BAB II TINJAUAN PUSTAKA
Toksisitas Aluminium
Faktor pembatas pertumbuhan tanaman pertanian di tanah masam adalah kelarutan aluminium yang tinggi. Tingkat kelarutan Al dipengaruhi oleh perubahan pH
media. Pada kondisi pH rendah, Al
3+
Aluminium mempunyai berbagai bentuk mineral seperti hidroksida gibbsite, aluminosilikat kaolinite, sulfat jurbanite dan fosfat variscite. Al akan dilepaskan
dari bentuk mineral jika pH tanah berubah rendah R’bia et al. 2011. Di dalam pH larutan yang lebih rendah dari 5, ion Al tersedia dalam bentuk AlH
merupakan bentuk yang dominan dan beracun bagi banyak tanaman Delhaize Ryan 1995. Ciri utama keracunan Al adalah terjadi
penghambatan pertumbuhan akar, yang pada akhirnya akan menurunkan produktifitas tanaman. Produksivitas tanaman pangan khususnya biji-bijian dipengaruhi oleh kondisi
pH rendah, contohnya produktivitas jagung menurun 20, dan padi menurun 13 Kochian et al. 2004. Meskipun usaha pengapuran telah dilakukan tetapi strategi ini
tidak cukup efektif meningkatkan pH dan kurang ekonomis Kochian et al. 2004.
2
O
6 3+
atau Al
3+
, dan seiring meningkatnya pH, maka Al
3+
mengalami deprotonisasi menjadi AlOH
2+
dan AlOH
2 +
Delhaize Ryan, 1995; R’bia et al. 2011. Spesiasi Al dipengaruhi oleh pH seperti ditunjukkan pada Gambar 2.
Gambar 2. Pengaruh pH terhadap bentuk spesiasi Al Miyasaka et al. 2006.
Keberadaan Al
3+
di dalam larutan tanah merngubah permukaan senyawa inorganik dan juga subtansi organik di tanah. Al
3+
adalah logam yang reaktif yang dapat membentuk komplek dengan berbagai ligan organik maupun anorganik termasuk
karboksilat, Kochian et al. 2002, fosfat, sulfat, grup karboksil, asam organik, protein dan lemak Delhaize Ryan, 1995; Poschenrieder et al. 2008. Beberapa bentuk
spesies Al mempunyai toksisitas yang rendah misalnya AlF, AlSO
4
dan AlP Miyasaka et al. 2006. Karakter reaktif Al
3+
Mekanisme Toksisitas Al di Jaringan Akar Tanaman
ini juga mempengaruhi penyerapan beberapa hara penting bagi tanaman seperti P, Ca, Mg, dan K Matsumoto Yamaya 1988.
Fokus penelitian dalam satu dekade terakhir masih berkisar mengenai toksisitas Al di daerah apoplasma. Proses penghambatan akar yang berlangsung cepat diduga kuat
karena adanya Al di apoplasma. Al
3+
fitotoksik merupakan logam trivalen yang paling beracun dibandingkan logam trivalen lainnya seperti La
3+
, Cr
3+
atau Ga
3+
Gangguan Al terhadap pertumbuhan akar diawali dengan akumulasi Al di ujung akar. Akumulasi Al di akar dapat dideteksi dengan pewarnaan hematoksilin. Genotipe
yang sensitif akan menunjukkan warna hematoksilin yang lebih intensif dibandingkan genotipe yang toleran Matsumoto Motoda, 2012. Proses pembelahan dan
pemanjangan sel-sel di ujung akar dihentikan oleh keberadaan Al di jaringan akar, sehingga akar menjadi rapuh, perkembangan rambut akar menjadi berkurang dan
membengkak Panda et al. 2009. Aluminium tidak hanya berkaitan dengan berkurangnya pertumbuhan akar tetapi juga arsitektur akar. Aluminium mempengaruhi
struktur akar yang menyebabkan akar menjadi pendek tebal dan bersisik. Akumulasi Al di daerah ujung akar terutama terjadi di zona transisi paling sensitif, yaitu zona antara
zona sel-sel yang aktif membelah dengan zona pemanjangan sel Poschenrieder et al. 2008.
. Toksisitas Al dapat mengganggu pertumbuhan akar meskipun dalam konsentrasi rendah dan dalam
waktu beberapa jam saja. Absorbsi Al berlangsung cepat walaupun dalam jumlah kecil. Aluminium sudah dapat mencapai vakuola dalam waktu 30 menit Miyasaka et al.
2006. Berbagai molekul menjadi target utama Al, yaitu karboksil pektin pada dinding sel, fosfolipid plasma membran, ATP dan nukleotida di bagian dalam sel Poschenrieder
et al. 2008.
Perubahan struktur sel-sel akar di bawah cekaman aluminium meliputi reduksi jumlah butir pati dalam leukoplas, inti sel tersegmentasi dan adanya kondensasi
kromosom pada inti Nagy et al. 2004, reduksi sisterna diktiosom, dan kerusakan pada membran plasma. Di samping itu juga terjadi pembengkakan mitokondria dan reduksi
jumlah cristae, serta penebalan pada dinding sel Konarska 2008. Proses penebalan dinding sel atau lignisasi endodermis akar tanaman sensitif lebih cepat dikarenakan
adanya akumulasi Al di jaringan korteks Silva et al. 2010. Di dalam sel, Al akan memicu akumulasi polisakarida dinding sel utamanya
hemiselulosa sehingga terjadi penebalan dinding sel. Pengikatan Al terhadap material penyusun dinding sel yang baru akan menyebabkan perubahan susunan material,
kekuatan dinding sel, elastisitas dan viskositas dinding sel yang baru terbentuk Ma et al. 2004. Interaksi aluminium dengan sel-sel zona pemanjangan akar tidak hanya
menghambat pemanjangan sel-sel tetapi menyebabkan penghambatan pembelahan sel yang dapat dilihat dari perubahan morfologi ujung akar. Faktor utama perubahan ini
adalah gangguan pada dinding sel yang mengikat Al dan menempatkan di apoplas. Pektin metilesterase yang berperan dalam demetilasi pektin meningkat dengan adanya
cekaman Al. Gangguan Al menyebabkan inisiasi akar baru di bagian distal zona pemanjangan. Inisiasi ini disebabkan adanya hambatan transport auksin ke ujung akar
dengan adanya zat penghambat asam naftilptalamat Poschenrieder et al. 2008. Laju influk Al
3+
ke dalam sitoplasma relatif rendah. Diduga Al masuk ke simplas secara pasif yang difasilitasi oleh protein tertentu yang belum diketahui.
Gradien Al ini terjaga dengan pengkelatan Al yang baru saja masuk oleh sitrat asam organik. Di simplas, pH netral menyebabkan aktivitas Al
3+
menjadi sangat rendah. Walaupun konsentrasi hanya nanomolar, Al sudah sangat efisien berkompetisi dengan
Mg
2+
Interaksi Al dengan membran plasma menyebabkan terganggunya fluiditas dan potensial membran sehingga merubah sifat permeabilitasnya Poschenrieder et al. 2008.
Selain itu, interaksi Al dengan membran plasma mengganggu sistem transport, homeostasis kalsium, transduksi signal dan penghambatan mikrotubul Ma 2000.
Aluminium menghambat efluk H dalam mengikat ATP Ma 2000; Poschenrieder et al. 2008.
+
, serta mengurangi aktivitas K
+
, Mg
+
dan ATPase membran plasma Panda et al. 2009.
Peroksidasi lipida merupakan gejala permulaan keracunan Al Yamamoto et al. 2001. Reaksi ini dipicu oleh senyawa radikal Reactive oxygen speciesROS sebagai
akibat cekaman Al di dalam jaringan akar Yamamoto et al. 2002. Degradasi lipid ini mengakibatkan membran plasma kehilangan integritasnya Yamamoto et al. 2001,
yang selanjutnya memicu gangguan fungsi akar dalam penyerapan hara dan air Mossor-Peitraszewska, 2001, sehingga menyebabkan defisiensi unsur hara. Tanaman
yang keracunan Al, pada beberapa kasus daunnya menunjukkan gejala yang mirip dengan defisiensi fosfor P, kalsium Ca atau besi Fe Rout et al. 2001.
Proses penghambatan pertumbuhan akar oleh Al terjadi dalam waktu beberapa jam saja. Beberapa peneliti berargumen bahwa penghambatan tersebut disebabkan
adanya gangguan dalam transduksi signal Jones Kochian 1995. Sebagai buktinya, aluminum menghambat aktivitas fosfolipase C FLC yang berperan melepaskan
inositol 1,4,5-trifosfat ke sitoplasma dan diasil gliserol DAG ke membran Jones Kochian 1995. Selain FLC, Al juga menghambat calmodulin yang berperan
mengaktifkan beberapa protein kinase Panda et al. 2009. Transport kalsium oleh akar juga terganggu dengan keberadaan Al di dalam larutan. Sementara Ca
2+
diketahui mengatur berbagai proses dalam pertumbuhan sel dan metabolisme. Target downstream
aliran hilir signal Ca
2+
adalah kanal ion, protein kinase, dan sitoskeleton yang dikaitkan dengan pembelahan dan pertumbuhan sel Srivastava 2002. Gangguan
homeostasis Ca
2+
akan mereduksi pembelahan sel dan pemanjangan akar Panda et al. 2009. Al dapat merubah fungsi membran dengan mengikat fosfolipid. Pengikatan
tersebut menginduksi terbentuknya senyawa oksigen reaktif yang menyebabkan peroksidasi lipid Yamamoto et al. 2001. Toksisitas Al ini juga memicu perubahan
potensial membran. Perubahan ini mempengaruhi penyerapan kalsium Ca
2+
Penelitian yang mengkaitkan toleransi Al dengan selektifitas membran dilakukan dengan mempelajari kanal Ca
. Kalsium di dalam sitoplasma telah diketahui mempunyai peran penting dalam pertumbuhan sel
dan metabolisme Panda et al. 2009.
2+
. Aluminium memblok kanal Ca
2+
di membran plasma, sehingga terjadi penurunan penyerapan Ca
2+
memicu defisiensi kalsium. Defisiensi Ca
2+
akan mengganggu homeostasis Ca
2+
yang berpengaruh terhadap struktur dan fungsi sel. Diduga kanal Ca
2+
pada tanaman toleran tidak mudah diblok oleh Al Rengel et al.1995; Ryan et al. 1997. Namun penelitian berikutnya
membuktikan tidak terdapat perbedaan antara tanaman yang toleran dibandingkan dengan tanaman sensitif dalam hal peran dari kanal Ca
2+
Toleransi Tanaman Terhadap Cekaman Al
. Perbedaan toleransi antar kedua genotipe dikarenakan adanya perubahan aktivitas di rizosfer yang mereduksi
toksisitas Al Huang et al. 1995.
Mekanisme toleransi tanaman dibagi menjadi dua kelompok yaitu eksternal dan internal. Mekanisme toleransi eksternal meliputi imobilisasi Al dinding sel, selektifitas
membran plasma terhadap Al, induksi pH di daerah perakaran atau apoplasma, eksudasi senyawa-senyawa pengkelat Al. Mekanisme toleransi internal meliputi pengkelatan Al
di sitosol, pengurungan Al di vakuola, pengikatan Al oleh protein, akumulasi protein tertentu Taylor 1991.
Ma et al. 2001 mengajukan dua tipe mekanisme ekslusi asam organik dalam kaitannya dengan cekaman Al. Tipe pertama, asam organik disekresikan sesaat 15-30
menit setelah Al ditambahkan di media. Hal ini telah dilaporkan oleh Delhaize et al. 1993 pada tanaman Triticum aestivum yang mensekresikan malat dalam 15 menit
setelah ditambahkan Al. Tipe kedua, sekresi asam organik ditunda beberapa jam, seperti di Casia tora di mana akumulasi sitrat di ujung akar meningkat pada 3 jam setelah
dicekam oleh Al, sedangkan eksudasi terjadi pada 6 jam setelah perlakuan Al Yang et al. 2004.
Kecepatan sekresi asam organik pada tipe pertama karena tidak memerlukan induksi protein baru, tetapi cukup mengaktifkan protein tranporter tertentu yang ada di
membran Ma et al. 2001. Sebaliknya pada tipe sekresi kedua memerlukan aktivasi gen tertentu seperti protein tranporter atau enzim-enzim yang terlibat dalam biosintesis
asam organik Kochian et al. 2004. Kochian et al. 2004 mengilustrasikan peran asam organik dalam
mendektosifikasi Al Gambar 3. Mekanisme eksklusi Al melibatkan kanal yang ada pada membran plasma. Dalam mekanisme ekslusi ini ada tiga kemungkinan yaitu 1 Al
langsung mengaktifkan protein kanal, 2 Al masuk ke dalam sitosol dan mengaktifkan protein kanal dan 3 Al mengaktifkan transduksi signal mengirimkan pesan untuk
mengaktifkan protein kanal Gambar 3. Asam organik tidak hanya berperan dalam pertahanan eksternal tetapi juga
internal. Watanabe dan Osaki 2002 melaporkan bahwa Melastoma sebagai tanaman
akumulator Al mensekresikan asam organik terutama oksalat. Al yang terikat oksalat dibawa dan dilepaskan ke xilem. Di jaringan ini Al diikat oleh sitrat dan dibawa ke daun,
dan di daun Al diikat oleh oksalat untuk ditimbun di vakuola atau sitosol epidermis. Seperti halnya Melastoma, tanaman teh Camellia sinensis juga mengikat Al dari
rizosfer dengan mensekresikan oksalat Morita et al. 2008 dan dibawa ke daun melalui xilem oleh sitrat Morita et al. 2004.
Gambar 3. Model mekanisme toksisitas dan model toleransi Al. Ekslusi Al melibatkan pelepasan asam organik melalui kanal di membran. Aluminium di dalam
sitosol dikelat oleh asam organik dan dikurung di vakuola Kochian et al. 2005.
Sitrat diketahui sebagai asam organik yang paling kuat dalam mengikat Al. Al terikat dengan sitrat dengan perbandingan molekul 1:1, Al-oksalat 1:2, dan dengan
malat 1:3 Ma dan Hiradate 2000. Setiap spesies memiliki jenis asam organik yang disekresikan yang berbeda-beda. Tanaman yang meningkatkan sintesis dan sekresi sitrat
adalah seperti Casia tora Yang et al. 2004, Hordeum vulgare L Furukawa et al. 2004 dan Triticum aestivum Ryan et al. 2009.
Gen-Gen yang Ekspresinya Dipengaruhi Cekaman Al
Karakterisasi gen-gen yang ekspresinya diinduksi Al dilakukan dengan cara membuat pustaka cDNA tanaman yang dicekam oleh Al, kemudian dibandingkan
dengan pustaka cDNA tanaman yang tidak dicekam oleh Al Anwar 1999. Gen-gen yang diinduksi oleh cekaman Al telah diisolasi dari tanaman gandum dan Arabidopsis,
yaitu glutation-S-transferase GST, blue copper binding protein BCB, superoxide dismutase SOD, katalase dan reticuline oxygen oxidoreductase Snowden Gardner
1993; Richards et al. 1998. Ezaki et al. 1995 juga berhasil mengisolasi tiga gen dari tembakau yang ekspresinya diinduksi cekaman Al yaitu GST, peroksidase PER dan
GDP dissociation proteinase inhibitor DGI. Gen-gen yang diisolasi tersebut lebih banyak berkaitan dengan reduksi senyawa-senyawa radikal. Anwar 1999 telah
mengisolasi gen-gen yang diinduksi Al yang berkaitan dengan perkembangan sel atau sistem transport seperti protein histon H3, H
+
Karakterisasi mekanisme seluler di bawah cekaman Al saat ini dilakukan dalam skala besar yaitu dengan analisis transkriptomik dan proteomik. Analisis transkriptomik
terhadap Arabidopsis yang dicekam oleh Al selama 48 jam menunjukkan perubahan ekspresi gen-gen yang berkaitan dengan jalur stres oksidatif, dinding sel, dan
metabolisme polisakarida. Enzim-enzim yang terlibat dalam siklus Kreb tidak dipengaruhi oleh cekaman Al, kecuali malat dehidrogenase Kumari et al. 2008. You et
al. 2011 melaporkan bahwa cekaman Al pada kedelai selama 4 jam meningkatkan ekspresi 561 gen dan menurunkan ekspresi 78 gen. Hampir separuh gen-gen yang
responsif Al belum diketahui fungsinya. Gen-gen yang diketahui meningkat ekspresinya adalah faktor ekspresi, famili transporter MATE, STOP dan deposit lignin You et al.
2011. ATPase membran plasma, NADH-
dehidrogenase, dan auxin-induced protein.
Analisis proteomik terhadap kedelai yang toleran Al diketahui bahwa protein yang meningkat jumlahnya adalah heat shock protein, glutathione S-transferase,
chalcone-related synthetase, GTP-binding protein and ABC transporter ATP-binding protein Zhen et al. 2007. Beberapa protein yang berhubungan dengan ROS meningkat
dengan adanya Al yaitu superokside dismutase, dan mondehydroascorbate reductase yang berperan dalam sintesis asam askorbat. Selain itu, dua protein diasosiasikan
dengan sintesis prolin juga meningkat oleh paparan Al yaitu arginin tRNA ligase dan glutamate dehidrogenase Zhou et al. 2009. Duressa et al. 2010 juga melakukan
analisis proteomik terhadap genotipe kedelai sensitif dibandingkan dengan proteomik yang toleran Al. Setelah 72 jam diperlakukan dengan Al, protein-protein yang
meningkat konsentrasinya adalah
m alat
dehidrogenase, enolase, malat oksidoreduktase, dan piruvat dehidrogenase. Peningkatan protein-protein tersebut hanya terjadi pada
genotipe toleran saja.
Sintesis Sitrat di dalam Siklus Kreb
Asam sitrat dihasilkan dari siklus asam trikarboksilat TCA yang dikenal dengan Siklus Kreb atau siklus asam sitrat. Siklus ini merupakan pusat jalur metabolik
untuk semua proses aerobik dalam kehidupan organisme. Selama siklus TCA unit C2 asetil KoA yang merupakan derivat karbohidrat dan lipida diproses menjadi karbon
dioksida dan air. Dalam siklus ini dihasilkan senyawa antara, NADH dan FADH2 sebagai energi reduktif. Meskipun siklus TCA terjadi di mitokondria namun produk
antara diakumulasi di vakuola dan energi reduktif masuk ke rantai transport elektron untuk proses fosforilasi di bagian dalam membran mitokondria. Siklus TCA diawali
dengan pengubahan pirufat menjadi asetil KoA dengan melepaskan CO
2
Selama kondensasi oksaloasetat dengan asetil KoA, asetil dari kelompok asetil KoA ditambahkan ke mioti keto oksaloasetat. Sitril asetat adalah senyawa antara dalam
reaksi ini Gambar 5. Sitrat bukan hanya sebagai metabolit dalam siklus TCA saja, tetapi bisa juga berperan menjadi donor asetil oleh ATP-sitrat liase. ATP-sitrat liase
. Asetil KoA akan bereaksi dengan oksaloasetat yang berkarbon empat menjadi senyawa berkarbon
enam sitrat. Enzim yang berperan dalam reaksi ini adalah sitrat sintase Gambar 4 Taiz Zeiger 2002.
mengkatalisis sitrat dan KoA menjadi oksaloasetat dan asetil KoA Popova Carvalho 1998.
Gambar 4. Siklus asam trikarboksilat yang menghasilkan energi dan senyawa antara berupa asam organik Taiz Zeiger 2002.
Sitrat diubah menjadi senyawa antara akotinat menjadi isomernya yaitu isositrat dengan bantuan enzim acotinase yang mengeluarkan air dan memasukan kembali.
Isositrat kemudian kehilangan satu karbon diubah menjadi senyawa 5 karbon, oksoglutarat. Dalam reaksi tersebut ditambahkan NAD dan diubah menjadi NADH dan
dikatalisis dengan isositrat dehidrogenase. Oksoglutarat ini penting dalam asimilasi nitrogen Popova Carvalho 1998; Taiz Zeiger 2002.
Oksoglutarat akan diubah menjadi senyawa berkarbon empat, suksinil KoA oleh enzim oksoglutarat dehidrogenase. Produk lain yang dihasilkan adalah NADH. Pada
langkah berikutnya terjadi fosforilasi pada tingkat subtrat. Fosfat ditransfer ke GDP untuk membentuk GTP. Suksinil KoA sintetase akan mengubah suksinil menjadi
senyawa suksinat. Suksinat ini diubah menjadi fumarat dengan bantuan enzim suksinat dehidrogenase, dengan mentranfer dua hidrogen ke FADH2. Fumarat kemudian diubah
menjadi malat dengan bantuan enzim fumarase dengan menambahkan satu molekul air. Malat dehidrogenase mengubah malat menjadi oksaloasetat dengan menghasilkan
NADH Taiz Zeiger 2002.
Beberapa enzim yang berperan dalam siklus ini dilaporkan meningkat pada tanaman Citrus grandis dengan adanya perlakuan cekaman Al. Enzim-enzim tersebut
adalah NAD malat dehidrogenase, sitrat sintase, akotinase dan NAD-isositrat dehidrogenase Yang et al. 2012.
Gambar 5. Lintasan perubahan sintesis sitrat dan isositrat pada sel tanaman Popova Carvalho 1998.
Eksudasi Asam Organik
Asam organik dieksudasikan ke rizosfer dengan bantuan protein transporter. Sasaki et al. 2004 mengidentifikasi pertama kali transpoter malat yang diinduksi Al
yang disebut ALMT1. Kanal ALMT1 ini merupakan faktor kunci eksudasi malat pada akar tanaman gandum yang toleran. Penelitian sebelumnya menyebutkan bahwa
transporter malat diaktifkan oleh sebuah protein kinase yang berukuran 42 kDa Osawa Matsumoto 2001. Ekspresi berlebih gen ALMT1 ke tanaman tembakau dan barley
diketahui meningkatkan toleransi terhadap cekaman Al seiring meningkatnya eksudasi malat Sasaki et al. 2004; Delhaize et al. 2004.
Asam organik lain seperti sitrat juga mempunyai transporter sendiri yaitu multidrug and toxic compound extrusion MATE. Gen MATE ini berukuran 1668 pb
dan menyandikan 555 asam amino Furukawa et al 2007. Ekspresi berlebih MATE pada tanaman tembakau meningkatkan toleransi tanaman tembakau terhadap cekaman
Al Furukawa et al. 2007. Selain MATE, sitrat juga dieksudasikan melalui H
+
ATPase yang berkorelasi dengan efluk H
+
Ohno et al. 2003; Tomasi et al. 2009. Gen penyandi H
+
ATPase telah diisolasi dari Melastoma malabathricum. Gen tersebut berukuran 2871 pb yang menyandikan 956 asam amino. Pembungkaman terhadap ekspresi gen tersebut
menurunkan toleransi tanaman Melastoma terhadap cekaman Al Muzuni 2010. Mutasi H
+
Transporter lain yang juga berperan dalam eksudasi asam organik adalah transporter ABC yaitu transporter yang mengikat ATP selama mengalirkan larutan
organik maupun anorganik. Baik tanaman yang toleran maupun yang sensitif mempunyai transporter asam organik, namun yang membedakan antara keduanya
adalah terekspresi lebih tinggi atau lebih aktif pada tanaman toleran Kochian et al 2004. Salah satu famili gen transporter ABC adalah gen for sensitive Al rhizotoxic
STAR yang telah diketahui berperan dalam toleransi terhadap Al Huang et al. 2010. ATPase meningkatkan sekresi sitrat 20 kali lipat dibandingkan tipe liarnya Ohno et
al. 2003. Penghambatan transporter sitrat dengan anthracene-9-carboxylic acid sebuah
inhibitor kanal anion, menurunkan eksudasi sitrat Yang et al. 2006.
Gen Succinate Fumarate Carrier SFC menyandikan protein carrier yang tersusun dari 320 asam amino yang berperan untuk transport suksinat dan fumarat
keluar dari mitokondria. Aktivitas transporter suksinat ada di dalam sitosol Linka Weber 2010. Pada bakteri juga ditemukan transporter suksinat yang aktivitasnya
optimal pada pH 5,6 dan dihambat oleh monokarboksilat Terpe et al. 1999. Transporter oksalate juga sudah diisolasi dan dianalisis struktur tiga dimensi.
Transporter ini berukuran 44 KDa disandikan oleh OxT. Protein ini mempunyai 12 heliks dan 11 heliks diantaranya melintasi membran sel Hirai et al. 2002. Belum ada
penelitian yang menguji respon transporter-transporter tersebut terhadap cekaman Al. Eksudasi sitrat dan malat dari akar biasanya mempunyai pola yang sama. Jika
eksudasi malat meningkat maka sitrat juga akan meningkat atau sebaliknya. Pada tanaman gandum eksudasi baik sitrat maupun malat menurun seiring lamanya cekaman
Al, sebaliknya pada tanaman rye eksudasi kedua asam organik tersebut justru semakin meningkat Li et al. 2000. Penurunan kedua asam organik tersebut juga terjadi pada
Brassica napus Ligaba et al. 2004 dan dua spesies jeruk Yang et al. 2011 jika dicekam oleh Al.
Enzim Sitrat Sintase
Sintesis sitrat diyakini sebagai tahapan pertama dalam Siklus Kreb dengan mengkondensasi asetil KoA dengan oksaloasetat. Pada organisme eukariotik, enzim
sitrat sintase ditemukan terutama di dalam mitokondria dan peroksisom pada perkecambahan Beeckmans 1984. Sitrat sintase juga ditemukan di dalam peroksisom
non glioksomal di umbi kentang. Berbeda dengan organel glioksisom, organel non glioksisom tidak mengandung isositrat liase dan malat dihidrogenase Papke Gerhard
1996. Berat molekul sitrat sintase mitokondria lebih besar dibandingkan sitrat sintase glioksisom dan masing-masing terdiri dari dua subunit Beeckmans 1984. Saat ini telah
diketahui lima gen yang menyandi sitrat sintase pada Arabidosis thaliana. Dua dari gen tersebut ditargetkan ke dalam mitokondria, sedangkan tiga gen lainnya ditargetkan ke
peroksisom. Ketiga sitrat sintase tersebut berperan baik dalam respirasi asam lemak maupun pada saat perkecambahan Pracharoenwattana et al. 2005. Aktivitas sitrat
sintase terdeteksi di peroksisomal hipokotil mung bean dan mesokarp tanaman avokad. Aktivitas sitrat sintase peroksisom lebih rendah daripada enzim sitrat sintase
mitokondria Papke Gerhardt 1996. Sitrat sintase tersusun dari dua subunit protein yang masing-masing 20-alfa
heliks. Alfa heliks ini menyusun 75 struktur tiga dimensi, sedangkan selebihnya merupakan residu Gambar 6. Di antara dua subunit tersebut terdapat belahan yang
mengandung sisi aktif yang di satu sisi mengikat oksaloasetat dan sisi lain mengikat asetil koA PDB 2007. Pada tanaman, sitrat sintase pada tanaman berukuran 464-472
asam amino Deng et al. 2009, sedangkan pada bakteri lebih kecil yaitu sekitar 430 asam amino Donald et al. 1989. Tiga kunci asam amino di dalam sitrat sintase adalah
His274, His320 dan Asp375. His274 merupakan bagian lekukan dari interdomain dan berperan sebagai pengikat oksaloasetat. Sitrat sintase mempunyai dua struktur aktif
yaitu struktur tertutup dan terbuka. Struktur ini diatur oleh residu 274-277, dan mekanisme buka-tutup enzim ini dianalogikan dengan buka-tutup sebuah pintu
Roccatano et al. 2001.
Gambar 6. Struktur kuarterner sitrat sintase bakteri dalam kondisi tertutup kiri, dan kondisi terbuka kanan Protein Data Bank, 2007.
Biologi Agrobacterium
Agrobacterium adalah bakteri tanah yang termasuk ke dalam famili Rhizobiaceae. Bakteri ini bersifat pathogen bagi tanaman terutama tanaman dikotil dan
beberapa spesies Gymnosperm Srivastava 2002. Interaksi antara tanaman- Agrobaterium secara alami hanya terjadi di dalam Kelas Dikotil. Secara alami
monokotil bukan termasuk tanaman inang bagi Agrobacterium tetapi bagian meristem dapat diinfeksi bakteri ini Smith Hood 1995. Saat ini dikenal tiga biotipe yaitu
Agrobacterium tumefaciens yang menyebabkan crown gall, A. rubi yang menginfeksi Rubus idaeus dan A. rhizogenesis yang menginfeksi jaringan akar Otten et al. 2008.
Kemampuan Agrobacterium dalam menginduksi tumor adalah karena adanya peningkatan aktivitas sitokinin dan indol acetic acid IAA. Kedua hormon tersebut
diperuntukkan menghasilkan opin sebagai sumber makanan McMullen Binns 2006. Pada proses ini, DNA dari Agrobacterium tipe liar ditransfer ke nukleus. Ekspresi T-
DNA di dalam jaringan tanaman menyebabkan terbentuknya tumor. Gen-gen di dalam T-DNA terlibat dalam sintesis hormon pertumbuhan dan produksi opin yang merupakan
kondensasi antara asam amino dan gula Sheng Citovsky 1996 Ada tiga komponen genetik Agrobacterium yang diperlukan untuk transformasi
sel tanaman. Komponen pertama adalah T-DNA yang diperlukan untuk mentransfer gen dari sel bakteri ke dalam sel tanaman. T-DNA terdapat dalam Ti plasmid
Agrobacterium. Bagian ujung T-DNA dibatasi oleh pembatas atau border di sisi sebelah kiri dan kanan. Komponen kedua adalah daerah virulensi vir yang berukuran 35-Kpb
yang mengandung tujuh lokus mayor yaitu virA, virB, virC, virD, virE, virG dan virH. Komponen ketiga adalah gen virulen kromosomal vk yang terletak di kromosom
bakteri Sheng Citovsky 1996.
Kemampuan Agrobacterium menginfeksi sel inang berkaitan dengan plasmid yang berukuran besar sebagai penginduksi tumor atau tumor-inducing Ti atau
penginduksi akar atau rhizogenic inducting Ri. T-DNA dan daerah virulensi vir terdapat di tumor-inducing plasmid pTi Gambar 7. Selain di plasmid T-DNA juga
bisa terdapat di dalam kromosom dengan cara rekombinasi dengan bantuan protein VirD2 Gelvin 2008. Ukuran plasmis Ti berkisar 200-800 Kpb dan daerah T kurang
dari 10 dari Ti Gelvin 2003. Ekspresi gen vir diinduksi oleh eksudat yang dikeluarkan dari luka tanaman. Eksudat tersebut berupa senyawa fenolik seperti
asetosiringon yang diperkuat komponen gula dan pH Zupan et al 2003. Di samping gen-gen vir yang ada di plasmid, beberapa gen virulensi di
kromosom juga diperlukan untuk menginfeksi se-sel inang. Gen-gen virulensi tersebut adalah chv A, chvB, chvD, chvE, chvG, chvH, dan chvI, serta gen-gen yang
mempengaruhi virulensi di kromosom yaitu acvB dan pgmexoC, glgP, mia dan ros. Urutan DNA virulensi di dalam kromosom dan plasmid Ti identik Suzuki et al. 2001.
Gambar 7. Peta plasmid Ti yang terdiri dari T-DNA, daerah virulensi, katabolisme opin dan daerah origin of replication Hooykas Beijersbergen 1994.
McCullen dan Binns 2006 membagi tahapan masuknya T-DNA ke dalam tanaman menjadi 7 tahap yaitu : 1 pengenalan senyawa kimia tanaman inang dan
pengaktifan ekspresi gen virulensi, 2 pengenalan fisik dan interaksi antara bakteri dan inang, 3 produksi subtrat yang ditransfer dan transfer mesin 4 transfer subtrat dari
bakteri ke dalam sel inang, 5 pergerakan subtrat ke dalam nukleus, 6 integrasi T-DNA ke dalam genom inang dan 7 ekspresi T-DNA di dalam sel inang. Sebagian proses
tersebut diilutrasikan pada Gambar 8.
Ada dua proses yang saling independen dalam proses pengenalan ini yaitu aktifasi gen virulen dan pengikatan sel inang McMullen Binns 2006. Pengenalan
terhadap sel inang melalui senyawa kimia yang dikeluarkan sel-sel inang yang terluka. Senyawa kimia ini akan dikenali oleh komplek reseptor VirAVirG yang ada di
membrane plasma Agrobacterium. Senyawa opin dikenali oleh gen virA, yang kemudian akan ditransduksikan melalui VirG untuk mengaktifkan salinan gen yang
akan ditranfer ke sel inang. Mekanisme ini merupakan karakteristik bakteri konjugatif Zupan et al. 1996. Bakteri mengikat permukaan sel dan diikuti dengan sintesis filamen
selulosa untuk memperkuat pengikatan Zupan et al. 1996. Gen virA dan virG mempunyai homologi dengan gen yang menyandikan dua
sensor kinase untuk menerima respon dan melanjutkannya dalam status fosforilisasi. VirG dalam kondisi tidak aktif menempel pada protein VirA sebagai penerima signal.
Jika terdapat signal berupa opin, gula, PO
4
Bersama dengan aktivasi gen vir, Agrobacterium melekatkan diri di sel inang. Terdapat dua tipe pelekatan Agrobacterium ke sel inang yaitu: pelekaran nonspesifik
dan spesifik. Pelekatan nonspesifik dapat diketahui dengan cara pencucian menggunakan bufer garam. Jumlah bakteri yang melekat di satu sel inang berkisar 200-
1000 bakteri. Pelekatan spesifik terjadi dengan terbentuknya T-pilus yang tersusun dari β1-2 glukan. Gen-gen di kromosom chvA, chvB dan pscA exoC McMullen Binns
2006, serta virB di Ti plasmid Judd et al. 2005 terlibat dalam pembentuk sintesis dan lokalisasi pilus.
dan pH rendah opin maka VirG menjadi bentuk yang terfosforilisasi dan terlepas dari VirA. Pemberian opin termasuk
didalamnya oktopin, nopalin, leucinopin, dan sucinamopin meningkatkan induksi 2-10 kali. Asetosiringon dapat mengaktifkan gen virA dan virG Veluthambi et al. 1989.
Asetosiringon dan ADP-glucosa meningkatkan efesiensi transformasi pada embrio muda tanaman gandum Cheng et al. 1997. VirG akan mengaktifkan operon gen vir
yang berperan mengatur transport T-DNA ke dalam genom tanaman Zupan et al. 2000.
T-DNA dibatasi oleh 25 pb sekuen yang dikenal dengan batas kanan right border dan batas kiri left border Zambryski et al. 1982. Protein komplek
VirD1VirD2 berfungsi mengenali dan memotong bagian T-DNA di bagian batas kanan sehingga terlepas menjadi utas tunggal dan setelah mencapai batas kiri maka utas
tunggal T-DNA terpotong dari plasmid Ti. Utas tunggal T-DNA tersebut diselimuti
dengan VirE2 untuk menghindari pemotongan nuklease Citovsky et al. 1989. VirD1 kemudian dilepaskan dari potongan utas tunggal T-DNA dan virD2 tetap melekat di
utas tunggal T-DNA Zupan et al. 2000.
Gambar 8. Mekanisme infeksi dan introduksi T-DNA dari Agrobacterium ke dalam sel tanaman McCullen dan Binns 2006.
T-DNA ditransfer ke sel inang melalui protein kanal yang disandikan oleh gen virB dan virD4 Christie Vogel 2000. Protein VirD2 tetap berikatan dengan T-DNA
dan menjadi faktor penting dalam membawa T-DNA. Mutasi di daerah terminal C VirD menyebabkan kegagalan transfer van Kregten et al. 2009 Integrasi T-DNA ke dalam
kromosom inang diilustrasikan seperti pada Gambar 9 Tzfira et al. 2004.
Peran Agrobacterium dalam Rekayasa Genetik
Selama dua dasa warsa telah banyak laporan mengenai keberhasilan transformasi genetik yang dimediasi oleh Agrobacterium di berbagai spesies dan
kultivar. Beberapa publikasi menunjukkan bahwa transformasi dapat terjadi ke target non tanaman seperti bakteri hingga khamir dan dari fungi hingga manusia Tzifira
Citovsky 2006. Pemanfaatan Agrobacterium dalam introduksi DNA ke dalam tanaman
target memiliki keunggulan dibandingkan dengan metode lain yaitu lebih ekonomis dan jumlah kopi transgen yang terintegrasi adalah rendah Paz et al. 2004.
Gambar 9. Model integrasi T-DNA ke dalam kromosom inang. a Utas T dapat mengalami degradasi pada 30 basa terakhir dari left border yang tidak
dilindungi. b Di nukleus utas T dikonversi menjadi utas ganda T-DNA yang dapat diproses melalui dua jalur. Jalur pertama terjadi dikebanyakan
tanaman, di mana integrasi terjadi dengan rekombinasi non-homolog. c VirD digantikan dengan AtKU70-AtKU80 heterodimer pada ujung T-DNA,
untuk memasang DNA-dependent protein kinase. d, e. Dalam waktu bersamaan, DNA yang tidak dikemas juga mengikat AtKU70-AtKU80-
DNA-PK. f Inisiasi perbaikan potongan utas ganda PUG. f komplek XRCC4-AtLIG4 memediasi integrasi T-DNA ke sisi PUG. h beberapa
utas ganda T-DNA dapat bergabung dengan AtKU70-AtKU80-DNA-PK dan XRCC4-AtLIG4. i,g integrasi menjadi PUG. j ujung DNA dikenali
oleh Rad52, dengan atau tanpa penggantian VirD2, k dan diproses oleh komplek Rad52Rad50-Mre11 meninggalkan ujung 50 basa overhang.
Rad51, atau l,m AtRAD5 dipolimerisasi pada overhang utas tunggal DNA baik di T-DNA intermediet l maupun di target DNA. Filament
nukleoprotein pada ujung dari integrasi utas ganda DNA mencari mikrohomologi ke PUG di genom n dan mengikat daerah tersebut o
sehingga terjadi ligasi ke PUG Tzfira et al. 2004.
Infeksi Agrobacterium dipengaruhi beberapa faktor yaitu mulai pengenalan terhadap inang hingga integrasi gen target ke dalam genom inang Zupan et al. 2000.
Cahaya mempengaruhi kemampuan Agrobacterium dalam menginfeksi sel inang. Dalam kondisi ada cahaya kemampuan bakteri tersebut menginfeksi tanaman berkurang
dikarenakan penurunan jumlah flagela. Penurunan pembentukan flagela disebabkan adanya penghambatan operon flaABC oleh cahaya sehingga kemampuan pembentuk
flagelin menurun Oberpichler et al. 2008. Agrobacterium mampu tumbuh optimum baik di kondisi pH netral, asam dan sedikit basa. Patogenitas bakteri tersebut meningkat
pada kondisi asam Li et al. 2003. Untuk keperluan uji ekspresi, gen target harus disisipkan di T-DNA di antara
promoter dan terminator. Selain gen target, T-DNA juga harus mengandung gen untuk menyeleksi sel-sel transgenik dari sel-sel non transgenik. Gen penyeleksi tersebut dapat
berupa gen resistensi terhadap antibiotik Chee et al. 1989, atau gen resistensi terhadap herbisida Fang et al. 2004. Sebagai gen pelapor ekspresi dapat digunakan gen
β glucuronidase GUS Batra Kumar 2003 atau green fluorescent protein GFP
Yancheva et al. 2006. Beberapa peneliti telah melakukan introduksi gen untuk meningkatkan toleransi
tanaman terhadap cekaman Al dengan bantuan Agrobacterium. Ezaki et al. 2000 mengintroduksikan beberapa gen glutation S-transferase, peroksidase, inhibitor
disosiasion GDP dan blue copper -binding protein dengan bantuan A. tumefaciens LB 4404. Beberapa galur trangenik dilaporkan mampu mengurangi stres Al dan beberapa
logam berat. Ekspresi gen super oxyde dismutase MnSOD mitokondria dari Triticum aestivum di dalam Brassica napus mampu meningkatkan toleransi tanaman tersebut
terhadap cekaman Al. Enzim ini berperan mengontrol konsentrasi
1
O
2
dan H
2
O
2
Ekspresi gen yang berkaitan dengan asam organik dan sekresinya mampu meningkatkan toleransi tanaman terhadap aluminium. Introduksi gen ALMT, suatu
transporter malat yang difasilitasi oleh Agrobacterium juga berhasil mendapatkan galur tanaman sorgum transgenik. Sekresi malat dari akar transgen tersebut meningkat
beberapa kali lipat yang sekaligus meningkatnya toleransinya terhadap cekaman Al Delhaize et al. 2004. Ekspresi gen multidrug and toxic compound MATE di dalam
di dalam sel yang meningkat akibat cekaman abiotik Basu et al. 2001.
tanaman sorgum meningkatkan sekresi sitrat dari akar. Ini membuktikan bahwa MATE merupakan transporter sitrat dan berperan dalam toleransi Al Malgahaes et al. 2007.
BAB III RESPON FISIOLOGI
Kategori