BAB III METODE PENELITIAN
Metode penelitian yang dilakukan adalah secara eksperimental. Penelitian meliputi pengumpulan bahan tumbuhan, identifikasi tumbuhan, pembuatan
simplisia, karakterisasi simplisia, skrining fitokimia, pembuatan ekstrak etanol, ekstrak n-heksana, fraksi kloroform, fraksi etilasetat, dan fraksi metanol.
Selanjutnya pengujian aktivitas antimikroba dengan metode difusi agar menggunakan punch hole dan diukur dengan Kirby Bauer. Penelitian ini
dilakukan di Laboratorium Fitokimia dan Mikrobiologi Fakultas Farmasi, Universitas Sumatera Utara.
3.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah alat-alat gelas, autoklaf Fisons, blender Miyako, bola karet, desikator, freeze dryer Modulio,
inkubator Memmert, jangka sorong, jarum ose, kamera digital Olympus, krus porselin, Laminar Air Flow Cabinet Astec HLF 1200L, lemari pendingin
Glacio, lumpang dan alu, mikroskop Olympus, neraca kasar Sun, neraca listrik Mettler Toledo, oven Memmert, penangas air Yenaco, pinset, pipet
mikro Eppendorf, rotary evaporator Haake D, seperangkat alat penetapan kadar air, silinder logam, spektrofotometer visibel Dynamica dan tanur.
Universitas Sumatera Utara
3.2 Bahan
Bahan yang digunakan untuk penelitian ini adalah buah kurma Cina yang sudah matang berwarna merah tua, nutrient agar NA, Sabouraud dextrose agar
SDA, Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 35983
, Propionibacterium acnes ATCC 11828, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Candida albicans ATCC 10231, dan air suling.
Bahan kimia yang digunakan berkualitas pro analisa, kecuali dinyatakan lain: dimetilsulfoksida DMSO, amyl alkohol, asam klorida pekat, asam asetat
anhidrida, asam asetat glasial, asam nitrat pekat, asam sulfat pekat, benzen, besi III klorida, bismut III nitrat, etanol, eter minyak tanah, etilasetat, n-heksana,
isopropanol, kalium iodida, kloralhidrat, kloroform, metanol, natrium hidroksida, natrium klorida, natrium sulfat anhidrat, raksa II klorida, serbuk magnesium,
serbuk zinkum, timbal II asetat, dan toluena.
3.3 Pengumpulan dan Pengolahan Sampel
Pengumpulan dan pengolahan sampel meliputi pengumpulan sampel, identifikasi sampel dan pembuatan simplisia buah kurma Cina Ziziphus jujuba
Mill.. 3.3.1 Pengumpulan sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara purposif yaitu tanpa membandingkan dengan daerah lain. Sampel yang digunakan adalah buah kurma Cina yang
berwarna merah tua dengan kerutan yang tidak teratur yang diambil dari Pasar Ramai, Jalan Thamrin, Kecamatan Medan Area, Kota Medan, Propinsi Sumatera
Utara.
Universitas Sumatera Utara
3.3.2 Identifikasi Sampel
Identifikasi sampel dilakukan di Herbarium Bogoriense, Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia LIPI. Hasil
identifikasi dapat dilihat pada Lampiran 1, halaman 52.
3.3.3 Pengolahan Sampel
Buah kurma Cina Zizyphus jujuba Mill. yang telah dikumpulkan, dibersihkan dari kotoran dicuci di bawah air mengalir, lalu ditiriskan, selanjutnya
disebarkan di atas kertas hingga airnya terserap, kemudian ditimbang sebagai berat basah. Dikeringkan di lemari pengering hingga kering, kemudian ditimbang
sebagai berat kering. Kemudian diserbuk dengan menggunakan blender dan disimpan dalam wadah untuk mencegah pengaruh lembab dan pengotoran lain.
Bagan kerja pembuatan simplisia dapat dilihat pada Lampiran 6, halaman 57.
3.4 Pembuatan Pereaksi 3.4.1 Pereaksi Mayer
Larutan raksa II klorida P 2,266 bv sebanyak 60 ml dicampur dengan 10 ml larutan kalium iodida P 50 bv, kemudian ditambahkan air secukupnya
hingga 100 ml Depkes RI, 1980.
3.4.2 Pereaksi Dragendorff
Larutan bismut nitrat P 40 bv dalam asam nitrat P sebanyak 20 ml dicampur dengan 50 ml kalium iodida P 54,4 bv, didiamkan sampai memisah
sempurna. Lalu diambil lapisan jernihnya dan diencerkan dengan air secukupnya hingga 100 ml Depkes RI, 1980.
Universitas Sumatera Utara
3.4.3 Pereaksi Bouchardat
Sebanyak 4 g Kalium iodida P dilarutkan dalam air secukupnya, lalu ditambahkan 2 g iodium P kemudian ditambahkan air hingga 100 ml Depkes RI,
1980.
3.4.4 Pereaksi Molish
Sebanyak 3 g α-naftol P, dilarutkan dalam asam nitrat 0,5 N hingga diperoleh larutan 100 ml Depkes RI, 1980.
3.4.5 Pereaksi Liebarmann-Bourchard
Campur secara perlahan 5 ml asam asetat anhidrida dengan 5 ml asam sulfat pekat tambahkan etanol hingga 50 ml Merck, 1978.
3.4.6 Pereaksi III klorida 1
Sebanyak 1 g besi III klorida dilarutkan dalam air secukupnya hingga 100 ml Depkes RI, 1980.
3.4.7 Pereaksi timbal II asetat 0,4 M
Sebanyak 15,17 g timbal II asetat P dilarutkan dalam air bebas karbon dioksida hingga 100 ml Depkes RI, 1980.
3.4.8 Pereaksi hidroksida 2 N
Sebanyak 8,001 g natrium hidroksida, dilarutkan dalam air secukupnya hingga 100 ml Depkes RI, 1980.
3.4.9 Pereaksi klorida 2 N
Larutan asam klorida pekat sebanyak 17 ml ditambahkan air suling sampai 100 ml Ditjen POM, 1979.
Universitas Sumatera Utara
3.4.10 Pereaksi asam sulfat 2 N
Larutan asam sulfat pekat sebanyak 9,8 ml ditambahkan air suling sampai 100 ml Ditjen POM, 1979.
3.4.11 Pereaksi kloralhidrat
Sebanyak 50 g kristal kloralhidrat ditimbang lalu dilarutkan dalam 20 ml air suling Depkes RI, 1979.
3.5 Pemeriksaan Karakteristik Simplisia
Pemeriksaan karakteristik simplisia meliputi pemeriksaan makroskopik, mikroskopik, penetapan kadar air, penetapan kadar sari yang larut dalam air,
penetapan kadar sari yang larut dalam etanol, penetapan kadar abu total dan
penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam. 3.5.1 Pemeriksaan makroskopik
Pemeriksaan makroskopik dilakukan dengan mengamati bentuk, ukuran, warna, bau, dan rasa simplisia buah kurma Cina Ziziphus jujuba Mill..
3.5.2 Pemeriksaan mikroskopik
Pemeriksaan mikroskopik dilakukan terhadap serbuk simplisia buah kurma Cina yang dikeringkan. Serbuk simplisia ditaburkan diatas kaca objek yang telah
ditetesi dengan larutan kloralhidrat dan tutup dengan kaca penutup, kemudian diamati di bawah mikroskop. Hasil mikroskopik dapat dilihat pada Lampiran 5,
halaman 56.
Universitas Sumatera Utara
3.5.3 Penetapan kadar air
Penetapan kadar air dilakukan dengan metode Azeotropi destilasi toluen. Alat terdiri dari alas bulat 500 ml, alat penampung, pendingin, tabung
penyambung dan tabung penerima. A. Penjenuhan toluen
Sebanyak 200 ml toluen dan 2 ml air suling dimasukkan ke dalam labu alas bulat, dipasang alat penampung dan pendingin, kemudian didestilasi selama 2
jam. Destilasi dihentikan dan dibiarkan dingin selama 30 menit, kemudian volume air dalam tabung penerima dibaca dengan ketelitian 0,01 ml.
B. Penetapan kadar air simplisia
Ke dalam labu yang berisi toluen jenuh diatas, dimasukkan 5 g serbuk kurma Cina Zizyphus jujuba Mill. yang telah ditimbang seksama, labu dipanaskan hati-
hati selama 15 menit. Setelah toluen mendidih, kecepatan tetesan diatur 2 tetes untuk tiap detik sampai sebagian besar air terdestilasi, kemudian kecepatan
destilasi dinaikkan sampai 4 tetes tiap detik. Setelah semua air terdestilasi, bagian dalam pendingin dibilas dengan toluen. Destilasi dilanjutkan selama 5 menit,
kemudian tabung penerima dibiarkan mendingin pada suhu kamar. Setelah air dan toluene memisah sempurna, volume air dibaca dengan ketelitian 0,01 ml. Selisih
kedua volume air yang dibaca sesuai dengan kandungan air yang terdapat dalam bahan yang diperiksa. Kadar air dihitung dalam persen WHO, 1992.
3.5.4 Penetapan kadar sari yang larut dalam air
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml air-kloroform 2,5 ml kloroform dalam air suling sampai 1 liter dalam labu
bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama, kemudian dibiarkan
Universitas Sumatera Utara
selama 18 jam, kemudian disaring. Sejumlah 20 ml filtrat pertama diuapkan sampai kering dalam cawan penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan
dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam air dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di
udara Depkes RI, 1995. 3.5.5 Penetapan kadar sari yang larut dalam etanol
Sebanyak 5 gram serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dalam 100 ml etanol 96 dalam labu bersumbat sambil dikocok sesekali selama 6 jam pertama,
kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Sejumlah 20 ml filtrat diuapkan sampai kering dalam cawan
penguap yang berdasar rata yang telah dipanaskan dan ditara. Sisa dipanaskan pada suhu 105
o
C sampai bobot tetap. Kadar dalam persen sari yang larut dalam etanol 96 dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI,
1995. 3.5.6 Penetapan kadar abu total
Sebanyak 2 gram serbuk yang telah digerus dan ditimbang seksama dimasukkan dalam krus porselin yang telah dipijar dan ditara, kemudian
diratakan. Krus dipijar perlahan-lahan sampai arang habis, pijaran dilakukan pada suhu 600
o
C selama 3 jam kemudian didinginkan dan ditimbang sampai diperoleh bobot tetap. Kadar abu dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara
Depkes RI, 1995.
3.5.7 Penetapan kadar abu yang tidak larut dalam asam
Abu yang diperoleh dalam penetapan kadar abu dididihkan dalam 25 ml asam klorida encer selama 5 menit, bagian yang tidak larut dalam asam
Universitas Sumatera Utara
dikumpulkan, disaring melalui kertas saring dipijarkan sampai bobot tetap, kemudian didinginkan dan ditimbang. Kadar abu yang tidak larut dalam asam
dihitung terhadap bahan yang telah dikeringkan di udara Depkes RI, 1995.
3.6 Skrining Fitokimia 3.6.1 Pemeriksaan Alkaloida
Serbuk simplisia diitimbang sebanyak 0,5 g kemudian ditambahkan 1 ml asam klorida 2 N dan 9 ml air suling, dipanaskan diatas penangas air selama 2
menit, didinginkan dan disaring. Filtrat yang diperoleh dipakai untuk uji
alkaloida: diambil 3 tabung reaksi, lalu kedalamnya dimasukkan 0,5 ml filtrat. Pada masing-masing tabung reaksi:
1. ditambahkan 2 tetes pereaksi Mayer 2. ditambahkan 2 tetes pereaksi Bouchardat
3. ditambahkan 2 tetes pereaksi Dragendorff Alkaloida positif jika terjadi endapan atau kekeruhkan pada paling sedikit
dua dari tiga percobaan diatas Depkes, 1995.
3.6.2 Pemeriksaan Flavonoida
Sebanyak 10 g serbuk simplisia ditambah 10 ml air panas, dididihkan selama 5 menit dan disaring dalam keadaan panas. Kedalam 5 ml filtrat
ditambahkan 0,1 g serbuk magnesium dan 1 ml asam klorida pekat dan 2 ml amil alkohol, dikocok dan dibiarkan memisah. Flavonoida positif jika terdapat warna
merah kekuningan atau jingga pada lapisan amil alkohol Farnsworth, 1966.
Universitas Sumatera Utara
3.6.3 Pemeriksaan glikosida
Sebanyak 3 g serbuk simplisia ditimbang, lalu disari dengan 30 ml campuran dari 7 bagian etanol 95 dan 3 bagian air suling. Kemudiaan direfluks
selama 10 menit, didinginkan, lalu disaring. Diambil 20 ml filtrat , ditambahkan 25 ml air suling dan 25 ml timbal II asetat 0,4 M, dikocok, didiamkan 5 menit
lalu disaring. Filtrat disari dengan 20 ml campuran 2 bagian isopropanol dan 3 bagian kloroform, perlakuan ini diulangi sebanyak 3 kali. Sari air dikumpulkan
dan diuapkan pada temperatur tidak lebih dari 50
o
C, sisanya dilarutkan dalam 2 ml metanol. Larutan sisa digunakan untuk percobaan berikut: 0,1 ml larutan
percobaan dimasukkan dalam tabung reaksi, kemudian diuapkan di atas penangas air. Pada sisa ditambahkan 2 ml air dan 5 tetes larutan perekasi Molish, lalu
ditambahkan dengan hati-hati 2 ml asam sulfat pekat, terbentuk cincin ungu pada batas kedua cairan, menunjukkan adanya ikatan gula glikon Depkes RI, 1995.
3.6.4 Pemeriksaan antrakinon
Sebanyak 0,2 g serbuk simplisia dicampur dengan 5 ml asam sulfat 2N, dipanaskan sebentar, setelah dingin ditambahkan 10 ml benzen, dikocok dan
didiamkan. Lapisan benzen dipisahkan dan disaring, kemudian kocok dengan 2 ml NaOH 2 N, didiamkan. Lapisan air berwarna merah menunjukkan adanya
antrakinon Depkes RI, 1995.
3.6.5 Pemeriksaan saponin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 10 ml air suling panas, didinginkan, kemudian dikocok kuat-kuat
selama 10 detik. Saponin positif jika terbentuk busa yang stabil tidak kurang dari
Universitas Sumatera Utara
10 menit setinggi 1 sampai 10 cm dan dengan penambahan 1 tetes asam klorida 2 N buih tidak hilang Depkes RI, 1995.
3.6.6 Pemeriksaaan tanin
Sebanyak 0,5 g serbuk simplisia disari dengan 10 ml air suling lalu disaring, filtratnya diencerkan dengan air sampai tidak berwarna. Larutan diambil sebanyak
2 ml dan ditambahkan 1-2 tetes pereaksi besi III klorida 1. Jika terjadi warna biru atau kehitaman menunjukkan adanya tannin Depkes RI, 1989.
3.6.7 Pemeriksaan steroidatriterpenoid
Sebanyak 1 g serbuk simplisia dimaserasi dengan eter 20 ml selama 2 jam, disaring , lalu filtrat diuapkan dalam cawan penguap. Pada sisa ditambahkan 20
tetes asam asetat anhidrat dan 1 tetes asam sulfat pekat pereaksi Lieberman- burchard, diteteskan pada saat akan mereaksikan sampel uji. Apabila terbentuk
warna biru atau biru hijau menunjukkan adanya steroida sedangkan warna merah, merah muda atau ungu menunjukkan adanya triterpenoid Harborne, 1987.
3.7 Pembuatan Ekstrak Buah Kurma Cina Ziziphus jujuba Mill.
3.7.1 Pembuatan ekstrak etanol Pembuatan ekstrak buah kurma Cina dilakukan secara perkolasi. Prosedur
pembuatan ekstrak: sebanyak 400 g serbuk simplisia dibasahi dengan etanol 70 dan dibiarkan selama 3 jam. Kemudian dimasukkan ke dalam alat perkolator, lalu
dituang cairan penyari etanol 70 sampai semua simplisia terendam dan terdapat selapis cairan penyari diatasnya, mulut tabung perkolator ditutup dan dibiarkan
selama 24 jam, kemudian kran dibuka dan dibiarkan tetesan ekstrak mengalir dengan kecepatan perkolat diatur 1 ml tiap menit, perkolat ditampung. Perkolasi
Universitas Sumatera Utara
dihentikan pada saat perkolat yang keluar terakhir diuapkan, tidak meninggalkan sisa. Perkolat yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan alat rotary evaporator
setelah itu di freeze dryer hingga diperoleh ekstrak kental Ditjen POM, 1979. Bagan ekstraksi dapat dilihat pada Lampiran 6, halaman 58.
3.7.2 Pembuatan ekstrak n-Heksana, fraksi kloroform, fraksi etilasetat, fraksi metanol
Pembuatan ekstrak buah kurma Cina dilakukan secara perkolasi bertahap.
Prosedur pembuatan ekstrak: sebanyak 360 g serbuk simplisia dibasahi dengan n- heksana dan dibiarkan selama 3 jam. Kemudian dimasukkan ke dalam alat
perkolator, lalu dituang cairan penyari n-heksana sampai semua simplisia terendam dan terdapat selapis cairan penyari diatasnya, mulut tabung perkolator
ditutup dan dibiarkan selama 24 jam, kemudian kran dibuka dan dibiarkan tetesan ekstrak mengalir dengan kecepatan perkolat diatur 1 mlmenit, perkolat
ditampung. Perkolasi dihentikan pada saat perkolat yang keluar terakhir diuapkan, tidak meninggalkan sisa. Perkolat yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan
alat rotary evaporator setelah itu di freeze dryer hingga diperoleh ekstrak kental. Ampas dikeringkan lalu diekstraksi dengan menggunakan pelarut berturut-turut
kloroform, etilasetat dan metanol dengan prosedur yang sama dengan di atas Ditjen POM, 1979. Bagan ekstraksi dapat dilihat pada Lampiran 6, halaman 59.
3.8 Sterilisasi Alat dan Bahan
Alat-alat dan bahan-bahan untuk pemeriksaan mikrobiologi harus disterilkan lebih dahulu sebelum dipakai. Alat-alat yang mempunyai presisi disterilkan di
autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit dan alat-alat jenis lainnya disterilkan
Universitas Sumatera Utara
di oven pada suhu 170
o
C selama 1 jam, jarum ose dibakar dengan lampu bunsen, alat-alat plastik direbus dalam air mendidih.
3.9 Pembuatan Media Media
Nutrient Agar NA
Komposisi: Bacto-beef extrak
3 g Bacto-peptone
5 g Bacto-agar
15 g Cara pembuatan:
Ditimbang serbuk NA sebanyak 23 g, kemudian dilarutkan dalam akuades sebanyak 1 liter. Dipanaskan di penangas air sampai semua bahan larut sempurna.
Bahan dalam keadaan panas dituangkan ke dalam tabung reaksi kemudian disterilkan dalam autoklaf pada suhu 121
o
C selama 15 menit Difco, 1997.
Nutrient Broth
Komposisi: Bacto beef extract 3,0 g
Bacto peptone 5,0 g
Potassium nitrate 1.0 g Cara pembuatan:
Sebanyak 9 g nutrient broth dilarutkan dalam air suling steril sebanyak 1000 ml kemudian dipanaskan hingga semua larut, dalam keadaan panas larutan tersebut
kemudian dimasukkan dalam erlenmeyer. Lalu disterilkan di autoklaf 121
o
C selama 15 menit Difco, 1997.
Universitas Sumatera Utara
Media Sabouraud Dextrose Agar SDA
Komposisi: Bacto Neopeptone, Difco 10 g Bacto Dextrose
40 g Bacto Agar
15 g Cara pembuatan:
Ditimbang sebanyak 65 gram serbuk SDA ke dalam air suling hingga volume keseluruhan menjadi 1 liter lalu dididihkan hingga larut. Sterilkan pada
suhu 121
o
C selama 15 menit. Aduk dengan baik sebelum dituang.
3.10 Pembuatan Agar Miring 3.10.1 Pembuatan agar miring