Kokain dalam spesimen manusia

9. Kokain dalam spesimen manusia

a. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)

1) Prinsip

Residu hasil ekstraksi dielusi dengan eluen tertentu, kemudian ditetapkan secara Kromatografi Lapis Tipis (KLT) sehingga terbentuk noda yang berwarna khas.

2) Alat

a) Peralatan kromatografi lapis tipis (KLT) terdiri dari : (1) Pipet kapiler (2) Plat KLT dilapisi silika gel berfluoresensi pada λ 254 nm

dengan ketebalan 0,25 mm (3) Tabung elusi (developing tank) (4) Lampu UV λ 254 nm

b) Spektrofotodensitometer

3) Reagen

a) Lapisan tipis Silica Gel G

b) Eluen, dipilih salah satu :

A : - Metanol

100 mL

- Ammonia pekat 1,5 mL

B : - Kloroform

c) Larutan Penampak Noda, dipilih salah satu : (1) Reagen Dragendorf

Larutan A : Campur 2 g Bismut subnitrat (Bismut Oksinitrat), 25 ml asam asetat glacial atau pekat 100 mL air. Larutan B : Larutan 40 g Kl dalam 100 mL air. Campur 10 mL larutan A dan 10 mL larutan B + 20 mL asam asetat glacial + 100 mL akuades

(2) Reagen Kalium Iodoplatinat yang diasamkan. Larutan 0,25 g platinat klorida dan 5 g Kl dalam akuades sampai 100 mL tambahkan 2 mL HCl pekat.

(3) Asam sulfat pekat 1 mL ditambahkan perlahan-lahan pada

10 mL larutan ferri klorida (5 % w/v) dan campurkan.

d) Larutan Standar. Larutan standar 1 mg/mL BE (Benzoylecgonin), kokain base dan Ecgonin metil ester dalam methanol.

4) Cara Kerja

Ekstraksi

Prinsip

Kokain diekstraksi dengan pelarut organik dalam suasana basa pada pH 8-9,5. Spesimen diatur pH sampai 9 (8-9,5) dengan buffer yang tepat. Hasil ekstraksi diuapkan, residu siap untuk pemeriksaan dengan alat KLT dan alat KG.

a) Membuat larutan buffer Buffer borax (pH 9-9,6)

19,07 natrium tetraborat (Na 2 B 4 O r 10H 2 O) dalam 1 liter air. Buffer Ammonia (pH 9,5) 10,7 g ammonium klorida dilarutkan dalam 40 mL larutan ammonia 5 M tambahkan akuades sampai 1 L.

b) Spesimen urin sebanyak 20 mL diatur pH-nya sampai 9 (8-9,5) dengan buffer.

c) Dengan pelarut ekstraksi diklorometan - isopropanol (85 : 5 v/v)

sebanyak 40 mL atau kloroform isopropanol (50 : 50 v/v) dua kali, tiap kali dengan larutan ekstrasi 20 mL Diamkan lapisan memisah, lapisan air (atas) dan lapisan ekstrak orgnik (bawah). Apabila terjadi emulsi gunakan kertas saring silikon.

d) Tampung ekstarak organik saring melalui kertas saring yang berisi sedikit natrium sulfat kering

e) Saringan cuci dengan pelarut ekstraksi 5 mL, hasil ekstraksi

diuapkan sampai kering dengan pompa vakum atau uap nitrogen. Ekstrak siap dipakai untuk penetapan secara Kromatografi Lapisan Tipis (KLT) dan Kromatografi Gas (KG)

Kromatografi Lapisan Tipis

- Ekstrak urin yang sudah dikeringkan dilarutkan dalam 50 µL methanol. - Totolkan 5-10 µL larutan satdar dan hasil ekstraksi pada plate dengan jarak 2 cm, kemudian elusi dalam Tabung elusi dengan salah satu larutan eluen.

- Keluarkan plate dari Tabung elusi kemudian keringkan. - Pengeringan dapat dilakukan pada suhu kamar atau dalam oven

pada suhu 120º C selama 10 menit atau dengan menggunakan udara panas dari blower.

- Plate yang telah kering disemprotkan dengan larutan penampak noda, kemudian diamati dengan lampu UV.

Pembacaan Hasil

Bandingkan nilai Rf ekstrak dengan Rf standar. Rf x 100

Noda yang timbul dengan penampak noda

Senyawa UV Iodoplatinat Dragendorff Kokain Hitam Ungu Orange

Benzoylecgonine Hitam

Orange Eme Negatif Biru Orange

Negatif

Penafsiran hasil pemeriksaan :

a) Waktu deteksi Obat dalam bentuk aslinya dapat terdeteksi dalam urin sampai

24 jam dan metabolit benzoylecgonine dan ecgonine methyl ester sampai 48 jam. Pada pemakai kronik waktu deteksi dapat lebih lama sampai 5 hari atau lebih. Dari pemeriksaan kokain dalam urin tidak dapat ditentukan jumlah kokain yang dikonsumsi, waktu selang sejak konsumsi terakhir.

b) Perhatian Ecgonine methyl ester dibentuk melalui aksi enzim pseudokolinesterase sehingga bila ada kelainan dengan aktivitas enzim ini, pola ekskresi metabolit akan berubah. Benzoylecgonine dapat terdeteksi dalam urin pada konsumsi teh kokain sedangkan anhydroecgonine methyl ester dapat terdeteksi setelah merokok kokain basa bebas (crack).

c) Analisis dan penafsiran hasil dalam spesimen manusia lain Konsentrasi plasma kokain biasanya kurang dari 0,5 µg/mL sedangkan benzoylecgonine 0,1 µg/mL, pada kasus overdosis, kadar kokain dalam darah 1-20 µg/mL dan benzoylecgonine 1-

10 µg/mL. Kokain dan metabolitnya menunjukkan stabilitas yang buruk dengan hidrolisis. Sampel darah dan plasma harus disimpan dalam tabung yang mengandung sodium fluorida dan pH dibuat pH 5 dengan asam asetik (10 %, v/v), setelah itu dapat disimpan di kulkas pada 4º C atau dibekukan untuk beberapa bulan. Sampel rambut dan air liur dari pengguna kokain ditemukan mengandung kokain, untuk kadar dalam rambut belum ada ketentuan sedangkan untuk kadar dalam air liur ditemukan berkorelasi dengan kadar dalam plasma.

b. Kromatografi Gas (KG)

1) Prinsip

Residu hasil ekstraksi yang dilanjutkan dengan derivatisasi dilarutkan dengan pelarut kloroform, methanol disuntikkan ke dalam kromatografi gas dengan kondisi tertentu sehingga dapat diketahui waktu retensi (Rt), luas area dan puncak kromatografi yang dihasilkan.

2) Alat

a) Vortex mixer

b) Heating block

c) Pipet kapiler

d) Kromatografi gas

3) Reagen

a) Pentafluoropropionik anhidrida (PFPA)

b) Pentafluoro-propanol (PFPOL)

c) Etil asetat

d) Larutan Standar Kalibrasi Pembuatan larutan kalibrasi : Buat larutan induk 1 mg/mL dari kokain, BE dan ecgonine metil ester dari internal standar dalam methanol. Siapkan larutan standar urin dari larutan induk yang mengandung kokain 0-5 µg/mL, BE dan ecgonine metil ester 0-25 µg/mL internal standar = 25 µg/mL Larutan standar kalibrasi dilaksanakan cara kerjasama dengan spesimen.

e) Gas Nitrogen

4) Cara Kerja

Ekstraksi (lihat ekstraksi Metoda KLT) Derivatisasi

a) Tambahkan 50 µL PFPA dan 25 µL PFPOL ke dalam ekstrak kering hasil ekstraksi. Kocok di atas vortex mixer dan panaskan diatas heating block pada suhu 90º C selama 15 menit.

b) Biarkan tabung sampai dingin dan uapkan ekstrak spesimen sampai kering pada suhu 48º C dengan aliran gas nitrogen, kemudian larutkan residu dalam 25 µL etil asetat Injeksikan 1-2 µL larutan standar kalibrasi dan hasil derivatisasi ke dalam injektor.

c) Derivat PFPA stabil dalam reagen 1 bulan dan 24 jam setelah reagen diuapkan

d) Kromatografi Gas (KG)

Kondisinya sebagai berikut : - Detektor : NPD atau FID - Kolom

: Packed coloum*)

- dimetil silikon (SE-30, OV-1)

- fenil metil silikon 50 % fenil (OV-17) - Suhu

: Oven

: 220º C

Injektor : 220º C Detektor : 300º C

- Gas : Notrogen dengan kecepatan alir 30 mL/menit Hidrogen dengan kecepatan alir 30 mL/menit *) Cappilary Column yang sesuai (lihat lampiran 5)

Pembacaan Hasil

Bandingkan rekaman hasil pemeriksaan dengan standar.

c. Metoda Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM)

Hasil derivatisasi untuk pemeriksaan secara kromatografi gas dapat dilanjutkan dengan menginjeksikan 1-2 µL larutan standar kalibrasi dan hasil derivatisasi ke dalam injektor Kromatografi Gas- Spektrometri Massa (KG-SM).

Penafsiran hasil pemeriksaan :

a) Waktu deteksi Obat dalam bentuk aslinya dapat terdeteksi dalam urin sampai

24 jam dan metabolit benzoylecgonine dan ecgonine methyl ester sampai 48 jam. Pada pemakai kronik waktu deteksi dapat lebih lama sampai 5 hari atau lebih. Dari pemeriksaan kokain dalam urin tidak dapat ditentukan jumlah kokain yang dikonsumsi, waktu selang sejak konsumsi terakhir.

b) Perhatian Ecgonine methyl ester dibentuk melalui aksi enzim pseudokolinesterase sehingga bila ada kelainan dengan aktivitas enzim ini, pola ekskresi metabolit akan berubah. Benzoylecgonine dapat terdeteksi dalam urin pada konsumsi teh kokain sedangkan anhydroecgonine methyl ester dapat terdeteksi setelah merokok kokain basa bebas (crack).

c) Analisis dan penafsiran hasil dalam spesimen manusia lain Konsentrasi plasma kokain biasanya kurang dari 0,5 µg/mL sedangkan benzoylecgonine 0,1 µg/mL, pada kasus overdosis, kadar kokain dalam darah 1-20 µg/mL dan benzoylecgonine 1-

10 µg/mL. Kokain dan metabolitnya menunjukkan stabilitas yang buruk dengan hidrolisis. Sampel darah dan plasma harus disimpan dalam tabung yang mengandung sodium fluorida dan pH dibuat 10 µg/mL. Kokain dan metabolitnya menunjukkan stabilitas yang buruk dengan hidrolisis. Sampel darah dan plasma harus disimpan dalam tabung yang mengandung sodium fluorida dan pH dibuat