bebas dan ROS dalam tubuh makhluk hidup berasal dari :

1. Pada organisme aerob, 95% oksigen dalam sel direduksi menjadi air oleh rantai pernafasan pada mitokondria, proses reduksi ini melibatkan 4 elektron dan 2 proton. Kebocoran elektron diperkirakan mencapai 1-5%, elektron yang bocor ini bereaksi dengan oksigen membentuk radikal superoksida (O2*),

hidrogen peroksida (H2O2) dan radikal hidroksil (OH*) (Lehninger, 1993).

2. Reduksi O2 menjadi superoksida pada fagositosis. Fagositosis merupakan salah

satu sistem pertahanan humoral dalam melawan infeksi atau bahan asing yang masuk kedalam tubuh. Dengan bantuan NADPH-oksidase, netrofil dan makrofag (Haliwell & Gutteridge 1999).

3. Peristiwa iskemi yaitu deplesi ATP akibat kekurangan oksigen dimana terjadi pemecahan ATP menjadi AMP, adenosine dan hipoxantin. Hipoxantin diubah oleh xantin oksidase, menjadi asam urat dan radikal bebas seperti: superoksida, hidrosil dan hydrogen peroksida (Greenwald 1985; Haliwell & Gutteridge 1999).

4. Reaksi Fenton dan Haber-weiss, melalui reaksi oksidasi-reduksi yang dikatalis oleh Fe+2 dan Fe+3. Fe+2 dan Fe+3 berasal dari hemoglobin dan mioglobin (Greenwald 1985; Zakaria 1996; Haliwell & Gutteridge 1999).

5. Radikal bebas juga dihasilkan dari reaksi metabolisme eicosanoidi yaitu metabolisme asam arakhidonat melalui mekanisme prostaglandin atau

leukotrin. Perubahan ini menghasilkan ROS (Rise-Evan et al. 1991; Haliwell 1994).

6. Secara alamiah sel-sel tubuh baik sel normal ataupun sel kanker melakukan apoptosis yaitu program bunuh diri. Apoptosis menjadi penting karena jika jumlahnya menjadi berlebihan maka akan memicu kelainan. Pada saat sel melakukan apoptosis maka semua isi sel akan keluar (Roitt 1991; Haliwell & Gutteridge 1999).

Sistem pertahanan tubuh nonenzimatik

Sistem pertahanan tubuh nonenzimatik terhadap serangan radikal bebas melibatkan vitamin C, vitamin E dan komponen-komponen bioaktif. Pertahanan nonenzimatik terhadap radikal bebas dibagi atas 2 kelompok besar yaitu : sistem pertahanan preventif dan pemutusan rantai reaksi radikal bebas (Nabet 1996).

Sistem pertahanan tubuh enzimatik

Sistem Pertahanan Tubuh Enzimatik terhadap radikal bebas melibatkan : enzim superoksida dismutase (SOD), katalase dan glutation peroksidase (GSH-Px) (Halliwell et al. 1992; Schmidl et al, 2000).

a. Superoksida dismutase (SOD)

Superoksida dismutase adalah metaloenzim yang mengkatalis dismutasi radikal anion superoksida menjadi hydrogen peroksida dan oksigen. SOD tidak stabil terhadap panas, cukup stabil pada kondisi basa. SOD masih mempunyai aktivasi walaupun disimpan selama 5 tahun pada suhu 5 0C (http:/www. Orthington-biochem.com). Untuk aktivitasnya SOD membutuhkan logam seperti Zn, Cu, dan Mn sebagai kofaktor (Mc Cord & Fridovich 1969).

Aktivitas SOD dihambat oleh sianida dan H2O2, oleh karena SOD

dihambat oleh H2O2 maka dalam kerjanya SOD sangat membutuhkan katalase

(Rice-Evan et al. 1991; Haliwell & Gutteridge 1999). Aktivitas SOD (U/g jaringan) tertinggi ditemukan didalam hati. SOD juga ditemukan pada kelenjar adrenalin, ginjal, darah, limfa, pankreas, otak, paru-paru, lambung, usus, ovarium, dan timus (Haliwell and Gutteridge 1999).

Aktivitas SOD diukur berdasarkan pengukuran aktivitas enzim secara tidak langsung, salah satunya dengan metode yang dikembangkan oleh Misra dan Fridovich (1997). Metode ini berdasarkan kepada kemampuan penghambatan autooksidasi epinefrin menjadi adenokrom oleh SOD. Perubahan epinefrin menjadi adenokrom menimbulkan warna coklat, makin besar kadar SOD sampel maka makin besar penghambatan dan makin kurang intensitas warna. Warna coklat dideteksi secara spektrofotometri.

b. Enzim Glutation Peroksidase

Glutation Peroksidase merupakan selonoprotein sebagai active site, terdiri dari 4 sub unit protein yang dapat mengkatalis reaksi reduksi H2O2 menjadi

senyawa organik hidroperoksida (ROOH) (Rice-Evan et al. 1991; Haliwell 1994). Glutation peroksidase menggunakan glutation tereduksi (GSH) sebagai substrat. Glutation Peroksidase mereduksi hidroperoksida dan pada saat yang sama glutation tereduksi mengalami oksidasi. Pada manusia, aktivitas glutation peroksidase sebanding dengan konsentrasi selenium (Se) plasma.

Glutation Tereduksi

Glutation (L-γ-glutamil-cysteinyl-glisin) merupakan tripeptida yang mengandung gugus sulfuhidril (-SH). Glutation merupakan salah satu sistem antioksidan, terutama berpartisipasi dalam penghancuran H2O2 dan peroksida

organik (Greenwald 1985). Ada dua jenis glutation yaitu glutation tereduksi dan glutation teroksidasi. Glutation banyak ditemukan dalam sitosol hati. Keberadaan GSH di dalam sel sangat diperlukan sebagi substrat glutation peroksidase dan sebagai senyawa konjugat detoksifikasi xenobiotik pada reaksi enzim fase II (Hodgoson & Levi 2000).

c. Enzim katalase

Katalase merupakan enzim yang mengkatalis reaksi pemecahan senyawa hidrogen peroksida menjadi oksigen dan air.

2H₂O₂ Katalase H₂O + O₂

Katalase ditemukan pada hewan dan tumbuhan tingkat tinggi. Katalase pada mamalia disusun oleh 4 sub unit protein. Tiap unit terdiri dari satu gugus hem

azida, sianida dan HOCl tapi meningkat dengan meningkatnya akumulasi H2O2

(Haliwell & Gutteridge 1999).

Pada manusia, katalase ditemukan di dalam darah, ginjal, limfa, pankreas, otak, jantung, paru-paru, adipose, kelenjar adrenal dan konsentrasi tertinggi terdapat pada hati (± 1400 U/mg protein) ( Halliwell 1994) bersama-sama dengan glutation peroksida (Greenwald 1985). Pada organ dan jaringan ini katalase ditemukan di dalam peroksisom, mitokondria, dan retikulum endoplasma. Hidrogen peroksida di dalam tubuh melalui dua mekanisme yaitu:

1. Pemecahan oleh katalase membentuk air dan molekul oksigen 2H₂O₂ Katalase H₂O + O₂

2. Pemecahan oleh glutation peroksidase dengan bantuan substrat glutation GSH- + H₂O₂ GSH-Px GS + H₂O

Salah satu metode penentuan aktivitas katalase adalah metode kalorimetri yang dikembangkan oleh Sinha (1972). Metode ini menggunakan zat warna bikromat sebagai indikator dimana ion bikromat dalam suasana asam dapat direduksi oleh H₂O₂menjadi kromat. Perubahan warna yang muncul dibaca secara spektrofotometri pada panjang gelombang 570 nm. Satu unit aktivitas katalase adalah banyaknya H₂O₂ yang dipakai oleh katalase permenit.

Metabolisme xenobiotik dan detoksifikasi senyawa beracun

Toksikologi dapat didefenisikan sebagai cabang ilmu yang mempelajari tentang zat-zat yang beracun. Namun pengertian ini terus berkembang seiring dengan semakin kompleksnya kehidupan sosial masyarakat. Selanjutnya toksikologi tidak hanya dikaitkan dengan zat-zat yang beracun tetapi juga mempelajari tentang pendeteksian, keberadaan, efek dan regulasi dari senyawa toksik (Hodgoson & Levi, 2000). Toksikologi berhubungan erat dengan cabang farmakologi/ farmasi. Hal ini bisa dijadikan dasar pengetahuan tentang metabolisme senyawa asing atau yang lebih dikenal dengan xenobiotik (Murray et al. 1999). Xenobiotik merupakan senyawa asing yang masuk ke dalam tubuh kita

dan bukan merupakan komponen gizi. Xenobiotik ini dikeluarkan oleh tubuh kita melalui proses detoksifikasi (Hodgoson & Levi, 2000).

Toksikologi pangan berhubungan erat dengan keamanan pangan karena makhluk hidup tidak lepas dari makanan. Berbagai macam makanan ternyata tidak sepenuhnya bebas dari zat kimia toksik atau xenobiotik yang berada pada makanan sebagai zat tambahan makanan, pencemar makanan ataupun zat toksik alamiah. Contoh xenobiotik pangan antara lain alkohol, flavon (zat toksik alamiah), BHA (antioksidan pangan), benzopiren yang terdapat pada daging panggang dan lain sebagainya (Donatus 2001).

Timbulnya pengaruh bahaya atau efek toksik racun atas makhluk hidup terjadi melalui beberapa proses. Pertama kali makhluk hidup menerima racun, berikutnya mengalami absorbsi, distribusi racun atau metabolitnya ke tempat aksi yaitu sel sasaran atau reseptor yang ada dalam makhluk hidup. Di dalam aksi ini, kemudian terjadi reaksi antara racun atau metabolitnya ke tempat aksi sel sasaran atau reseptor, dan berbagai peristiwa biokimia dan biofisika berikutnya, akhirnya timbul pengaruh berbahaya atau efek toksik dengan wujud dan sifat tertentu. Jadi toksisitas suatu senyawa ditentukan oleh keberadaan yang meliputi kadar dan lama tinggal senyawa itu atau metabolitnya di tempat aksinya dan keefektifan antar aksinya (mekanisme aksi). Reaksi yang berlangsung juga tergantung pada kondisi makhluk hidup (Donatus 2001).

Metabolisme senyawa beracun dapat didefenisikan sebagai perubahan hayati atau biotransformasi zat kimia toksik menjadi suatu metabolit yang secara kimia berbeda dengan zat kimia induknya, dalam diri makhluk hidup. Hal ini mengandung arti bahwa pertama, di dalam tubuh zat kimia toksik tersebut mungkin mengalami perubahan struktur molekul melalui mekanisme tertentu. Kedua, perubahan bentuk struktur tersebut akan mengakibatkan perubahan sifat-sifat fisika-kimia yang berbeda dengan zat induk. Ketiga, bentuk ubahannya yang disebut bentuk metabolit yang memilki sifat fisika kimia yang berbeda dengan zat induk. Keempat, akibat perubahan sifat fisika-kimia tersebut menyebabkan metabolit memiliki kelarutan dalam air atau lipid, aktivitas dengan jaringan atau tempat aksi dan aktivitas intrinsik yang berbeda dengan zat induknya. Kelima,

hasil bersih berbagai perubahan biokimia tersebut adalah perubahan ketoksikan zat induk, sehingga respon toksik makhluk hidup terhadap racun juga akan berubah (Donatus 2001).

Beberapa langkah biotransformasi xenobiotik dalam tubuh terlihat pada gambar berikut:

Lipofilik tinggi Lipofilik Polar Hidrofilik

Polar

Hidrofilik

Gambar 5 Biotransformasi xenobiotik di tubuh (Blaauboer 1996)

Hodgoson & Levi (2000) menyebutkan bahwa mekanisme pergerakan bahan toksik melewati membran-membran khususnya pada awal masukan, merupakan hal yang kurang menjadi perhatian dengan baik, meskipun sesungguhnya telah

XENOBIOTIK

Terakumulasi terutama dalam lemak

Reaksi Fase I

(Bioaktivasi atau Inaktifasi) Oksidasi, Reduksi, Hidrolisis

Reaksi Fase II

(Bioaktivasi) Konjugasi

Mobilisasi Pengeluaran dari tubuh

Melalui Keringat Sirkulasi Plasma (melalui urin)

Enzim yang berperan: Sitokrom P-450 Flavin Containing Monooksigenase Prostaglandin Synthetase Cooxidase

Molibdenum Hidroxylase,dll

Enzim yang berperan: Glutation S-transferase

Metyl transferase Cystein Konjugate Lyase

dilakukan pada masalah khusus obat-obatan. Terdapat 4 mekanisme pokok yang memungkinkan bahan toksik untuk melintasi membran.

1. Transpor pasif. Mekanisme ini mendominasi hampir semua bahan toksik. Pengangkutan pasif melibatkan pergerakan campuran-campuran melewati membran-membran lipid oleh difusi sederhana dengan koefisien pembagi air/ lipid yang sebagian besar menentukan tingkat pergerakan. Campuran-campuran dalam bentuk yang telah diionisasi tidak menggerakan dengan sangat cepat oleh difusi melalui membran untuk beberapa alasan. Pertama, bentuk yang telah diionisasi cenderung memiliki daya larut lipid rendah, sebuah faktor yang sangat penting untuk difusi membran. Kedua, memungkinkan terjadinya interaksi ion antara xenobiotik, lipid, dan protein dalam membran.

2. Filtrasi. Seringkali pori-pori dalam membran memperbolehkan masuknya dengan berat molekul kurang dari 100 dalton. Molekul-molekul yang lebih besar, bagaimanapun juga, dikeluarkan kecuali dalam banyak jaringan-jaringan yang penyerapannya tinggi, seperti ginjal dan hati. Karena kebanyakan bahan toksik relatif bermolekul sangat besar, jalan kecil ini seringkali memiliki arti penting mekanisme penyerapan yang terbatas. Filtrasi umumnya memiliki arti yang sangat penting dalam pembuangan bahan toksik, khususnya ginjal.

3. Transpor khusus. Sejumlah sistem pengangkutan khusus, terutama sekali pada bidang gastro intestinal, membantu dalam pengangkutan campuran endogen melalui membran. Proses tersebut dapat membutuhkan energi dan memungkinkan senyawa untuk melewati gradien konsentrasi (transpor aktif) atau mungkin tidak memerlukan energi dan tidak dapat menggerakkan senyawa melewati sebuah tanjakan/ gradien (pengangkutan yang difasilitasi). Meskipun hasilnya bisa jadi berbeda, mekanisme ini agak mirip dan telah didiskusikan bersama. Pada kedua masalah ini, protein pembawa yang bergabung dengan bahan toksik telah diketahui. Protein ini membantu pergerakan bahan toksik dari satu sisi membran ke yang lain, dan di lain sisi, bahan kimia berpisah dari protein, yang kemudian bebas untuk mengambil

molekul bahan toksik yang lain. Penetrasi seperti itu lebih cepat daripada difusi sederhana dan dalam hal pengangkutan aktif, dapat diproses di luar titik yang berkonsentrasi sama pada kedua sisi membrannya.

Mekanisme ini mungkin menjadi penting dan relatif jarang terjadi dalam bahan toksik yang memiliki bahan kimia atau struktur menyerupai bahan kimia endogen yang berprinsip pada mekanisme pengangkutan khusus untuk pengambilan fisiologi normal dan itu dapat menggunakan sistem yang sama. Sebagai contoh, 5-fluorouracil diangkut oleh sistem pengangkutan timidin. Timah dapat dipindahkan secara cepat dengan sistem pengangkutan yang dilibatkan secara normal pada pengambilan kalsium. Sebagai mekanisme penyerapan, sistem pengangkutan khusus ini banyak dimuat pada penyerapan gastro intestinal. Mekanisme ini menjadi lebih besar perannya dalam pembuangan bahan racun, bagaimanapun juga pengangkutan khusus penting pada pemindahan xenobiotik dan metabolitnya. Sifat penting dari pengangkutan khusus adalah mereka memperbolehkan pergerakan senyawa dengan daya larut lipid lebih rendah, hal ini menyangkut senyawa-senyawa yang biasanya diharapkan untuk bergerak sangat lambat melewati membran lipid yang sangat tinggi. Kebanyakan sistem pengangkutan aktif dihubungkan ke energi yang menghasilkan enzim (misalnya ATPase), dan kedua sistem pengangkutan aktif dan difasilitasi memperlihatkan sifat saturasi (dengan kata lain, saturasi dari ketersediaan protein pembawa oleh molekul bahan toksik). Dengan begitu, kinetik/ ilmu gerak dari sistem pengangkutan khusus dapat dijelaskan lebih baik lagi dengan menggunakan model kinetik enzim Michaelis-Menton.

4. Endositosis. Pinositosis (untuk cairan) dan pagositosis (untuk padat) adalah proses pengangkutan yang dikhususkan pada permukaan membran atau pengaliran disekeliling bahan kimia yang memungkinkan transfer yang lebih cepat melalui membran. Hanya pada pemisahan kejadian seperti penyerapan dari karagen (mol wt ~40.000) dalam usus memiliki mekanisme ini yang telah ditemukan menjadi penting pada masukan awal. Setelah di dalam tubuh,

bagaimanapun juga endositosis adalah mekanisme yang sedikit umum dan penelanan senyawa di dalam paru-paru adalah umum (pagositosis paru-paru)

Berlangsungnya metabolisme senyawa asing di dalam tubuh, dapat terjadi di dalam hati, ginjal, usus, kulit, kelenjar kelamin, plasenta serta darah. Meskipun hati merupakan organ utama dalam sistem biotransformasi, tetapi metabolisme senyawa xenobiotik juga dapat berlangsung pada jaringan-jaringan di luar hati, misalnya saja darah (Krovat et al. 2000). Setelah toksikan masuk ke dalam sirkulasi darah, maka toksikan tersebut akan didistribusikan atau disebar ke seluruh jaringan tubuh manusia (Donatus 2001). Menurut Hodgoson dan Levi (2000), cairan tubuh memegang peranan penting dalam pendistribusian toksikan dalam tubuh yang telah diabsorpsi.

Metabolisme seyawa xenobiotik terdiri dari dua fase. Pada fase satu, toksikan bersifat lipofilik akan ditransformasikan oleh enzim-enzim fase satu (monoksigenase) menjadi senyawa-senyawa metabolit yang bersifat polarreaktif grup. Pada fase dua, metabolit yang terbentuk akan dikonjugasikan oleh enzim-enzim fase dua (konjugasi) sehingga dihasilkan senyawa yang bersifat hidrofilik dan mudah diekresikan ke luar tubuh. Namun jika metabolisme senyawa xenobiotik menghasilkan produk yang reaktif, maka akan menimbulkan efek toksik bagi tubuh (Hodgoson & Levi, 2000).

A.Reaksi fase satu

Reaksi-reaksi fase satu meliputi monooksigenasi mikrosom, oksidasi mitokondria dan sitosol, kooksidasi dalam reaksi sintesis prostaglandin, reduksi, hidrolisis dan hidrasi epoksida. Semua reaksi pada fase satu menghasilkan metabolit atau merubah toksikan menjadi lebih polar sehingga dapat dikonjugasi dalam reaksi-reaksi fase dua dan mudah diekresikan baik secara langsung maupun tidak langsung setelah mengalami reaksi fase satu (Hodgoson & Levi, 2000). Lebih lanjut, Donatus (2001) menjelaskan bahwa fungsi utama reaksi metabolisme fase I adalah mengubah struktur senyawa asing melalui proses oksidasi, reduksi atau hidrolisis, guna memasukkan gugus fungsional yang sesuai bagi reaksi konjugasi fase II.

Enzim yang berperan penting dan terlibat paling dominan pada reaksi fase I adalah enzim monoksigenase Sitokrom P-450. Berdasarkan percobaan yang dilakukan oleh Omura dan Sato (1964), maka mereka mendefenisikan Sitokrom P-450 sebagai suatu protein heme yang mengandung satu molekul besi-protoporfirin IX sebagai gugus prostetik atau gugus aktifnya. Nama sitokrom P-450 diperoleh dari kenyataan bahwa sitokrom memberikan satu spektra resapan maksimum pada panjang gelombang 450 nm, bila tereduksi dan terkompleks dengan karbon monoksida. Sifat ini khas diperantarai oleh adanya gugus tiolat sebagai suatu ligan protein heme itu. Menurut Donatus (2001) Sitokrom P-450 menunjukkan selektivitas yang luas terhadap aneka ragam substrat. Keadaan ini disebabkan oleh adanya aneka ragam isoenzim sitokrom tersebut, yang satu dengan yang lainnya berbeda dalam struktur rantai polipeptida dan kekhasan reaksi yang dikatalisirnya.

Induksi terhadap metabolisme fase I, terutama yang dikatalisir oleh sitokrom P-450 mikrosomal memilki arti penting karena sistem ini sering membentuk metabolit perantara yang reaktif atau toksik (Donatus, 2001). Beberapa produk yang dibentuk oleh enzim ini berimplikasi pada penyebab penyakit kanker atau karsinogenik (Shimada et al, 1996). Intermediet yang terdapat dalam aktivasi dioksigen merupakan awal terbentuknya superoksida atau peroksida. Mekanisme aktivasi dioksigen diketahui sebagai tahap terakhir dari katalisis P-450, yang dimulai dengan reduksi komplek dioksigen (Benson et al,

1997).

Ada dua hal penting yang berhubungan dengan fungsi enzim sitokrom P-450, yang pertama adalah enzim ini memiliki jalur yang kritis dan spesifik dalam metabolisme senyawa-senyawa kimia endogenus. Kedua, Proses enzim ini merupakan pokok dari produk-produk alami, bahkan saat ini ditambah dengan bahan-bahan kimia seperti obat-obatan dan xenobiotik lainnya dalam senyawa-senyawa non selektif (Guengerich 1991). P-450 dan komponennya bisa ditemukan di kulit, mukus, paru-paru, gastrointestinal. Selain organ-organ tersebut juga telah banyak dilakukan penelitian tentang keberadaan P-450, diantaranya di hati, ginjal, plasenta, testis serta pada darah (Hodgoson & Levi, 2000).

B. Reaksi fase dua

Pada reaksi fase dua, senyawa yang terhidroksilasi atau senyawa lainnya yang diproduksi dalam fase satu, diubah oleh enzim yang spesifik menjadi berbagai metabolit polar lewat konjugasi dengan asam glukuronat, sulfat, asetat, glutation atau asam amino tertentu lewat metilasi. Reaksi konjugasi ini membuat molekul lebih bersifat dapat larut dalam air sehingga akhirnya dapat diekresikan ke dalam urin dan empedu (Murray et al. 1999).

Reaksi fase dua lebih dikenal dengan reaksi konjugasi, menyangkut penambahan gugus polar ke senyawa asing. Reaksi fase dua merupakan reaksi biosintetik, maka dibutuhkan energi sehingga reaksi dapat berlangsung. Reaksi penting pada fase II adalah reaksi konjugasi glutation karena sering terlibat dalam penghilangan zat atau metabolit perantara yang reaktif, yakni yang bersifat elektrofil. Berlangsungnya reaksi ini dikatalisir oleh enzim glutation S-transferase (Donatus 2001).

Glutation S-transferase merupakan suatu famili enzim yang mengkatalisir tahap awal pembentukan N-asetilsisteina (asam merkapturat) yang terutama terdapat dalam sitosol testis, hati, ginjal, usus, kelenjar adrenal (Donatus 2001). Enzim ini berperan dalam binding, transport dan detoksifikasi komponen endogenus maupun eksogenus. Glutation S-transferase ditemukan dalam jumlah yang besar pada hati, tetapi juga terdapat pada aliran darah terlebih lagi jika hati mengalami kerusakan (Mulder et al 1999).

Sejumlah xenobiotik elektrofilik yang berpotensi beracun akan terkonjugasi dengan glutation nukleofilik dalam reaksi berikut:

R + GSHO R – S - G

Dimana R adalah xenobiotik elektrofilik. Jika xenobiotik yang potensial beracun tidak terkonjugasi maka molekulnya akan berada dalam keadaan bebas yang membentuk ikatan kovalen dengan DNA, RNA atau protein sel dengan demikian dapat mengakibatkan kerusakan sel yang serius (Murray et al. 1999).

Induksi enzim detoksifikasi glutation S-transferase merupakan mekanisme pertahanan terhadap kanker. Prinsipnya peningkatan enzim glutation S-transferase

dapat mereduksi karsinogenesis melalui penguatan pembuangan elektrofil reaktif (Kirlin et al. 1999). Analisis yang digunakan dengan menggunakan prinsip bahwa GSH dapat berkonjugasi dengan 1-kloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) dengan adanya katalis enzim glutation S-transferase dan menghasilkan produk dapat diukur secara spektrofotometri (Habig et al. 1974).

Metabolisme Senyawa Bioaktif

Metabolisme senyawa bioaktif seperti senyawa flavonoid dalam tubuh dipengaruhi oleh struktur kimia dan perlunya molekul itu mengalami konjugasi. Meskipun bioavailabilitas flavonoid bervariasi antara flavonoid tipe satu dan yang lain, mulai dari antosianin yang sangat sedikit diserap dan isoflavon yang dengan mudah diserap, jalur dalam mekanisme absorbsi pada umumnya sama untuk semua flavonoid. Perubahan melalui jalur metabolisme ditentukan oleh spesifitas dan aktivitas transporter, spesifitas dan aktivitas metabolisme dan stabilitas flavonoid (Meskin et al, 2004).

Senyawa flavonoid dalam tanaman biasanya dalam bentuk glikosida. Glikosida flavonoid yang diasup tubuh mencapai usus halus melalui jalur pencernaan. Senyawa flavanol seperti katekin dan proanthosianin oligomer sebagian besar tidak terglikosolasi harus dideglikolasi. Deglikosilasi dapat terjadi pada beberapa tempat dalam duodenum dan jejenum dalam lumen intestinal,

brush border atau hidrolase intraseluler setelah terjadinya transport flavonoid ke dalam enterosit. Deglikosilasi adalah perlakuan awal sebelum konjugasi oleh enzim yang terdapat dalam usus dan transport sampai serosol atau sisi mukosal. Hal yang sama juga berlaku untuk isoflavon, aglikonnya dapat diserap dalam usus halus. Tahap awal proses absorbsi untuk flavonoid terglikosilasi dan isoflavon adalah deglikosilasi oleh lactase phlorizin hydrolase (LPH) yang merupakan enzim yang terletak dalam bagian brush border dari usus halus yang bertanggung jawab dalam hidrolisis laktosa (Meskin et al 2004).

Hasil dari reaksi deglikosilasi adalah aglikon bebas yang dapat berdifusi ke dalam sel-sel epitel secara pasif atau secara difusi fasilitatif. Reaksi deglikosilasi ini adalah reaksi yang spesifik dan memiliki aktivitas yang besar. Reaksi

selanjutnya yang terjadinya adalah penyerapan atau absorbsi. Penyerapan glikosida flavonoid tidak dipengaruhi oleh perlakuan awal menggunakan β -glukosidase dari mikroba diduga karena enzim LPH dalam usus halus mengakatalis reaksi yang sama. Absorbsi aglikon dalam lumen tergantung pada keberadaan komponen-komponen lain dan juga karena kelarutan atau koefisien partisi dari flavonoid. Mekanisme absorbsi alternatif yang terjadi melibatkan transpor glikosida flavonoid ke dalam enterosit dalam bentuk serapan melalui fungsi transporter gula. Kedua jalur absorbsi menaikkan jumlah aglikon intaraseluler transient yang ditemukan dalam jaringan usus halus tikus setelah reaksi fusi in vitro dengan glukosida quarcetin atau isoflavon (Meskin et al, 2004).

Reaksi yang terjadi selanjutnya adalah konjugasi. Usus memiliki kapasitas konjugasi tertentu termasuk oleh glukoronosyl transferase atau UGTs dan glutation transferase. Absorbsi di usus halus menentukan transfer flavonoid dari mukosa usus sampai darah (Kuhnle et al 2000 dalam Setiawan 2006). Ditemukan bahwa quercetin, katekin dan genistein sebagian besar adalah dalam bentuk glukoronidase. Enzim-enzim yang mengkatalis reaksi konjugasi di dalam usus dan hati adalah UGT1A1 dan 1A8. Sebagian kecil flavonoid seperti katekin galloylasi dan isoflavon melewati konjugasi usus namun hanya dalam keadaan, dosis dan waktu tertentu (Meskin et al, 2004).

Pada reaksi glukoronidasi selama absorbsi, beberapa flavonoid mengalami metabolisme lebih lanjut. Pada tahap ini residu glukoronida dikeluarkan dan diganti dengan sulfat. Reaksi sulfitasi ini pada umumnya terjadi di liver. Hati menerima flavonoid dari darah termasuk darah dari usus halus pada awal metabolisme. Berdasarkan percobaan perfusi secara invitro dan invivo pada tikus, flavonoid dari usus halus terutama glukoronida yang mencapai liver secara keseluruhan terkonjugasi. Semua flavonoid yang telah terkonjugasi kemudian disalurkan ke dalam empedu dan kembali ke usus halus tanpa mengalami dekonjugasi lagi dan kemudian dikirim ke kolon serta diikuti deglukoronidasi atau sulfatasi oleh mikroba dalam ileum atau kolon dan terjadi reabsorbsi flavonoid dalam tikus enterohepatik (Meskin et al, 2004).

Darah menyalurkan flavonoid ke jaringan-jaringan tubuh. Apabila terdapat dalam plasma aglikon memasuki jaringan perifer dengan difusi pasif atau terfasilitasi. Konjugat glukoronida perlu disalurkan ke dalam jaringan perifer karena senyawa tersebut bersifat hidrofilik dan berdifusi melewati membran dengan lambat. Untuk dekonjugasi dalam jaringan, banyak sel memiliki aktivitas

β-Glukoronidase dalam fraksi lisosom dan lumen dalam retikulum endoplasma. Dalam hati, enzim ini aktif terhadap quarcetin glukoronida. Tahap terakhir dari metabolisme senyawa flavonoid adalah ekresi yang merupakan ekresi di ginjal. Meskipun demikian kandungan flavonoid karena pembentukan deglikosilasi flavonoid juga terjadi di kolon oleh mikroba (Meskin et al, 2004).

Komponen darah

Menurut Koolman dan Rohm (1996), darah menyusun sekitar 8% dari masa tubuh manusia. Darah merupakan suatu jaringan bersifat cair yang terdiri atas sel-sel darah dan plasma sebagai mediumnya. Plasma darah bersifat homogen dan alkali lemah serta terdiri dari garam organik, protein, lemak, hormon, vitamin, enzim serta zat-zat nutrisi lainnya. Sel-sel darah mamalia terdiri dari sel darah merah atau eritrosit, keping darah atau trombosit, dan sel darah putih atau leukosit (Hartono 1989).

Darah mempunyai berbagai fungsi di dalam tubuh manusia. Darah merupakan alat transpor, mempertahankan lingkungan dalam tubuh agar terjaga konstan (homeostasis) dan berperan penting pada pertahanan tubuh terhadap benda-benda asing.

Eritrosit

Eritrosit adalah suatu sel yang berisi hemoglobin dan membawa oksigen dari paru-paru ke seluruh tubuh disebut juga sel darah merah (red blood cell/RBC). Di dalam tubuh manusia dalam keadaan diam sekitar 250 ml oksigen dikonsumsi dan 200 ml karbondioksida diproduksi setiap menit, selama latihan jumlah ini meningkat sepuluh kali lipat (Anonim 2006). Warna kemerah-merahan disebabkan oleh kandungan hemoglobin. Eritrosit berbentuk bikonkaf yang

meningkatkan area permukaan sel sehingga memudahkan difusi oksigen dan karbon dioksida. Bentuk ini dipertahankan oleh suatu sitoskeleton yang terdiri atas beberapa protein. Eritrosit sangat fleksibel dan dapat berubah bentuk saat mengalir di dalam kapiler. Eritrosit yang belum matang disebut retikulosit, secara normal terdapat 1-2% dari jumlah sel darah merah di dalam darah. Garis tengah eritrosit manusia adalah 6-8 µm, jauh lebih kecil dibanding hampir seluruh sel manusia. Eritrosit mengandung sekitar 270 juta molekul hemoglobin dengan masing-masing membawa empat kelompok heme (Anonim 2006). Dalam rangka mengikat oksigen, besi yang terdapat pada heme yang mengisi separuh jumlah hemoglobin harus dijaga dalam bentuk tereduksi disamping sebagai agen oksidasi endogen dan eksogen (Anonim 2006).

Plasma darah

Plasma adalah suatu larutan encer yang terdiri atas elektrolit, zat-zat makanan, metabolit, protein, vitamin, elemen pelacak dan hormon. Plasma mengandung banyak sekali ion, molekul anorganik, organik yang sedang diangkut ke berbagai bagian tubuh atau membantu transpor zat-zat lain. Volume plasma normal adalah sekitar 5 % berat badan atau secara kasar 3500 ml (berat badan 70 kg). Plasma akan menggumpal jika didiamkan dan hanya akan bertahan cair jika ditambah antikoagulan (Ganong 2000).

Protein membentuk bagian terbesar komponen yang tidak mudah menguap di dalam plasma darah. Konsentrasinya berkisar antara 60 dan 80 g/L. Dengan demikian sekitar 4 % dari seluruh protein tubuh adalah protein plasma. Di dalam plasma terdapat sekitar 100 protein yang berbeda (Koolman dan Rohm, 2001).

METODOLOGI PENELITIAN

Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Teknologi Pertanian IPB, Laboratorium Terpadu Fakultas Kedokteran Hewan IPB, Laboratorium Mikrobiologi dan Imunologi, Pusat Studi Primata, Bogor serta klinik Farva Dramaga, Bogor.

Waktu yang diperlukan dari pembuatan proposal sampai pembuatan laporan adalah selama 10 bulan yaitu dari bulan Juli 2006 sampai Juni 2007.

Bahan dan Alat Bahan

Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini adalah bubuk biji kakao bebas lemak yang diperoleh dari Pusat Penelitian Kopi dan Kakao Indonesia di Jember. Bubuk yang digunakan merupakan bubuk biji kakao varietas bulk masak non fermentasi yang memiliki total fenol dan daya proliferasi limfosit yang tinggi berdasarkan uji in vitro (Zairisman 2006 ). Bahan lain yang digunakan adalah gula pasir, air panas, dan susu bubuk skim.

Bahan-bahan kimia yang diperlukan adalah: H2SO4 65%, metanol

pro-analisis, kloroform-etanol 96%, larutan epinefrin, buffer natrium karbonat, potassium bikromat K₂Cr₂O₇, H₂O₂, triton X-100 0.1 %, EDTA, TBA, sukrosa, HCl, Gas CO, NaS₂O₄, albumin serum sapi (AAS), pereaksi Folin, CuSO₄.5H₂O, 1 ml Na-tartarat 2 %, 98 ml Na₂CO₃ 2 % dalam 0,1 N NaOH.

Alat

Peralatan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain: sentrifuge (JOUAN, tipe CR 412), laminar air flow (Holten laminar air tipe HV 2472), inkubator Jouan tipe IG 150, mikroskop, hemasitometer, mikroplate reader, syringe 50 ml (Terumo), tabung sentrifuse steril, lempeng mikro 96 sumur (Costar), membran filter (sigma), mikropipet, spektrofotometer, ultra Sentrifuge, tabung ultrasentrifuse, ELISA Reader.

Peralatan sekali pakai yang digunakan adalah syringe 50 ml (Terumo), Syringe 3 ml, tabung sentrifuge steril 15 dan 50 ml sekali pakai (Corning), lempeng mikro 96 sumur (Corning), repeater (Eppendorf), dispenser tip (Marsh), dan tabung vacutainer ukuran 9 ml dengan koagulan.

Alur penelitian

Alur penelitian yang telah dilakukan digambarkan secara skema dalam diagram alir berikut:

Gambar 6 Diagram alir penelitian

Metode Penelitian

Penelitian ini dilakukan bersama-sama dengan Erniati (2007), Amri (2007), Yuliatmoko (2007) dan Kusumaningtyas (2007) mulai dari tahap penentuan komposisi minuman bubuk kakao bebas lemak sampai tahap pemisahan komponen darah.

Pengambilan darah

Subyek sehat (n=18)

Inform Consent

KelompokKontrol(n=9) Kelompok Kakao (n=9)

SCREENING

Pemeriksaan kesehatan dan

interview

25 hari

AKHIR INTERVENSI

Pemeriksaan kesehatan Pengambilan darah

ƒ Analisa Aktivitas Enzim Antioksidan Katalase

ƒ Analisa Enzim Detoksifikasi Sitokrom P-450 dan Glutation S-Transferase (GST)

ANALISA DATA

Positif

HASIL Negatif

25 hari

1. Pembuatan minuman bubuk kakao

Minuman bubuk kakao bebas lemak disiapkan dengan cara bubuk kakao bebas lemak bulk masak non fermentasi sebanyak 4 gram dilarutkan dalam 100 ml air hangat, ditambahkan 2 gram gula dan 2 gram susu bubuk skim . Minuman bubuk kakao dalam keadaan hangat akan diminum oleh responden

2. Persiapan responden

Responden yang terlibat dalam penelitian ini adalah mahasiswi S1 Institut Pertanian Bogor. Pertimbangan dalam memilih subyek ini adalah kesamaan tempat tinggal, memiliki pengetahuan tentang pangan, gizi, dan metodologi penelitian dengan baik, serta mempunyai status gizi normal. Dengan demikian, penelitian ini diharapkan dapat berjalan dengan baik, sosialisasinya mudah, dan pengaruh biologisnya relatif seragam.

Jumlah subyek yang digunakan dalam penelitian ini adalah 18 orang berjenis kelamin perempuan, umur 22-27 tahun, dibagi dalam dua kelompok. Kelompok pertama berjumlah 9 orang meminum minuman bubuk kakao bebas lemak selama 25 hari dan sisanya kelompok yang tidak meminum minuman kakao bebas lemak, kelompok ini dinamakan dengan kontrol.

Kelompok kontrol ini hanya mengkonsumsi minuman yang terdiri dari sedikit susu bubuk skim yang ditambah sedikit gula dalam 100 ml air hangat

Responden yang dipilih adalah mahasiswa yang dinyatakan sehat berdasarkan hasil pemeriksaan kesehatan oleh Klinik Farfa Dramaga, Bogor.

3. Pelaksanaan intervensi (modifikasi dari Nurrahman, 1998)

Intervensi dilaksanakan selama 25 hari di rumah indekost mahasiswa di kompleks perumahan IPB II Sindang Barang. Pelaksanaan dilakukan setiap hari pada jam 07.00-08.00 WIB. Setiap responden pada kelompok perlakuan meminum minuman bubuk kakao sebanyak 4 g/100 ml setiap hari. Minuman bubuk kakao dipersiapkan setiap hari oleh peneliti yang sekaligus mengawasi responden meminum minuman bubuk kakao. Semua responden akan mendapat sarapan pagi sebelum mengkonsumsi minuman bubuk kakao bebas lemak dan makan malam dengan menu yang seragam. Seminggu sekali selama pelaksanaan

intervensi dilakukan diskusi yang melibatkan seluruh responden mengenai penelitian dan kesehatan umum.

Sebelum pelaksanaan intervensi juga dilakukan penandatanganan surat perjanjian (Inform consent) (lampiran 1) dan wawancara terhadap responden dengan format kuisioner standar (lampiran 2). Kuisioner tersebut berisi pertanyaan-pertanyaan mengenai status sosial ekonomi, pengetahuan tentang pangan, pola konsumsi dan kebiasaan membeli makanan jajanan.

Hasil pengisian kuisioner tentang pola konsumsi dan kebiasaan membeli makanan jajan disusun jenis makanan dan fekuensinya (per minggu per orang) serta nilai pencemaran. Nilai pencemaran diperoleh dengan cara mengalikan frekuensi konsumsi makanan jajanan, tempat pembelian dan jenis pembungkusnya. Masing-masing faktor pengkali diberi skor dari 1 untuk tingkat pencemaran rendah sampai 6 untuk pencemaran tinggi.

4. Pengukuran status gizi (Nurrahman 1998)

Pengukuran status gizi responden dilakukan secara antropometri yang meliputi Tinggi Badan (TB) dan Berat Badan (BB). Penggolongan status Gizi menurut “Body Mass Index” (BMI) dengan satuan Kg/m2, yaitu:

BMI = BB/TB2

Dimana: BMI < 17,0 kekurangan berat badan tingkat berat BMI 17,0 – 18,4 kekurangan berat badan tingkat ringan BMI 18,5 – 25,0 normal

BMI 25,1 – 27,0 kelebihan berat badan tingkat ringan BMI > 27,0, kelebihan berat badan tingkat berat

5. Pengambilan darah

Pengambilan darah dilakukan sebelum dan sesudah responden mengalami intervensi dengan meminum minuman bubuk kakao. Pengambilan darah dilakukan di klinik Farfa Kampus Dramaga IPB pada jam 07.00 pagi oleh seorang asisten tranfusi darah. Darah diambil sebanyak 35 ml dengan menggunakan jarum Precisionglide TM steril sekali pakai, kemudian di masukkan ke dalam tabung vacutainer steril ang mengandung koagulan. Darah yang diambil dibawa kelaboratorium kultur jaringan bagian patologi FKH IPB untuk segera dianalisa.

Gambar 7 Proses Pengambilan Darah Responden

6. Isolasi eritrosit (Zhu et al ₂₀₀₅₎

Darah yang telah dimasukkan dalam tabung vacutainer steril yang mengandung koagulan dilakukan pemisahan komponen seluler dengan sentrifugasi sampel darah dalam vacutainer pada 514 x g selama 10 menit dengan menggunakan sentrifius dengan rotor swing. Bagian darah yang lebih berat (sel darah merah/ eritrosit) berada di bagian bawah, sedangkan plasma darah terpisah bagian atas. Plasma darah dan eritrosit diambil atau dipisahkan dengan mikropipet ke dalam masing-masing tabung sentrifius yang telah disiapkan.

7. Aktivitas enzim antioksidan katalase pada plasma darah (Sinha, 1978)

Prinsip metode yang digunakan oleh Sinha menggunakan zat warna sebagai indikator. Zat warna yang digunakan adalah potassium bikromat K₂Cr₂ O₇ 5 % dalam suasana asam asetat glasial (1:3). Ion bikromat dalam suasana asam akan direduksi oleh H₂O₂ menjadi kromat dan memberikan warna pada panjang gelombang 570 nm. 1 unit aktivitas katalase dinyatakan sebagai banyaknya H₂O₂ dalam mol yang digunakan oleh katalase permenit.

Cr+6 _{+ H}

2O2 H

+ _Cr3+ _{+ H}

2O +O2

a. Ekstraksi sample

Sebanyak 3.5 ml plasma ditambahkan dengan 0.5 ml triton X-100 0.1 %, sentrifuse pada 4000 rpm selama 5 menit suhu dingin. Supernatan digunakan untuk menentukan aktivitas katalase.

b. Pengukuran aktivitas katalase

Sebanyak1 ml sampel ditambahkan dengan 5 ml buffer posfat 0.05 M pH 7.0 sambil divortek. Tambahkan 4 ml H₂O₂ 0.2 M dan inkubasi selama 60 detik. Ambil 1 ml larutan ini tambahkan 2 ml larutan warna kalium bikromat lalu panaskan pada air mendidih selama 10 menit. Setelah dingin, serapan diukur pada panjang gelombang 570 nm.

c. Kurva standar dan perhitungan aktivitas katalase

Kurva standar dibuat dari larutan standar H₂O₂ 30%. 1 ml larutan standar H₂O₂ ditambahkan dengan 2 ml larutan bikromat 5 %, panaskan dalam air mendidih selama 10 menit kemudian dinginkan dan serapan dibaca pada panjang gelombang 570 nm. Absorban sb y dialurkan terhadap konsentrasi H2O2 sb x.

Jumlah H₂O₂ yang dipakai katalase = 0.2 M – konsentarasi H₂O₂ terbaca.

8. Aktivitas enzim antioksidan katalase pada eritrosit darah (Sinha, 1978)

Prinsip metode yang digunakan oleh Sinha menggunakan zat warna sebagai indikator. Zat warna yang digunakan adalah potassium bikromat K₂Cr₂ O₇ 5 % dalam suasana asam asetat glasial (1:3). Ion bikromat dalam suasana asam akan direduksi oleh H₂O₂ menjadi kromat dan memeberikan warna pada panjan gelombang 570 nm. 1 unit aktivitas katalase dinyatakan sebagai banyaknya H₂O₂ dalam mol yangdigunakan oleh katalase permenit.

Cr+6 + H₂O₂ H+ Cr3+ + H₂O +O₂

a. Ekstraksi sample

3,5 ml eritrosit ditambahkan dengan 0.5 ml Triton X-100 0.1 %, sentrifuse pada 4000 rpm selama 5 menit suhu dingin. Supernatan digunakan untuk menentukan aktivitas katalase.

b. Pengukuran aktivitas katalase

1 ml sampel ditambahkan dengan 5 ml buffer posfat 0.05 M pH 7.0 sambil divortek. Tambahkan 4 ml H₂O₂ 0.2 M dan inkubasi selama 60 detik. Ambil 1 ml larutan ini tambahkan 2 ml larutan warna kalium bikromat lalu panaskan pada

air mendidih selama 10 menit. Setelah dingin, serapan diukur pada panjang gelombang 570 nm.

c. Kurva standar dan perhitungan aktivitas katalase

Kurva standar dibuat dari larutan standar H₂O₂ 30%. 1 ml larutan standar H₂O₂ ditambahkan dengan 2 ml larutan bikromat 5 %, panaskan dalam air mendidih selama 10 menit kemudian dinginkan dan serapan dibaca pada panjang gelombang 570nm. Absorban sb y dialurkan terhadap konsentrasi H₂O₂ sb x.

Jumlah H₂O₂ yang dipakai katalase = 0.2 M – konsentarasi H₂O₂ terbaca.

10. Analisis kadar sitokrom P-450 pada plasma (dimodifikasi dari Omura dan Sato,1964)

a. Fraksinasi sel

Plasma ditambah dengan 0,25 M sukrosa dalam larutan Bufer Tris-HCl 10 mM (pH 7,5) dengan perbandingan 4 kali lipat berat plasma, lalu dihomogenisasi menggunakan homogonizer. Selanjutnya disentrifuse pada 2000 g selama 10 menit sehingga dihasilkan supernatan.

Supernatan yang terbentuk disentrifuse kembali pada 105.000 x g selama 60 menit, dihasilkan supernatan kedua yang merupakan sitosol dan endapan yang terbentuk dilarutkan dengan 0,25 sukrosa-10 mM buffer Tris-HCl-0,1 mM buffer EDTA (pH 7,5) sehingga menghasilkan fraksi mikrosomal. Fraksi sitosol dan mikrosomal dianalisis kadar proteinnya dengan menggunakan metode Lowry.

b. Pengukuran kadar sitokrom P-450 pada plasma

Analisa ini menggunakan dua buah tabung, tabung untuk blangko dan tabung untuk sample. Ke dalam masing-masing tabung dimasukkan 2 ml fraksi mikrosomal dan ditambah 2 ml 0,1 M buffer phosfat (pH 7,6). Tabung blangko diukur dengan spektrofotometer double beam sebagai baseline pada panjang gelombang 500-400 nm. Sedangkan tabung sample dialirkan 20-30 gelembung gas CO dengan kecepatan 1 gelembung tiap detik. Setelah itu ke dalam masing-masing tabung ditambahkan 1-3 mg NaS₂O₄. Isi dari masing-masing tabung dituangkan ke kuvet dan diukur pada panjang gelombang 500-400 nm.

F. DATA HASIL PENGUKURAN AKTIVITAS

GLUTATION S-TRANSFERASE (GST) PADA PLASMA

PERLAKUAN

RESPONDEN Sebelum Intervensi (nmol/ min/ mg protein)

Setelah Intervensi (nmol/ min/ mg protein)

P1 0.1367 0.31864 P2 0.1235 0.2783 P3 0.1285 0.3435 P4 0.1273 0.2776 P5 0.1289 0.303 P6 0.1423 0.2824 P7 0.1319 0.2851 P8 0.118 0.2692 P9 0.1225 0.2794

KONTROL

RESPONDEN Sebelum Intervensi (nmol/ min/ mg protein)

Setelah Intervensi (nmol/ mg/ mg protein)

K1 0.1319 0.1983 K2 0.1369 0.2061 K3 0.1476 0.1772 K4 0.1662 0.2048 K6 0.1157 0.1781 K7 0.1421 0.2009 K8 0.1561 0.2044 K9 0.1281 0.1818

KURVA STANDAR PROTEIN GST PADA PLASMA

A. Sebelum Intervensi

B. Setelah Intervensi

A. Sebelum Intervensi B. Setelah Intervensi KURVA STANDAR PROTEIN

y = 1.0066x + 0.1496 R2 _{= 0.9941}

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Konsentrasi (mg/ml) A b so rb a n si

KURVA STANDAR PROTEIN

y = 1.0959x + 0.1373 R2 _{= 0.9871}

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 Konsentrasi (mg/ml) A b so rb an si

Lampiran 4

TABULASI HASIL ANALISA STATISTIK DENGAN UJI T (t-Test)

NO PARAMETER

RESPONDEN UJI

STATISTIK

1.

Aktivitas Sitokrom Eritrosit

Kontrol

Tidak berbeda nyata

Perlakuan Berbeda

Nyata

2.

Aktivitas Sitokrom Plasma

Kontrol

Tidak berbeda nyata

Perlakuan

Berbeda Nyata

3.

Aktivitas GST Eritrosit

Kontrol

Tidak berbeda nyata

Perlakuan Berbeda

Nyata

4.

Aktivitas GST Plasma

Kontrol

Tidak berbeda nyata

Perlakuan Berbeda

Nyata

5.

Aktivitas Katalase Eritrosit

Kontrol

Tidak berbeda nyata

Perlakuan Berbeda

Nyata

6.

Aktivitas Katalase Plasma

Kontrol

Tidak berbeda nyata

Lampiran 5

HASIL ANALISA DATA DENGAN UJI T (t-test)

KATALASE ERITROSIT KELOMPOK KONTROL

Two Sample T-Test and Confidence Interval

Two sample T for SEBELUM vs SESUDAH

N Mean StDev SE Mean Sebelum Interven 8 989.77 3.83 1.4 Setelah Interven 8 991.76 3.01 1.1

Difference = mu (Sebelum Intervensi) - mu (Setelah Intervensi) Estimate for difference: -1.99862

95% CI for difference: (-5.69171, 1.69446)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -1.16 P-Value = 0.265 DF = 14

Both use Pooled StDev = 3.4438

KATALASE ERITROSIT KELOMPOK PERLAKUAN

Two Sample T-Test and Confidence Interval

Two-sample T for Sebelum Intervensi_1 vs Setelah Intervensi_1 N Mean StDev SE Mean

Sebelum Interven 9 999.64 6.40 2.1 Setelah Interven 9 1020.03 5.45 1.8

Difference = mu (Sebelum Intervensi_1) - mu (Setelah Intervensi_1) Estimate for difference: -20.3870

95% CI for difference: (-26.3248, -14.4492)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -7.28 P-Value = 0.000 DF = 16

Both use Pooled StDev = 5.9417

KATALASE PLASMA KONTROL

Two Sample T-Test and Confidence Interval

Two-sample T for Sebelum Intervensi_2 vs Setelah Intervensi_2 N Mean StDev SE Mean

Sebelum Interven 8 547.9 30.4 11 Setelah Interven 8 559.5 36.5 13

Difference = mu (Sebelum Intervensi_2) - mu (Setelah Intervensi_2) Estimate for difference: -11.5819

95% CI for difference: (-47.6012, 24.4374)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -0.69 P-Value = 0.502 DF = 14

KATALASE PLASMA PERLAKUAN

Two Sample T-Test and Confidence Interval

Two-sample T for Sebelum Intervensi_3 vs Setelah Intervensi_3 N Mean StDev SE Mean

Sebelum Interven 9 539.2 27.0 9.0 Setelah Interven 9 584.2 15.9 5.3

Difference = mu (Sebelum Intervensi_3) - mu (Setelah Intervensi_3) Estimate for difference: -44.9490

95% CI for difference: (-67.1263, -22.7717)

T-Test of difference = 0 (vs not =): T-Value = -4.30 P-Value = 0.001 DF = 16

Both use Pooled StDev = 22.1921

KADAR SITOKROM ERITROSIT KELOMPOK KONTROL

Two Sample T-Test and Confidence Interval

Two sample T for SEBELUM vs SESUDAH N Mean StDev SE Mean SEBELUM 9 4.78 1.17 0.39 SESUDAH 9 3.53 1.58 0.53

95% CI for mu SEBELUM - mu SESUDAH: ( -0.15, 2.66)

T-Test mu SEBELUM = mu SESUDAH (vs not =): T= 1.91 P=0.076 DF= 14

KADAR SITOKROM ERITROSIT KELOMPOK PERLAKUAN

Two Sample T-Test and Confidence Interval

Two sample T for SEBELUM1 vs SESUDAH1 N Mean StDev SE Mean SEBELUM1 9 5.427 0.394 0.13 SESUDAH1 9 1.586 0.451 0.15

95% CI for mu SEBELUM1 - mu SESUDAH1: ( 3.42, 4.27)

T-Test mu SEBELUM1 = mu SESUDAH1 (vs not =): T= 19.25 P=0.0000 DF= 15

KADAR SITOKROM PLASMA KELOMPOK KONTROL

Two Sample T-Test and Confidence Interval

Two sample T for SEBELUM2 vs SESUDAH2 N Mean StDev SE Mean SEBELUM2 9 2.183 0.767 0.26 SESUDAH2 9 1.434 0.837 0.28

95% CI for mu SEBELUM2 - mu SESUDAH2: ( -0.06, 1.56)

T-Test mu SEBELUM2 = mu SESUDAH2 (vs not =): T= 1.98 P=0.066 DF= 15

KADAR SITOKROM PLASMA KELOMPOK PERLAKUAN

Two Sample T-Test and Confidence Interval

Two sample T for SEBELUM3 vs SESUDAH3 N Mean StDev SE Mean SEBELUM3 9 2.105 0.470 0.16 SESUDAH3 9 0.784 0.147 0.049

95% CI for mu SEBELUM3 - mu SESUDAH3: ( 0.95, 1.693)

T-Test mu SEBELUM3 = mu SESUDAH3 (vs not =): T= 8.04 P=0.0000 DF= 9

GST PLASMA KELOMPOK KONTROL

Two Sample T-Test and Confidence Interval

Two sample T for SEBELUM4 vs SESUDAH4 N Mean StDev SE Mean SEBELUM4 9 0.1402 0.0151 0.0050 SESUDAH4 9 0.1724 0.0657 0.022

95% CI for mu SEBELUM4 - mu SESUDAH4: ( -0.0840, 0.020)

T-Test mu SEBELUM4 = mu SESUDAH4 (vs not =): T= -1.43 P=0.19 DF= 8

GST PLASMA KELOMPOK PERLAKUAN

Two Sample T-Test and Confidence Interval

Two sample T for SEBELUM5 vs SESUDAH5 N Mean StDev SE Mean SEBELUM5 9 0.12884 0.00742 0.0025 SESUDAH5 9 0.2930 0.0242 0.0081

95% CI for mu SEBELUM5 - mu SESUDAH5: ( -0.1833, -0.1451) T-Test mu SEBELUM5 = mu SESUDAH5 (vs not =): T= -19.45 P=0.0000 DF= 9

GST ERITROSIT KELOMPOK KONTROL

Two Sample T-Test and Confidence Interval

Two sample T for SEBELUM6 vs SESUDAH6 N Mean StDev SE Mean SEBELUM6 9 0.04070 0.00492 0.0016 SESUDAH6 9 0.0490 0.0188 0.0063

95% CI for mu SEBELUM6 - mu SESUDAH6: ( -0.0230, 0.0064)

T-Test mu SEBELUM6 = mu SESUDAH6 (vs not =):T= -1.28 P=0.23 DF= 9

GST ERITROSIT KELOMPOK PERLAKUAN

Two Sample T-Test and Confidence Interval

Two sample T for SEBELUM7 vs SESUDAH7 N Mean StDev SE Mean SEBELUM7 9 0.04171 0.00351 0.0012 SESUDAH7 9 0.1084 0.0212 0.0071

95% CI for mu SEBELUM7 - mu SESUDAH7: ( -0.0833, -0.0502) T-Test mu SEBELUM7 = mu SESUDAH7 (vs not =): T= -9.30 P=0.0000 DF= 8