Metode Pengujian Antimikroba TINJAUAN PUSTAKA

9 membran mukosa intens dengan eksudat purulent, membesar, nyeri tekan kelenjar limfe dan biasanya demam tinggi. 21 Dua puluh persen infeksi menunjukkan asimptomatik. 21 Gambaran klinis serupa dapat terjadi pada difteri, infeksi gonokokus, dan infeksi adenovirus. 7,21

2.3 Metode Pengujian Antimikroba

Metode pengujian antimikroba dibagi menjadi beberapa tipe berdasarkan penerapan dasar pada setiap sistem, diantaranya: a. Difusi 23 - Metode Stokes - Metode Kirby-Baurer b. Dilusi Konsentrasi Hambat Minimum KHM - Broth dilution - Agar dilution c. Difusi dan Dilusi Metode E-test 2.3.1 Metode Disc Diffusion Metode yang biasa digunakan untuk pengujian antimikroba adalah metode Kirby-Baurer dan Stokes, dimana metode Kirby-Baurer direkomendasikan oleh National Committee for Clinical Laboratory Standards NCCLS. Metode disc diffusion merupakan metode yang sederhana dan praktis dan telah distandarisasi dengan baik. Tes ini dilakukan dengan menggunakan inokolum bakteri kira-kira 10 1-2x10 8 CFUmL pada permukaan plat Mueller Hinton Agar. Dipersiapkan hingga 12 konsentrasi pada cakram kertas antibiotik pada permukaan inokulum agar. Plat diinkubasi selama 16-24 jam pada 35 C kemudian didapat hasil zona hambat pertumbuhan disekitar cakram antibiotik diukur menggunakan satuan panjang milimeter. Diameter dari zona berhubungan dengan kerentanan isolasi dan tingkat difusi bahan uji. Kemudian diameter zona hambat diinterpretasikan melalui kriteria Clinical and Laboratory Standards Institute CLSI atau US Food and Drug Administration FDA. Hasil dari tes disc diffusion adalah kualitatif. Keuntungan dari metode ini adalah kesederhanaan tes dimana tidak membutuhkan banyak peralatan khusus, kategori hasil dapat dengan mudah diinterpretasikan oleh semua dokter, dan fleksibilitas dalam pemilihan cakram untuk pengujian. Kekurangan tes ini adalah tidak adanya mekanisasi atau automatisasi. Diameter Zona Terang 23,24 Tabel 2.1. Klasifikasi Respon Hambatan Pertumbuhan Bakteri Respon Hambatan Pertumbuhan 20 mm Kuat 16-20 mm Sedang 10-15 mm Lemah 10 mm Tidak ada Sumber : Greenwood. 1995 2.3.2 Metode Dilusi Metode pengujian dilusi digunakan untuk menentukan konsentrasi minimum antimikroba untuk menghambat atau membunuh mikroorganisme. Hal ini bisa didapat melalui dilusi antimikroba pada media agar atau broth. Antimikroba diuji pada serial dilusi kelipatan dua didalam medium tumbuh cair yang diencerkan pada tabung pengujian. Tabung yang mengandung antimikroba diinokulasi dengan standar suspensi bakteri 1-5x10 5 CFUmL. kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35 C, pada tabung uji, tampak pertumbuhan bakteri dengan bukti turbiditas. Konsentrasi terendah dari antimikroba yang menghambat pertumbuhan menggambarkan konsentrasi hambat minimum. Konsentrasi hambat minimum secara luas digunakan untuk menentukan kerentanan dari mikroorganisme yang diisolasi dari spesimen klinik. Terdapat dua metode untuk menguji konsentrasi 11 hambat minimum yaitu metode agar dan metode broth. Metode dilusi broth merupakan prosedur sederhana untuk menguji sejumlah kecil isolat, meskipun isolat tunggal. Keuntungan dari teknik difusi broth adalah hasil kuantitatif. Kekurangan utama dari tes ini adalah membosankan, persiapan larutan antibiotik untuk tiap tes dilakukan secara manual, kemungkinan gagal pada persiapan larutan antimikroba, dan secara relatif membutuhkan reagen dan tempat dalam jumlah besar untuk tiap tes. 23 Uji mikrodilusi broth merupakan proses pengecilan dan mekanisasi dari dilusi broth. Tes ini menggunakan double-strength Müeller-Hinton broth, larutan antimikroba dengan kekuatan empat kali dipersiapkan dengan serial dilusi kelipatan dua dan organisme yang dites dalam konsentrasi 2x10 6 mL. Dalam 96 plat, 100μL double-strength Müeller-Hinton broth , 50μL tiap dilusi antimikroba dan larutan organisme dicampurkan dan diinkubasi pada suhu 35 C selama 18-24 jam. Konsentrasi terendah yang menunjukkan hambatan pertumbuhan dinyatakan sebagai konsentrasi hambat minimum KHM dari organisme tersebut. Keuntungan prosedur mikrodilusi termasuk hasil KHM, kemudahan mempersiapkan alat, dan kehematan reagen dan tempat. Selain itu, hasil laporan dibantu oleh komputer bila alat pembaca automatis digunakan. Kekurangan utama dari metode mikrodilusi ini adalah terdapat beberapa obat yang sulit untuk distandarisasi bila menggunakan alat ini. 23,24 Metode dilusi agar paling sering dipersiapkan pada cawan petri . Keuntungan metode ini mungkin dilakukan untuk menguji beberapa organisme pada tiap plat. Jika hanya satu mikroorganisme yang diuji, dilusi dapat dipersiapkan pada agar miring namun hal ini kemudian akan membutuhkan persiapan set identik kedua untuk diinokulasi dengan mikroorganisme kontrol. Dilusi dibuat dalam volume air dengan skala kecil dan ditambahkan agar yang telah dicairkan dan didinginkan pada suhu kurang dari 60 C. Darah dapat ditambahkan dan jika agar coklat dibutuhkan, medium harus dipanaskan sebelum antibiotik ditambahkan. 24 12 2.3.3 Metode E-test Metode difusi gradien antimikroba menggunakan prinsip gradien konsentrasi antimikroba pada medium agar untuk menentukan kerentanan suatu organisme. E-test ini merupakan metode kuantitatif untuk menguji kerentanan antimikroba yang menerapkan dilusi antimikroba dan difusi antimikroba ke dalam medium. E-test ini juga dikenal sebagai uji epsilometer yaitu uji dengan metodologi gradien eksponensial yang berarti ‘E’ pada E test berarti simbol Yunani epsilon ε. 23 Pada penelitian ini digunakan metode disc diffusion karena metode ini cukup valid untuk menguji aktivitas antibakteri. Selain itu metode ini praktis, sederhana, dan telah distandarisasi dengan baik. Kelebihan lain dari metode ini yaitu tidak membutuhkan peralatan khusus, kategori hasil yang mudah diinterpretasikan, dan fleksibilitas dalam pemilihan cakram untuk pengujian.

2.4 Kerangka Konsep