Kanabis dalam spesimen manusia

10. Kanabis dalam spesimen manusia

a. Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)

1) Prinsip

Residu hasil hidrolisa yang dilanjutkan dengan ekstraksi yang dielusi dengan pelarut tertentu akan membentuk noda yang berwarna khas.

2) Alat

a) Peralatan kromatografi lapis tipis (KLT) terdiri dari : (1)Pipet kapiler (2) Plat KLT dilapisi silika gel berfluoresensi pada λ 254 nm

dengan ketebalan 0,25 mm (3) Tabung elusi (developing tank) (4) Lampu UV λ 254 nm

b) Spektrofotodensitometer

3) Reagen

a) Lapisan tipis silica gel G

b) Eluen, dipilih salah satu :

A: - Etil asetat

- Metanol

- Amonia pekat

- Akuades 0,5

B: - Kloroform

- Metanol

- Amonia pekat

c) Larutan penampak noda harus dibuat baru 0,1% larutan Fast Blue B Salt dalam air, apabila dalam air tidak timbul warna dapat ditambahkan NaOH encer.

d) Larutan standar Larutan 9-carboxy-THC 1 mg/mL dalam methanol

e) Gas Nitrogen

4) Cara Kerja Persiapan spesimen (1) Hidrolisa

Hidrolisa alkali. Pipet 10 mL urin ke dalam tabung gelas bertutup, untuk pemeriksaan dengan KG ditambah standar internal. Tambahkan 2 mL kalium hidroksida 10 N, tutup tabung dan inkubasi pada 50º C selama 20 menit dengan sekali-kali diaduk. Lanjutkan dengan ekstraksi.

(2) Ekstraksi Prinsip

9 karboxy THC dari urin yang telah dihidrolisa diekstraksi dalam suasana asam. Hasil ekstraksi diuapkan pada suhu 35º-40º C. Residu siap untuk pemeriksaan dengan KLT dan KG.

Cara ekstraksi ada 2 : (1). Gair–cair

- Spesimen hasil hidrolisa setelah didinginkan, pindahkan ke dalam corong pisah, pH diatur sampai 2 HCl 2 N atau

H 2 SO 4 2N - Tambahkan 15 mL Sikloheksan-etil asetat (7 : 1, v/v) - Ekstraksi dengan mengocok selama 10 menit - Pindahkan lapisan organik, saring melalui natrium sulfat

kering ke dalam tapered tube, cuci saringan dengan 5 mL pelarut (sikloheksan-etil asetat)

- Uapkan sampai kering pada temperatur kamar dengan aliran udara atau gas nitrogen, larutkan kembali residu dalam 0,2 mL methanol atau asetonitril-methanol (3:1, v/v) dengan pengocokan atau sonikator.

(2) Solid-phase (SPE) (a) Kolom SPE yang sesuai dicuci dengan mengalirkan pelan-pelan masing-masing 3 mL methanol, akuades, methanol dan air.

(b) Plastic syring body 10 mL dipasangkan pada kolong digunakan sebagai reservoir Gunakan vakum dengan kecepatan rendah untuk menaikkan kecepatan aliran. Urin yang sudah dihidrolisa (2 mL) masukkan ke dalam kolom, cuci dengan 10 mL HCl 0,1 N dan 25 mL larutan asam fosfat 0,5 M dalam asetonitril 10 %.

(c) Elusi 9-carboxy-THC dengan 1 mL aseton (d) Uapkan larutan dibawah aliran gas nitrogen, larutkan

kembali dengan 0,1 mL methanol.

(3) Kromatografi Lapisan Tipis (KLT)

(a) Totolkan 5-10 µL larutan standar dan hasil ekstraksi pada plate dengan jarak 2 em, kemudian elusi dalam Tabung elusi dengan salah satu larutan eluen.

(b) Keluarkan plate dari Tabung elusi, kemudian plate dikeringkan sebelum disemprotkan dengan penampak noda.

(c) Pengeringan dapat dilakukan pada suhu kamar atau dalam oven pada suhu 120º C selama 10 menit atau dengan menggunakan udara panas dari blower.

(d) Plate yang telah kering disemprot dengan larutan penampak noda kemudian amati dibawah lampu UV.

Pembacaan Hasil

Bandingkan nilai Rf ekstrak dengan Rf standar.

Rf x 100

b. Kromatografi Gas (KG)

1) Prinsip

Residu hasil ekstraksi yang dilanjutkan dengan derivatisasi dilarutkan dengan pelarut kloroform methanol disuntikkan ke dalam kromatografi gas dengan kondisi tertentu sehingga dapat diketahui waktu retensi (Rt) luas area dan puncak kromatografi yang dihasilkan.

2) Alat

(1) Derivatisasi - Tabung runcing berskala 10 mL - Vortex mixer

(2) Kromatografi gas

3) Reagen

a) Larutan standar internal Siapkan larutan induk kanabinol 1 mg/mL dalam etanol absolut

1 mL larutan induk masukkan dalam labu takar 200 mL dan tambahkan etanol absolut sampai tanda. (1 mL larutan standar internal = 5 µ kanabinol)

b) Derivatisasi, dipilih salah satu : (1) N,O - bis - trimethylsilyl - trifluoroacetamide (BSTFA) dan

trimethyl clorosilane (TMCS) (2) Campuran tetra metil ammonium hidroksi (TMAH)

(a) dimetril sulfoxid (DMS) (b) metil iodida (c) HCl

c) Gas nitrogen

4) Cara Kerja

a) Ekstraksi (lihat ekstraksi Metoda KLT) Hasil ekstraksi kemudian diderivatisasi dengan cara sebagai berikut : (1) Ekstrak urin dalam tabung diuapkan sampai kering dibawah

aliran gas nitrogen, ditambah 50 µL BSTFA dan TMCS, campur dengan menggunakan vortex mixer dan dipanaskan pada suhu 60º C selama 10 menit.

(2) Residu yang didapat dilarutkan dengan 50µL dengan pelarut organik (3) Residu kering ditambah 70 µL 10 % TMAH-dimetil-sulfoksida (1 ; 20 v/v), setalah 2 menit tambah 5 µL metil iodida. (4) Setalah 10 menit tambah 200 µL 0,1 N HCl ekstraksi dengan

2 mL iso oktan. (a) Lapisan iso oktan yang terpisah diuapkan dengan alran gas nitrogen. (b) Residu dilarutkan kembali dengan 50 µL pelarut organik (c) Ambil 1-2 µL diinjeksikan ke dalam injektor

b) Kromatografi Gas - Detector : FID - Kolom

: *) Packed Coloum 2 m x 2 mm ID

- 3 % dimetil silikon()OV-1) - 3 % fenilmetil silikon 50 % fenil (V-17)

- Gas : Nitrogen/Helium dengan kecepatan alir 30mL/

mnt

- Suhu

: Injektor 210º C

Oven 255º C Detektor 275º C

*) Cappilary Coloum yang sesuai (Lihat lampiran 5)

Pembacaan Hasil

Bandingkan rekaman hasil pemeriksaan dengan standar.

c. Kromatografi Gas-Spektrometri Massa (KG-SM)

1). Prinsip

Metabolit senyawa kannabis dalam bentuk glukoronida-11-nor- delta-9 tetrahidrokannabinol-9karboksilat (9-Karboksi THC-Gluc) di pecah/hidrolisis dalam suasana basa dengan cara inkubasi temperatur kamar selama 30 menit menjadi senyawa 9-karboksi THC bebas yang kemudian dilanjutkan dengan cara ekstraksi alkilasi untuk mempermudah penguapan senyawa bersifat asam melalui proses derivatisasi metil iodida dalam suasana basa, Metabolit senyawa kannabis dalam bentuk glukoronida-11-nor- delta-9 tetrahidrokannabinol-9karboksilat (9-Karboksi THC-Gluc) di pecah/hidrolisis dalam suasana basa dengan cara inkubasi temperatur kamar selama 30 menit menjadi senyawa 9-karboksi THC bebas yang kemudian dilanjutkan dengan cara ekstraksi alkilasi untuk mempermudah penguapan senyawa bersifat asam melalui proses derivatisasi metil iodida dalam suasana basa,

kelebihan THA + diabsorpsi oleh resin XAD 7 dan selanjutnya turunan metil bersifat lebih polar ditampung untuk pemeriksaan GC-

MS yang sebelumnya diuapkan dan dilarutkan dalam etil asetat

2). Alat

a) Tabung reaksi dengan tutup ulir 12.5 ml

b) Transferpet 1 – 10 ul, 20 –200 ul dan 0,5 – 5,0 ml,

c) Rotary Shaker

d) Vortex/minishaker

e) Kolom Resin XAD 7

f) Pipet pasteur

g) Turbo Vap LV

h) Gas Nitrogen

i) Sentifus j) Vial GC k) GC/MSD

3). Reagen

Semua bahan kimia harus pro-analisa a). Larutan induk

11-nor-delta-9tetrahidrokannabinol-9karboksilat 10 µg /mL, larutan induk Internal Standard Mefruside 100 µg /mL

b). Enzim β-glukoronidase (H. Pomatia) dari SIGMA, c). Larutan NaOH 1 M, d). Larutan Tetraheksilammonium hidrogen sulfat 0.2 M dari

Aldrich e). Toluen f). Metil Iodida g). Kolom Resin XAD 7 dari Supelco h). Metanol

i). Etil Asetat

4). Cara Kerja

a). Siapkan tabung reaksi berlabel masing-masing berisi 2 mL blanko akuades, 2 ml blanko urin, 2 ml larutan standar spike 10 µL 11-nor-delta-9tetrahidrokannabinol-9karboksilat 10 µg /mL dan 2 mL sampel urin (duplo)

b). Tambahkan pada setiap tabung reaksi

20 µL larutan Mefruside 100 µg/mL sebagai ISTD

50 µL Natrium Hidroksida. 6 M, tunggu selama 30 menit untuk hidrolisa

100 µL Tetraheksilammonium hidrogen sulfat 0.2 M

5.0 mL Toluen

100 µL Metil Iodida

Tutup tabung reaksi dengan benar dan pastikan tidak bocor dan kocok pada rotary shaker selama 1 jam

Sentifus selama 5 menit

Siapkan kolom resin, cuci masing-masing dengan 2 x

1 ml metanol dan toluen

Pindahkan fasa organik dari tabung reaksi tersebut dengan pipet pasteur ke dalam 2.5 – 3 cm kolom resin XAD-7 kolom resin sambil dikumpulkan eluat ke dalam tabung reaksi berlabel. Setelah selesai XAD-7 resin diregenerasi dengan 2 x 2 ml metanol.

Uapkan lapisan toluen sampai kering menggunakan peralatan Turbovap 40º

C yang dialiri gas Nitrogen selama 10 menit pada 15 psi

Larutkan residu yang telah kering dengan 100 µL etil asetat

Pindahkan larutan tersebut ke dalam vial GC yang berlabel dengan penomoran dan siap untuk diinjeksikan ke GC-MSD

5). Kondisi Alat Kromatografi Gas Spektrometri Massa

Metode

: Scan

Kolom : Kolom Ultra 2 dari Hewlett Packard, panjang 17 meter diameter 0,25 mm; film thickness 0,11 µm

Suhu injektor : 280º C Suhu Detektor 300º C Suhu Oven : T

C, dengan kenaikan 30º

C /menit

1 : 210º C, dengan kenaikan 5º

C /menit

C, dengan kenaikan 40º

C /menit

C, hold time 1 menit

Gas Pembawa ; Helium, Split, Pressure : 18.74 psi Laju Gas

: 1.4 mL/mnt, laju konstan

Volume Injeksi : 4 µl Waktu Retensi : 9-karboksi THC, 13.39 menit

ISTD Mefruside, 17.menit

Run Time

15 menit

Tabel IV.11 Ion Base Peak Dan Ion Lainnya Untuk 9 Karboksi THC Dan ISTD Setelah Diderivatisasi

Ion 3 9karboksi-THC-CH3 313 357 372 Mefruside 85

Senyawa

Ion base peak

Ion 2

Penafsiran hasil pemeriksaan Waktu deteksi :

Waktu metabolit dapat terdeteksi dalam urin bergantung pada metode immunoassay dan batas deteksi. Biasanya pengguna akut (kurang dari 2 kali seminggu) dapat terdeteksi dalam 1-3 hari dalam urin ketika menggunakan metode dengan batas deteksi di atas 100 ng/mL (atau kurang), untuk pengguna kronis waktu deteksinya lebih lama, dapat lebih dari 1 minggu.

Inhalasi positif :

Perokok pasif marijuana dapat terdeteksi melalui urin bila menggunakan metode dengan batas deteksi 20 ng/mL, tetapi hal ini jarang terjadi. Bila didapat kadar lebih dari 100 ng/mL, kemungkinan perokok pasif dapat disingkirkan.

Variasi kadar :

Kadar obat dalam urin dapat berubah 10 kali lipat dalam beberapa jam bergantung pada asupan cairan. Sehingga harus berhati-hati menafsirkan kadar THC yang bervariasi di sekitar batas deteksi, hasil yang negatif kemudian diikuti hasil positif belum tentu berarti adanya penambahan konsumsi marijuana.