2.6 Pemilihan Enzim Restriksi
Berbagai jenis enzim restriksi telah berhasil diidentifikasi dari organisme prokariot dan beberapa diantaranya telah dimanfaatkan dalam penelitian biologi
molekuler. Setiap enzim restriksi memiliki karakterisitk tersendiri, sehingga dalam pemanfaatannya perlu diperhatikan berapa kriteria pemilihan enzim
restriksi. Menurut Gerstein 2001, beberapa kriteria yang perlu dipertimbangkan dalam pemilihan enzim retriksi adalah titik pemotongan yang dikehendaki pada
DNA, star activity, sensitivitas terhadap metilasi, dan kemampuan enzim restriksi memotong jenis sampel DNA yang digunakan.
Titik pemotongan yang dikehendaki pada DNA merupakan pertimbangan utama dalam pemilihan enzim restriksi karena setiap enzim restriksi memiliki
situs restriksi yang spesifik. Jumlah situs restriksi pada sampel DNA juga perlu dipertimbangkan karena situs restriksi yang terlalu banyak dapat menyebaban
proses restriksi berlangsung lebih lama dan terjadi partial digestion Gerstein, 2001. Berdasarkan titik pemotongan yang dikehendaki, maka ukuran fragmen
yang dihasilkan juga harus diperhatikan. Ukuran fragmen yang dihasilkan akan menjadi pertimbangan dalam pemilihan metode yang digunakan pada analisis
fragmen restriksi. Umumnya, metode analisis fragmen yang digunakan adalah elektroforesis. Pada elektroforesis, konsentrasi dan jenis gel yang digunakan
sangat menentukan resolusi pemisahan DNA untuk analisis fragmen restriksi Brown, 2016.
Star activity merupakan kemampuan enzim restriksi untuk dapat memotong urutan DNA yang mirip dengan situs restriksinya pada kondisi tertentu kondisi
reaksi tidak optimal. Star activity dapat disebabkan oleh pH buffer yang tinggi, waktu inkubasi yang lama, konsentrasi enzim yang tinggi, konentrasi gliserol
yang tinggi, dan adanya pelarut organik. Pada enzim EcoRI pada kondisi pH buffer yang tinggi diketahui dapat memotong pada urutan N
▼
AATTC, walaupun situs restriksinya pada kondisi spesifik adalah G
▼
AATTC Gerstein, 2001. Menurut Wei et al. 2008, star activity diinyatakan dengan nilai fidelity index
FI yaitu rasio jumlah tertinggi enzim yang tidak menimbulkan star activity terhadap jumlah minimum enzim yang diperlukan untuk mendigesti DNA secara
keseluruhan complete digestion. Semakin tinggi nilai FI suatu enzim, maka potensi adanya star activity akan semakin besar. Untuk mencgeah terjadinya star
activity, maka kondisi kondisi reaksi restriksi harus diatur dengan buffer yang sesuai agar tercapai kondisi optimal.
2.7 PCR
