air mendidih selama 10 menit. Setelah dingin, serapan diukur pada panjang gelombang 570 nm.
c. Kurva standar dan perhitungan aktivitas katalase
Kurva standar dibuat dari larutan standar H
2
O
2
30. 1 ml larutan standar H
2
O
2
ditambahkan dengan 2 ml larutan bikromat 5 , panaskan dalam air mendidih selama 10 menit kemudian dinginkan dan serapan dibaca pada panjang
gelombang 570nm. Absorban sb y dialurkan terhadap konsentrasi H
2
O
2
sb x. Jumlah H
2
O
2
yang dipakai katalase = 0.2 M – konsentarasi H
2
O
2
terbaca.
10. Analisis kadar sitokrom P-450 pada plasma dimodifikasi dari Omura dan Sato,1964
a. Fraksinasi sel
Plasma ditambah dengan 0,25 M sukrosa dalam larutan Bufer Tris-HCl 10 mM pH 7,5 dengan perbandingan 4 kali lipat berat plasma, lalu dihomogenisasi
menggunakan homogonizer. Selanjutnya disentrifuse pada 2000 g selama 10 menit sehingga dihasilkan supernatan.
Supernatan yang terbentuk disentrifuse kembali pada 105.000 x g selama 60 menit, dihasilkan supernatan kedua yang merupakan sitosol dan endapan yang
terbentuk dilarutkan dengan 0,25 sukrosa-10 mM buffer Tris-HCl-0,1 mM buffer EDTA pH 7,5 sehingga menghasilkan fraksi mikrosomal. Fraksi sitosol dan
mikrosomal dianalisis kadar proteinnya dengan menggunakan metode Lowry.
b. Pengukuran kadar sitokrom P-450 pada plasma
Analisa ini menggunakan dua buah tabung, tabung untuk blangko dan tabung untuk sample. Ke dalam masing-masing tabung dimasukkan 2 ml fraksi
mikrosomal dan ditambah 2 ml 0,1 M buffer phosfat pH 7,6. Tabung blangko diukur dengan spektrofotometer double beam sebagai baseline pada panjang
gelombang 500-400 nm. Sedangkan tabung sample dialirkan 20-30 gelembung gas CO dengan kecepatan 1 gelembung tiap detik. Setelah itu ke dalam masing-
masing tabung ditambahkan 1-3 mg NaS
2
O
4
. Isi dari masing-masing tabung dituangkan ke kuvet dan diukur pada panjang gelombang 500-400 nm.
Kadar sitoktrom P-450 diukur dengan rumus: Kadar sitokrom P450 = A450-A490tereduksi – A450-A490 baseline x f difusi
Molar extinction x tebal kuvet
11. Pengukuran aktivitas glutation S-transferase pada plasma dimodifikasi
dari Arisudana, 2003
Aktivitas glutation S-transferase diukur dari fraksi sitosol plasma dengan menggunakan 2 substrat yakni 1-chloro-2,4-dinitrobenzen CDNB dan glutation
dalam bentuk tereduksi GSH. CDNB yang dibutuhkan mempunyai konsentrasi 1 mM dan GSH yang dibutuhkan dalam 1 mM dalam 0.1 M buffer fosfat pH 6.5.
Ke dalam masing-masing kuvet dimasukkan 2700 µl buffer fosfat pH 6.5. ke dalam kuvet sample dimasukkan fraksi sitosol 100 µl sedangkan untuk kuvet
blangko dimasukkan akuades 100 µl. selanjutnya masing-masing kuvet ditambahkan 100 µl GSH dalam buffer fosfat. Sebelum diukur ditambahkan 100
µl 30 mM CDNB dalam etanol. Total volume akhir dalam kuvet sebesar 3 ml. Aktivitas GST diukur pada panjang gelombang 340 nm selama 3 menit.
Perhitungan aktivitas GST = ∆ absorbansimenit
Ε GS-DBN x kadar protein saat pengujian ε GS-DBN koefisien sktensi molar = 9.6 cm
1 −
mM
1 −
12. Analisis kadar sitokrom P-450 pada eritrosit dimodifikasi dari Omura dan Sato, 1964
a. Fraksinasi sel
Kategori