Aktivitas Kemopreventif Ekstrak Temu Ireng (Curcuma Aeruginosa Roxb) Terhadap Sel Makrofag, Ifn-Γ Dan Tnf-Α Tikus Putih Yang Diinduksi 7,12-Dimetilbenz[Α]Antrasena

1

AKTIVITAS KEMOPREVENTIF EKSTRAK TEMU IRENG
(Curcuma aeruginosa Roxb) TERHADAP SEL MAKROFAG,
IFN-γ DAN TNF-α TIKUS PUTIH YANG DIINDUKSI
7,12-DIMETILBENZ[α]ANTRASENA

MUJIBUR RAHMAN

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

2

3

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Aktivitas Kemopreventif

Ekstrak Temu Ireng (Curcuma aeruginosa Roxb) terhadap sel Makrofag, IFN-γ
dan TNF-α Tikus Putih yang Diinduksi 7,12-dimetilbenz[α]antrasena” adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterb itkan maupun tidak diterbitkan dari
punulis lain, telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka
di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor dan BPPT.
Bogor, Februari 2016
Mujibur Rahman
G851140131

4

RINGKASAN
MUJIBUR RAHMAN. Aktivitas Kemopreventif Ekstrak Temu Ireng (Curcuma
aeruginosa Roxb) terhadap Sel Makrofag, IFN-γ dan TNF-α Tikus Putih yang
Diinduksi 7,12-dimetilbenz[α]antrasena. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan
KURNIA AGUSTINI.

Kanker adalah penyakit multifaktorial yang timbul dari tidak seimbangnya
proto-onkogen, onkogen, tumor supresor, regulator apoptosis, dan gen perbaikan
DNA. Kanker merupakan penyebab kematian nomor dua setelah penyakit
kardiovaskuler diantara penyakit tidak menular. Di Indonesia, prevalensi
penderita kanker tahun 2014 sebesar 1.4%. Metode pengobatan kanker modern
cenderung memberikan efek samping. Pendekatan yang dapat dilakukan adalah
dengan menggunakan tanaman obat sebagai agen kemopreventif. Sel makrofag
adalah bagian dari sistem imun non-spesifik, sel ini bekerja sama dengan sitokin
IFN-γ dan TNF-α dalam mempertahankan tubuh terhadap agen karsinogen 7,12dimetilbenz[α]antrasena (DMBA). Penelitian terdahulu menyatakan bahwa
ekstrak temu ireng mampu menghambat pertumbuhan tumor dan meningkatkan
aktivitas makrofag secara kuratif dan adjuvan. Penelitian ini dilakukan untuk
mengetahui aktivitas kemopreventif temu ireng terhadap sel makrofag, IFN-γ dan
TNF-α tikus putih yang diinduksi DMBA.
Rancangan penelitian menggunakan rancangan acak lengkap (RAL)
dengan satuan percobaan homogen. Sebanyak 60 ekor tikus dibagi ke dalam 6
kelompok, yaitu kontrol Normal, kontrol (+) Meniran, kontrol (-) DMBA dan
Perlakuan Temu Treng (PTI); PTI-1 (dosis 40mg/200gBB), PTI-2 (dosis
80mg/200gBB), PTI-3 (dosis 160mg/200g BB). Penelitian dimulai dengan
memberikan perlakuan ekstrak selama seminggu (preventif), lalu dilanjutkan
dengan induksi DMBA selama 2 minggu. Pada minggu kelima hingga minggu

kedua puluh tikus diberikan perlakuan berdasarkan kelompoknya. Analisis
terhadap kadar IFN-γ dan TNF-α dilakukan terhadap plasma darah tikus pada
waktu T0 (sebelum perlakuan), T1 (seminggu setelah perlakuan), T2 (seminggu
setelah pemberian DMBA) dan T3 (akhir penelitian). Sedangkan analisis terhadap
NO dilakukan pada T2 dan T3.
Analisis terhadap kadar NO pada T2 menunjukkan bahwa, konsentrasi NO
tertinggi dihasilkan PTI-2 sebesar 2.867±0.04 ppm, angka tersebut signifikan
tinggi terhadap Normal. Sedangkan pada T5, NO tertinggi ditunjukkan oleh PTI-3
yaitu sebesar 2.744±0.953 ppm. Analisis terhadap level IFN-γ dan TNF-α
dilakukan dengan prinsip immunoassay. Secara umum level IFN-γ mengalami
peningkatan pada waktu T1, yaitu PTI-1 75.93±8.31 pg/mL, PTI-2 85.39±3.04
pg/mL dan PTI-3 62.67±15.3 pg/mL. Namun secara statistik angka tersebut tidak
berbeda nyata dengan kelompok kontrol. Sedangkan level TNF-α signifikan naik
pada waktu T2 yaitu PTI-1 96.17±2.17 pg/mL, PTI-2 136±1.61 pg/mL dan PTI-3
114.33±2.03 pg/mL. Level TNF-α semua kelompok PTI signifikan tinggi terhadap
kontrol Normal. Berdasarkan data tersebut, dapat dilihat bahwa dosis terbaik
sebagai agen preventif adalah PTI-2 (80mg/200g BB). Hal ini sejalan dengan
angka insidensi pada kelompok ini, yaitu sebesar 50%. Kejadian ini didukung
oleh interaksi antara TNF-α, IFN-γ dan NO pada PTI-2 yang mampu menekan
karsinogensis pada tikus yang diinduksi DMBA.

Kata kunci: Temu ireng, kanker, sel makrofag, nitrit oksida, IFN-γ, TNF-α

5

SUMMARY
MUJIBUR RAHMAN. Chemopreventive activity of Temu Ireng (Curcuma
aeruginosa Roxb) Extracts toward Macrophage Cells, IFN-γ and TNF-α in 7,12dimetilbenz[α]antracene- induced White Rats. Supervised by I MADE ARTIKA
and KURNIA AGUSTINI
Cancer is a multifactorial disease caused by imbalance expression of the
oncogene, proto-oncogen, tumor suppresor, apoptosis regulator and DNA repair
genes. Cancer is the second leading cause of death in the world after
cardiovascular diseases among non-contagious disease. In Indonesia, prevalency
of cancer in 2014 is 1.4%. Modern cancer theurapy such as surgery, irradiation,
chemoterapy has negative effects. The alternative approach is by using herb
medicinal as chemopreventive agent. Macrophage cells are cellular immunity that
work together with cytokine IFN-γ and TNF-α as protector of the host against
carsinogen agent (DMBA). Previous study showed that, ethanolic extract of temu
ireng was able to inhibit cancer development and increase the activity of
macrophages by producing nitric oxide (NO). This research was conducted to
assess the chemopreventive acitivity of temu ireng extracts toward macrophage

cells, IFN-γ and TNF-α in 7,12-dimetilbenz[α]antracene- induced white rats.
The research design was a completely randomized design (CRD) with
homogeneous experimental unit. Sixty rats were divided into six groups, each
group consisted of ten mice. Treatment consisted of Normal control, positive
control (+) Meniran, negative control (-) DMBA (20mg/Kg BW) and Temu Ireng
extracts i.e: PTI-1 (40mg/200g BW), PTI-2 (80mg/200g BW) and PTI-3
(160mg/200g BW). Extracts dissolved in CMC-Na 0.5% was administered daily
by the oral route one week before and after DMBA induction. Chemopreventive
activity was observed by measuring the level of IFN-γ and TNF-α plasma before
treatments (T0), one week after extracts administered (T1), one week after last
DMBA induction (T2) and at the end of research or week 20 th (T3). The NO level
was measured at T2 and T3.
Result showed that NO level of PTI-2 (2.867±0.04 ppm) increased significantly
at T2 compared to control groups. At T3 the NO level of PTI-1 and PTI-2 was not
significantly different from Normal. The highest level of NO at this time showed by PTI3 (2.744±0.953 ppm). The IFN-γ and TNF-α was measured with immunoassay.

Generally, the level of IFN-γ increased at week one (T1), PTI-1 (75.93±8.31
pg/mL), PTI-2 (85.39±3.04 pg/mL) and PTI-3 (62.67±15.3 pg/mL). However,
these values were no different from that of control groups. The level of TNF-α of
all PTI groups increased significantly at T2. PTI-2 has the highest level (136±1.61

pg/mL) followed by PTI-3 (114.33±2.03 pg/mL) and PTI-1 (96.17±2.17 pg/mL).
According to these results, the effective dose as preventive agent was PTI-2
(80mg/200g BW). This was in accordance with cancer incidency on this groups
which is the lowest among treatments. All cytokines level decreased at T3, which
meant that the non-specific immune was not effective at the time. Overall,
treatments with temu ireng extracts increases the acitivity of macrophage cells,
level of IFN-γ and TNF-α of white rats when induction using 7,12dimetilbez[α]antracene was given to prevent cancer.
Keywords: Temu ireng, cancer, macrophage cells, nitric oxide, IFN-γ, TNF-α

6

© Hak Cipta Milik IPB dan BPPT, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB dan BPPT.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB dan BPPT.

7

AKTIVITAS KEMOPREVENTIF EKSTRAK TEMU IRENG
(Curcuma aeruginosa Roxb) TERHADAP SEL MAKROFAG,
IFN-γ DAN TNF-α TIKUS PUTIH YANG DIINDUKSI
7,12-DIMETILBENZ[α]ANTRASENA

MUJIBUR RAHMAN

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
Pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

8

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS

9

Judul

Nama
NIM

: Aktivitas Kemopreventif Ekstrak Temu Ireng (Curcuma aeruginosa
Roxb) terhadap Sel Makrofag, IFN-γ dan TNF-α Tikus Putih yang
Diinduksi 7,12-dimetilbenz[α]antrasena
: Mujibur Rahman
: G851140131

Disetujui Oleh
Komisi Pembimbing

Dr Kurnia Agustini, MSi, Apt
Anggota

Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua

Diketahui Oleh

Ketua Program Studi
Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr drh Maria Bintang, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 5 Februari 2016

Tanggal Lulus:

10

PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim

Alhamdulillah, Segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadiran Allah
SWT atas segala limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat
menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis ini. Penelitian ini berjudul Aktivitas
Kemopreventif Ekstrak Temu Ireng (Curcuma aeruginosa Roxb) terhadap sel
Makrofag, IFN-γ dan TNF-α Tikus Putih yang Diinduksi 7,12-dimetilbenz[α]antrasena. Penelitian ini berlangsung selama 7 bulan dari bulan Mei hingga
November tahun 2015 di Laboratorium Pengembangan Teknologi Industri Agro
dan Biomedika (LAPTIAB) Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT),
Kawasan Puspitek Serpong
Penulis menyadari bahwa penelitian dan penulisan tesis ini dapat
diselesaikan atas izin yang Maha Kuasa dengan perantara bantuan dan dorongan
semangat dari berbagai pihak. Untuk itu, penulis ucapkan terutama kepada Bapak
Dr Ir I Made Artika, MAppSc dan Ibu Dr Kurnia Agustini, MSiApt sebagai
pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan, bantuan, kritik, saran dan

masukan selama penulisan tesis ini. Selanjutnya terima kasih juga penulis
sampaikan kepada Dr Churiyah, Dr Sriningsih MSi, Asri Sulfianti MBiomed,
Nuralih SSi, Joelham, Dea Kurniadi, Kara, Nur Hasanah, Soufa Malita yang
selalu membantu dalam penelitian ini baik itu berupa teknis dan analisis. Ucapan
terima kasih juga penulis sampaikan kepada tim peneliti Laboratorium
Pengembangan Teknologi Industri Agro dan Biomedika (LAPTIAB) BPPT yang
tidak dapat penulis sebutkan semuanya.
Akhir kata, Semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua pihak
yang memerlukan khususnya untuk kemajuan ilmu pengetahuan di bidang ilmu
biokimia dan imunologi kanker.
Bogor, Februari 2016
Mujibur Rahman

11

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
1. PENDAHULUAN.
Rumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Ruang Lingkup
Manfaat Penelitian
2. METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Alat dan Bahan
Rancangan Penelitian
Penyiapan Hewan Coba
Perlakuan Hewan Coba
Penyiapan Ekstrak Temu ireng
Penyiapan larutan stok DMBA
Induksi Karsinogenesis dengan DMBA
Pengambilan Darah.
Isolasi Makrofag Peritoneal
Pengukuran Kadar NO (Nitric Oxide)
Pengukuran IFN-γ & TNF-α (Thermo SCIENTIFIC)
Analisis Data
3. HASIL
Insidensi Tumor
Hasil Analisis Sekresi NO (Nitric Oxide)
Hasil Analisis Kadar IFN-γ
Hasil Analisis Kadar TNF-α
4. PEMBAHASAN
Insidensi Tumor
Nitrit Oksida (NO)
Nitrit Oksida (NO) dan Tumor
Interferon-γ (IFN-γ)
Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α)\
Hubungan IFN-γ, Produksi Nitric Oxide (NO) dan Tumor
Hubungan TNF-α, Produksi Nitric Oxide (NO) dan Tumor
Hubungan antara IFN-γ, TNF-α, Produksi NO Makrofag dan Tumor
5. KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA

vi
vi
1
2
2
3
3
3
3
3
4
4
4
5
5
5
5
5
6
6
6
7
7
7
9
10
12
12
12
14
15
16
18
19
20
21
21
21
22

12

DAFTAR TABEL
Halaman
1.
2.
3.
4.
5.

7
7
8
9
10

Angka insidensi pada berbagai kelompok perlakuan
Kadar NO makrofag peritoneum tikus pada T2
Kadar NO makrofag peritoneum tikus pada T3
Level IFN-γ (pg/mL) pada berbagai perlakuan terhadap waktu (T)
Level TNF-α (pg/mL) pada berbagai perlakuan terhadap waktu (T)
DAFTAR GAMBAR

Halaman
1.
2.
3.
4.
5.

Perbandingan sekresi NO makrofag terhadap waktu
Pengaruh antar perlakuan terhadap IFN-γ pada berbagai waktu
Pengaruh waktu terhadap level IFN-γ pada setiap kelompok perlakuan
Pengaruh antar perlakuan terhadap TNF-α pada berbagai waktu
Pengaruh waktu terhadap level TNF-α pada setiap kelompok perlakuan

8
9
10
11
11

1

AKTIVITAS KEMOPREVENTIF EKSTRAK TEMU IRENG
(Curcuma aeruginosa Roxb) TERHADAP SEL MAKROFAG,
IFN-γ DAN TNF-α TIKUS PUTIH YANG DIINDUKSI
7,12-DIMETILBENZ[α]ANTRASENA

MUJIBUR RAHMAN

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

2

3

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER
INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul “Aktivitas Kemopreventif
Ekstrak Temu Ireng (Curcuma aeruginosa Roxb) terhadap sel Makrofag, IFN-γ
dan TNF-α Tikus Putih yang Diinduksi 7,12-dimetilbenz[α]antrasena” adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterb itkan maupun tidak diterbitkan dari
punulis lain, telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka
di bagian akhir tesis ini.
Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada Institut
Pertanian Bogor dan BPPT.
Bogor, Februari 2016
Mujibur Rahman
G851140131

4

RINGKASAN
MUJIBUR RAHMAN. Aktivitas Kemopreventif Ekstrak Temu Ireng (Curcuma
aeruginosa Roxb) terhadap Sel Makrofag, IFN-γ dan TNF-α Tikus Putih yang
Diinduksi 7,12-dimetilbenz[α]antrasena. Dibimbing oleh I MADE ARTIKA dan
KURNIA AGUSTINI.
Kanker adalah penyakit multifaktorial yang timbul dari tidak seimbangnya
proto-onkogen, onkogen, tumor supresor, regulator apoptosis, dan gen perbaikan
DNA. Kanker merupakan penyebab kematian nomor dua setelah penyakit
kardiovaskuler diantara penyakit tidak menular. Di Indonesia, prevalensi
penderita kanker tahun 2014 sebesar 1.4%. Metode pengobatan kanker modern
cenderung memberikan efek samping. Pendekatan yang dapat dilakukan adalah
dengan menggunakan tanaman obat sebagai agen kemopreventif. Sel makrofag
adalah bagian dari sistem imun non-spesifik, sel ini bekerja sama dengan sitokin
IFN-γ dan TNF-α dalam mempertahankan tubuh terhadap agen karsinogen 7,12dimetilbenz[α]antrasena (DMBA). Penelitian terdahulu menyatakan bahwa
ekstrak temu ireng mampu menghambat pertumbuhan tumor dan meningkatkan
aktivitas makrofag secara kuratif dan adjuvan. Penelitian ini dilakukan untuk
mengetahui aktivitas kemopreventif temu ireng terhadap sel makrofag, IFN-γ dan
TNF-α tikus putih yang diinduksi DMBA.
Rancangan penelitian menggunakan rancangan acak lengkap (RAL)
dengan satuan percobaan homogen. Sebanyak 60 ekor tikus dibagi ke dalam 6
kelompok, yaitu kontrol Normal, kontrol (+) Meniran, kontrol (-) DMBA dan
Perlakuan Temu Treng (PTI); PTI-1 (dosis 40mg/200gBB), PTI-2 (dosis
80mg/200gBB), PTI-3 (dosis 160mg/200g BB). Penelitian dimulai dengan
memberikan perlakuan ekstrak selama seminggu (preventif), lalu dilanjutkan
dengan induksi DMBA selama 2 minggu. Pada minggu kelima hingga minggu
kedua puluh tikus diberikan perlakuan berdasarkan kelompoknya. Analisis
terhadap kadar IFN-γ dan TNF-α dilakukan terhadap plasma darah tikus pada
waktu T0 (sebelum perlakuan), T1 (seminggu setelah perlakuan), T2 (seminggu
setelah pemberian DMBA) dan T3 (akhir penelitian). Sedangkan analisis terhadap
NO dilakukan pada T2 dan T3.
Analisis terhadap kadar NO pada T2 menunjukkan bahwa, konsentrasi NO
tertinggi dihasilkan PTI-2 sebesar 2.867±0.04 ppm, angka tersebut signifikan
tinggi terhadap Normal. Sedangkan pada T5, NO tertinggi ditunjukkan oleh PTI-3
yaitu sebesar 2.744±0.953 ppm. Analisis terhadap level IFN-γ dan TNF-α
dilakukan dengan prinsip immunoassay. Secara umum level IFN-γ mengalami
peningkatan pada waktu T1, yaitu PTI-1 75.93±8.31 pg/mL, PTI-2 85.39±3.04
pg/mL dan PTI-3 62.67±15.3 pg/mL. Namun secara statistik angka tersebut tidak
berbeda nyata dengan kelompok kontrol. Sedangkan level TNF-α signifikan naik
pada waktu T2 yaitu PTI-1 96.17±2.17 pg/mL, PTI-2 136±1.61 pg/mL dan PTI-3
114.33±2.03 pg/mL. Level TNF-α semua kelompok PTI signifikan tinggi terhadap
kontrol Normal. Berdasarkan data tersebut, dapat dilihat bahwa dosis terbaik
sebagai agen preventif adalah PTI-2 (80mg/200g BB). Hal ini sejalan dengan
angka insidensi pada kelompok ini, yaitu sebesar 50%. Kejadian ini didukung
oleh interaksi antara TNF-α, IFN-γ dan NO pada PTI-2 yang mampu menekan
karsinogensis pada tikus yang diinduksi DMBA.
Kata kunci: Temu ireng, kanker, sel makrofag, nitrit oksida, IFN-γ, TNF-α

5

SUMMARY
MUJIBUR RAHMAN. Chemopreventive activity of Temu Ireng (Curcuma
aeruginosa Roxb) Extracts toward Macrophage Cells, IFN-γ and TNF-α in 7,12dimetilbenz[α]antracene- induced White Rats. Supervised by I MADE ARTIKA
and KURNIA AGUSTINI
Cancer is a multifactorial disease caused by imbalance expression of the
oncogene, proto-oncogen, tumor suppresor, apoptosis regulator and DNA repair
genes. Cancer is the second leading cause of death in the world after
cardiovascular diseases among non-contagious disease. In Indonesia, prevalency
of cancer in 2014 is 1.4%. Modern cancer theurapy such as surgery, irradiation,
chemoterapy has negative effects. The alternative approach is by using herb
medicinal as chemopreventive agent. Macrophage cells are cellular immunity that
work together with cytokine IFN-γ and TNF-α as protector of the host against
carsinogen agent (DMBA). Previous study showed that, ethanolic extract of temu
ireng was able to inhibit cancer development and increase the activity of
macrophages by producing nitric oxide (NO). This research was conducted to
assess the chemopreventive acitivity of temu ireng extracts toward macrophage
cells, IFN-γ and TNF-α in 7,12-dimetilbenz[α]antracene- induced white rats.
The research design was a completely randomized design (CRD) with
homogeneous experimental unit. Sixty rats were divided into six groups, each
group consisted of ten mice. Treatment consisted of Normal control, positive
control (+) Meniran, negative control (-) DMBA (20mg/Kg BW) and Temu Ireng
extracts i.e: PTI-1 (40mg/200g BW), PTI-2 (80mg/200g BW) and PTI-3
(160mg/200g BW). Extracts dissolved in CMC-Na 0.5% was administered daily
by the oral route one week before and after DMBA induction. Chemopreventive
activity was observed by measuring the level of IFN-γ and TNF-α plasma before
treatments (T0), one week after extracts administered (T1), one week after last
DMBA induction (T2) and at the end of research or week 20 th (T3). The NO level
was measured at T2 and T3.
Result showed that NO level of PTI-2 (2.867±0.04 ppm) increased significantly
at T2 compared to control groups. At T3 the NO level of PTI-1 and PTI-2 was not
significantly different from Normal. The highest level of NO at this time showed by PTI3 (2.744±0.953 ppm). The IFN-γ and TNF-α was measured with immunoassay.

Generally, the level of IFN-γ increased at week one (T1), PTI-1 (75.93±8.31
pg/mL), PTI-2 (85.39±3.04 pg/mL) and PTI-3 (62.67±15.3 pg/mL). However,
these values were no different from that of control groups. The level of TNF-α of
all PTI groups increased significantly at T2. PTI-2 has the highest level (136±1.61
pg/mL) followed by PTI-3 (114.33±2.03 pg/mL) and PTI-1 (96.17±2.17 pg/mL).
According to these results, the effective dose as preventive agent was PTI-2
(80mg/200g BW). This was in accordance with cancer incidency on this groups
which is the lowest among treatments. All cytokines level decreased at T3, which
meant that the non-specific immune was not effective at the time. Overall,
treatments with temu ireng extracts increases the acitivity of macrophage cells,
level of IFN-γ and TNF-α of white rats when induction using 7,12dimetilbez[α]antracene was given to prevent cancer.
Keywords: Temu ireng, cancer, macrophage cells, nitric oxide, IFN-γ, TNF-α

6

© Hak Cipta Milik IPB dan BPPT, Tahun 2016
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB dan BPPT.
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apapun tanpa izin IPB dan BPPT.

7

AKTIVITAS KEMOPREVENTIF EKSTRAK TEMU IRENG
(Curcuma aeruginosa Roxb) TERHADAP SEL MAKROFAG,
IFN-γ DAN TNF-α TIKUS PUTIH YANG DIINDUKSI
7,12-DIMETILBENZ[α]ANTRASENA

MUJIBUR RAHMAN

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
Pada
Program Studi Biokimia

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2016

8

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tesis: Prof. Dr. drh. Maria Bintang, MS

9

Judul

Nama
NIM

: Aktivitas Kemopreventif Ekstrak Temu Ireng (Curcuma aeruginosa
Roxb) terhadap Sel Makrofag, IFN-γ dan TNF-α Tikus Putih yang
Diinduksi 7,12-dimetilbenz[α]antrasena
: Mujibur Rahman
: G851140131

Disetujui Oleh
Komisi Pembimbing

Dr Kurnia Agustini, MSi, Apt
Anggota

Dr Ir I Made Artika, MAppSc
Ketua

Diketahui Oleh

Ketua Program Studi
Biokimia

Dekan Sekolah Pascasarjana

Prof Dr drh Maria Bintang, MS

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 5 Februari 2016

Tanggal Lulus:

10

PRAKATA
Bismillahirrahmanirrahim

Alhamdulillah, Segala puji dan syukur penulis panjatkan kehadiran Allah
SWT atas segala limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat
menyelesaikan penelitian dan penulisan tesis ini. Penelitian ini berjudul Aktivitas
Kemopreventif Ekstrak Temu Ireng (Curcuma aeruginosa Roxb) terhadap sel
Makrofag, IFN-γ dan TNF-α Tikus Putih yang Diinduksi 7,12-dimetilbenz[α]antrasena. Penelitian ini berlangsung selama 7 bulan dari bulan Mei hingga
November tahun 2015 di Laboratorium Pengembangan Teknologi Industri Agro
dan Biomedika (LAPTIAB) Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi (BPPT),
Kawasan Puspitek Serpong
Penulis menyadari bahwa penelitian dan penulisan tesis ini dapat
diselesaikan atas izin yang Maha Kuasa dengan perantara bantuan dan dorongan
semangat dari berbagai pihak. Untuk itu, penulis ucapkan terutama kepada Bapak
Dr Ir I Made Artika, MAppSc dan Ibu Dr Kurnia Agustini, MSiApt sebagai
pembimbing yang telah banyak memberikan bimbingan, bantuan, kritik, saran dan
masukan selama penulisan tesis ini. Selanjutnya terima kasih juga penulis
sampaikan kepada Dr Churiyah, Dr Sriningsih MSi, Asri Sulfianti MBiomed,
Nuralih SSi, Joelham, Dea Kurniadi, Kara, Nur Hasanah, Soufa Malita yang
selalu membantu dalam penelitian ini baik itu berupa teknis dan analisis. Ucapan
terima kasih juga penulis sampaikan kepada tim peneliti Laboratorium
Pengembangan Teknologi Industri Agro dan Biomedika (LAPTIAB) BPPT yang
tidak dapat penulis sebutkan semuanya.
Akhir kata, Semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat bagi semua pihak
yang memerlukan khususnya untuk kemajuan ilmu pengetahuan di bidang ilmu
biokimia dan imunologi kanker.
Bogor, Februari 2016
Mujibur Rahman

11

DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL
DAFTAR GAMBAR
1. PENDAHULUAN.
Rumusan Masalah
Tujuan Penelitian
Ruang Lingkup
Manfaat Penelitian
2. METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Alat dan Bahan
Rancangan Penelitian
Penyiapan Hewan Coba
Perlakuan Hewan Coba
Penyiapan Ekstrak Temu ireng
Penyiapan larutan stok DMBA
Induksi Karsinogenesis dengan DMBA
Pengambilan Darah.
Isolasi Makrofag Peritoneal
Pengukuran Kadar NO (Nitric Oxide)
Pengukuran IFN-γ & TNF-α (Thermo SCIENTIFIC)
Analisis Data
3. HASIL
Insidensi Tumor
Hasil Analisis Sekresi NO (Nitric Oxide)
Hasil Analisis Kadar IFN-γ
Hasil Analisis Kadar TNF-α
4. PEMBAHASAN
Insidensi Tumor
Nitrit Oksida (NO)
Nitrit Oksida (NO) dan Tumor
Interferon-γ (IFN-γ)
Tumor Necrosis Factor-alpha (TNF-α)\
Hubungan IFN-γ, Produksi Nitric Oxide (NO) dan Tumor
Hubungan TNF-α, Produksi Nitric Oxide (NO) dan Tumor
Hubungan antara IFN-γ, TNF-α, Produksi NO Makrofag dan Tumor
5. KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan
Saran
DAFTAR PUSTAKA

vi
vi
1
2
2
3
3
3
3
3
4
4
4
5
5
5
5
5
6
6
6
7
7
7
9
10
12
12
12
14
15
16
18
19
20
21
21
21
22

12

DAFTAR TABEL
Halaman
1.
2.
3.
4.
5.

7
7
8
9
10

Angka insidensi pada berbagai kelompok perlakuan
Kadar NO makrofag peritoneum tikus pada T2
Kadar NO makrofag peritoneum tikus pada T3
Level IFN-γ (pg/mL) pada berbagai perlakuan terhadap waktu (T)
Level TNF-α (pg/mL) pada berbagai perlakuan terhadap waktu (T)
DAFTAR GAMBAR

Halaman
1.
2.
3.
4.
5.

Perbandingan sekresi NO makrofag terhadap waktu
Pengaruh antar perlakuan terhadap IFN-γ pada berbagai waktu
Pengaruh waktu terhadap level IFN-γ pada setiap kelompok perlakuan
Pengaruh antar perlakuan terhadap TNF-α pada berbagai waktu
Pengaruh waktu terhadap level TNF-α pada setiap kelompok perlakuan

8
9
10
11
11

1
1. PENDAHULUAN
Kanker adalah penyakit multifaktorial yang timbul dari tidak seimbangnya
proto-onkogen, onkogen, gen tumor supresor, gen regulasi apoptosis, dan gen yang
mengatur perbaikan DNA, sehingga pertumbuhan sel menjadi tidak terkendali dan
dapat bermetastasis (Schmitt 2003). Saat ini, kanker merupakan salah satu masalah
kesehatan terbesar di dunia dan menjadi penyakit yang paling ditakuti pada abad 20.
Pada tahun 2012, kanker menjadi penyebab kematian nomor dua didunia setelah
penyakit kardiovaskuler diantara penyakit tidak menular (WHO 2015). Kejadian
kanker di Asia Tenggara pada tahun 2017 diperkirakan meningkat dua kali lipat
dibandingkan tahun 2012. Begitu juga dengan Indonesia, diperkirakan pada tahun
2017 menjadi 6,4 juta kasus, dimana pada tahun 2012 ditemukan sebanyak 2,9 juta
kasus penyakit ini (IACR 2014). Di Indonesia sendiri prevalensi penderita kanker di
tahun 2014 sebesar 1.4% dari jumlah total penduduk, yaitu sebanyak 347.792 orang.
Kanker serviks dan kanker paru-paru menjadi pembunuh utama untuk katagori
penyakit ini (Kemkes 2015)
Metode pengobatan kanker saat ini cenderung menggunakan terapi modern
seperti operasi pembedahan, kemoterapi, terapi radiasi, terapi hormonal dan terapi
biologis (Baba & Câtoi 2007). Namun, terapi tersebut belum memberikan hasil yang
memuaskan serta memiliki efek samping yang merugikan. Salah satu pendekatan
yang dapat dilakukan adalah melalui kemopreventif dengan meningkatkan aktivitas
immunosurveillance (Smyth et al. 2006; Kim et al. 2007; Steward & Brown 2013;
Kasala et al. 2015). Kemopreventif adalah kegiatan untuk mencegah, menghambat,
atau membalik proses karsinogenesis melalui intervensi farmakologi, biologis dan
nutrisi (Surh et al. 2003; Naithani et al. 2008). Salah satu bahan alam yang dapat
digunakan sebagai agen kemopreventif adalah tanaman temu ireng.
Temu ireng (Curcuma aeruginosa Roxb) adalah tanaman yang mengandung
senyawa aktif kelompok sesquiterpen dan minyak atsiri yang diketahui berpotensi
sebagai anti kanker (Suphrom et al. 2012; Afzal et al. 2013; Liu et al. 2014;
Mustarichiei et al. 2014). Beberapa sesquiterpen seperti germakron, dehidrokurdion,
kurkumenol, zederone, zedoarondiol, zedoalakton A/B dan isokurkumenol diketahui
mampu meregulasi sel tumor pada tingkat selular (Zhong et al. 2011, Liu et al. 2013;
Xie et al. 2014). Sedangkan kelompok minyak atsiri seperti furanodiene, 1.8-cineol,
-elemene dan curzerenone diketahui bekerja dalam meregulasi kanker pada siklus
sel G2/M (Hino & Okita 2004; Wang et al. 2005; Zhang et al. 2005). Pusat Teknologi
Farmasi dan Medika BPPT sudah melakukan pengujian ekstrak temu ireng terhadap
hewan coba secara kuratif dan adjuvan. Penelitian terdahulu membuktikan bahwa,
ekstrak etanol temu ireng dapat menghambat pertumbuhan tumor payudara dan
meningkatkan kadar NO yang diproduksi oleh makrofag pada tikus betina SD
(Spraque-Dawley) yang diinduksi 7,12-dimetilbenz[α]antrasena (Handayani 2015).
Namun, pendekatan preventif dengan meningkatkan aktivitas immunosurveillance
terhadap penyakit ini belum dilakukan.
Immunosurveillance adalah suatu mekansisme kerja dari sistem imun yang
dapat mengidentifikasi dan menghilangkan sel tumor berdasarkan ekspresi antige n
tumor (Garcia- Lora et al. 2003; Finn 2006). Konsep ini menyatakan bahwa sistem

2
imum mempunyai peran dalam mencegah dan membatasi pertumbuhan sel tumor.
Sehingga sistem imunitas seluler seperti makrofag, sel T, sel NK (Natural Killer),
sehingga sel tersebut mampu mengenal antigen tumor dan memperantai kematian sel
tersebut sebelum tumor itu terbentuk (Finn 2006; Smyth et al. 2006; Kim et al. 2007).
Mekanismenya adalah dengan mengidentifikasi sel pratumor dan sel tumor melalui
interaksi berbagai protein sinyal dan sel efektor, kemudian mengeliminasi sel tersebut
sebelum menjadi berbahaya (Dunn et al. 2004; Zitvogel et al. 2006; Kim et al. 2007).
Sel makrofag adalah salah satu bentuk pertahanan seluler yang bekerja dengan
cara membunuh sel stres dan memfagositosis sebelum sel tersebut berbahaya. Sel
makrofag bekerjasama dengan sitokin yang diregulasi oleh STING (Stimulator of
Interferon Genes) dan sel imun seluler (Biswas & Mantovani 2010; Barber 2015).
IFN- (Interferon-γ) adalah sitokin yang mampu memperantai proses fagositosis sel
dengan memperkenalkan sel stres kepada sel makrofag. IFN- mampu meningkatkan
aktivitas makrofag melalui produksi oksigen reaktif nitrit oksida (NO) saat IFNmenempel pada reseptor IFN- R (Aktan β004). Sitokin lainnya yang terlibat dalam
proses imun non-spesifik adalah TNF-α (Tumor Necrosis Factor-α). TNF-α mampu
memperantarai apoptosis pada sel tumor melalui jalur mitokondria (Kumar et al.
2013). Selain itu, TNF-α bertindak sebagai marker utama pada produksi sitokin
inflamasi seperti IFN- , TNF-α, IL-1 dan IL-6 pada sel berinti. Sedangkan terhadap
makrofag, TNF-α mampu meningkatkan kemampuan fagositosis dan sitotoksisitas
terhadap sel tumor (Varney et al. 2002; Carlson et al. 2005; Shi et al. 2005).
Pemanfaatan temu ireng sebagai agen kemopreventif dalam meningkatkan
aktivitas immunosurveillance sel makrofag, IFN- dan TNF-α terhadap sel tumor
belum dibuktikan. Namun, temu ireng diketahui memiliki peran dalam menghambat
transformasi sel dan menginduksi apoptosis sel tumor. Oleh karena itu, perlu
dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai aktivitas ekstrak etanol temu ireng secara
kemopreventif terhadap hewan coba tikus yang diinduksi DMBA. Serta mengamati
aktivitas immunosurveillance terhadap sel makrofag, IFN- dan TNF-α pada tikus
yang diinduksi DMBA.
Rumusan Masalah
Berdasarkan hasil penelitian BPPT sebelumnya, ekstrak etanol temu ireng
(Curcuma aeruginosa Roxb) dapat menghambat dan menurunkan proliferasi sel
tumor. Penelitian tersebut dilakukan dengan pendekatan kuratif dan adjuvan,
sedangkan fungsinya sebagai agen kemopreventif belum diketahui. Maka dari itu,
perlu dilakukan penelitian lebih lanjut terhadap aktivitas ekstrak temu ireng dalam
meningkatkan kemampuan immunosurveillance sel makrofag, IFN- dan TNF-α pada
tikus putih yang diinduksi DMBA.
Tujuan Penelitian
Tujuan dari penelitian adalah untuk mengetahui aktivitas kemopreventif
ekstrak temu ireng terhadap sel makrofag, IFN- (Interferon-γ) dan TNF-α (Tumor
Necrosis Factor-α) pada tikus putih yang diinduksi DMBA.

3
Ruang Lingkup
Ruang lingkup untuk mencapai tujuan penelitian meliputi penggunaaan ektrak
etanol temu ireng sebagai bahan perlakuan dan tikus putih galur wistar sebagai hewan
model. Sejumlah 60 ekor hewan model dibagi kedalam 6 kelompok yang terdiri atas
kontrol Normal, Meniran (+), DMBA (-) dan kelompok Perlakuan Temu Ireng (PTI):
PTI-1 (40mg/200g BB), PTI-2 (80mg/200g BB), dan PTI-3 (160mg/200gBB).
Ekstrak temu ireng yang dilarutkan dalam CMC-Na 0.5% diberikan secara oral setiap
hari sebanyak 1 mL/200g BB (b/v). Permbagian waktu perlakuan terdiri atas masa
aklimatisasi, perlakuan preventif, perlakuan DMBA, dan perlakuan PTI hingga
minggu ke-20. Analisis yang dilakukan berupa uji sekresi NO makrofag peritoneum,
kadar IFN- dan TNF-α plasma tikus.
Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi mengenai kemampuan
temu ireng sebagai agen kemopreventif dalam pencegahan inisiasi dan promosi sel
tumor. Sehingga masyarakat dapat memanfaatkan tanaman ini sebagai pangan
fungsional dalam pencegahan kanker. Secara klinis penelitian ini diharapkan mampu
menghasilkan teknik baru dalam deteksi kanker secara dini melalui aktivitas dari sel
makrofag berdasarkan produksi nitrit oksida (NO) dan ekspresi protein sinyal IFNdan TNF-α dari plama darah tikus. Penelitian ini diharapkan mampu memberikan
landasan ilmiah mengenai kemampuan ekstrak temu ireng sebagai agen
kemopreventif dan imunostimulator bagi imun non-spesifik seperti sel makrofag dan
sitokin IFN- , TNF-α dalam fungsinya sebagai immunosurveillance.
2. METODE PENELITIAN
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan selama 7 bulan, yaitu dari bulan Mei hingga bulan
November 2015. Penelitian dilakukan di Laboratorium Pengembangan Teknologi
Industri Agro dan Biomedika (LAPTIAB) Badan Pengkajian dan Penerapan
Teknologi (BPPT), Kawasan Puspitek Serpong.
Alat dan Bahan
Alat yang digunakan adalah; glassware, rat sonde peroral, kandang dan
kelengkapan hewan coba, Microplate 24 & 96 wells (Costar), Mikropipet,
Mikroskop, Hemasitometer (Neubauer), Sentrifus (Hettich Micro 22R), Sonikator
(Powersonic 410), Inkubator (Memmert), ELISA Microplate Reader ELX 800.
Bahan yang digunakan adalah; Etanol 96% (food grade), EDTA, CMC-Na
(Natrium Karboksil Metil Selulosa), aqua bidestilata, Meniran (Phyllanthus niruri L.)
Komersial, 7.12-dimetilbenz[α]antrasena (DMBA) (Sigma), minyak jagung, PBS,
RPMI 1640 (Gibco), K 2 HPO 4 , KH2 HPO4 , reagen Griess, PBS, FBS (Foetal Bovine
Serum), LPS (Lipopolisaccharides), Rat TNF-α ELISA Kit (Thermo SCIENTIFIC),
Rat IFN-γ ELISA Kit (Thermo SCIENTIFIC).

4
Hewan coba yang digunakan adalah tikus putih galur wistar dari Biofarma,
Bandung. Ethical Clearance diperoleh dari Komite Etik FKUI-RSCM Salemba.
Sedangkan ekstrak yang digunakan adalah ekstrak etanol tanaman temu ireng dari
koleksi kebun Jamu Martha Tilaar.
Rancangan Penelitian
Penelitian merupakan eksperimen hewan coba menggunakan rancangan acak
lengkap (RAL) dengan satuan percobaan homogen. Tikus dibagi ke dalam enam
kelompok perlakuan dengan jumlah pengulangan berdasarkan rumus Federer.
Tahapan penelitian yang dilakukan terdiri atas persiapan ekstrak temu ireng, adaptasi,
induksi preventif ekstrak perlakuan, induksi DMBA, pengambilan plasma darah dan
isolasi makrofag peritoneal. Analasisi NO dilakukan pada 2 waktu sedangkan analisis
IFN- dan TNF-α dilakukan pada 4 waktu berbeda.
Penyiapan Hewan Coba
Penelitian ini merupakan kajian percobaan pada hewan coba tikus betina galur
Wistar berumur 1,5 bulan dengan bobot ± 60 gram dan sehat secara fisik yang
ditandai bulu tidak berdiri, warna putih bersih, mata jernih, tinja tidak lembek,
tingkah laku normal dan aktif. Tikus diaklimatisasi selama tujuh hari di Laboratorium
Farmakologi LAPTIAB sebelum diberi perlakuan. Hal tersebut bertujuan untuk
mengadaptasi hewan coba dengan lingkungan baru dan memperkecil pengaruh stres
terhadap metabolisme yang dapat mengganggu hasil pengamatan. Hewan coba di
tempatkan pada kandang yang diisi 5 ekor dengan suhu ruangan 20–26 o C (Air
Conditioner), kelembaban udara (Rh) 60-70%, perlakuan 12 jam gelap dan terang.
Perlakuan Hewan Coba
Sebanyak 60 ekor tikus dibagi kedalam 6 kelompok yaitu: kelompok kontrol
Normal, yaitu kelompok yang tidak diberikan perlakuan. Kelompok kontrol (+)
Meniran adalah kelompok pembanding positif, tikus diberikan ektrak meniran
(Phyllanthus niruri L.) 40mg/200g BB dan 4mg/200g BB DMBA. Kelompok ketiga
(DMBA) adalah kelompok pembanding negatif, tikus hanya diberika n 20mg/KgBB
DMBA. Kelompok keempat (PTI-1) yaitu tikus yang diberikan ekstrak TI dosis
40mg/200gBB dan 24mg/200g BB DMBA. Kelompok kelima (PTI-2) yaitu tikus
yang diberikan ekstrak TI dosis 80mg/200gBB dan 20mg/KgBB DMBA. Kelompok
keenam (PTI-3) yaitu tikus yang diberikan ektrak TI dosis 160mg/200gBB dan
20mg/KgBB DMBA.
Alur penelitian dimulai dengan mengadaptasikan tikus selama satu minggu
dengan lingkungan baru. Kemudian selama satu minggu tikus diberikan perlakuan
Meniran dan TI berdasarkan dosis yang disebutkan diatas, sedangkan kelompok 1 dan
Kelompok 3 hanya diberikan induksi CMC-Na 0.5%. Dua minggu selanjutnya tikus
diinduksi dengan DMBA sebanyak 5 kali dengan interval 3 hari, pada minggu ini
perlakuan Meniran dan TI tetap diberikan. Pada minggu kelima hingga minggu kedua
puluh tikus diberikan perlakuan berdasarkan kelompoknya.

5
Penyiapan Ekstrak Temu ireng
Pembuatan ekstrak dimulai dengan rimpang temu ireng dicuci bersih dan
dirajang halus dan dikeringkan dalam oven 40 o C, simplisia tersebut dihaluskan
hingga berukuran serbuk. 5 Kg simplisia dimasukkan kedalam maserator dan
ditambahkan 6 L etanol food grade hingga seluruh serbuk terendam, diaduk selama 6
jam dan dikeringkan menggunakan kertas saring (triplo). Filtrat dikumpulkan dan
dikeringkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental. Ekstrak yang
diberikan secara oral pada hewan coba dilarukan dalam pelarut CMC-Na 0.5% (500
mg CMC-Na ditakar hingga 1000 ml dengan aquades). Ekstrak temu ireng dibagi
kedalam tiga dosis, yaitu PTI-1 dengan dosis 40 mg/200g BB, PTI-2 dengan dosis, 80
mg/200g BB dan PTI-3 dengan dosis 160 mg/200gBB. Ketiga dosis ini diberikan
setiap hari secara oral hingga akhir penelitian.
Penyiapan larutan stok DMBA
Larutan stok DMBA dibuat sebanyak 30 mL. Sebanyak 120 mg serbuk
DMBA ditimbang dan dimasukkan ke dalam tabung, lalu ditambahkan 10 mL
minyak jagung dan dilarutkan menggunakan sonikator. Setelah larut sempurna
ditambahkan minyak jagung hingga diperoleh volume 30 mL.
Induksi Karsinogenesis dengan DMBA
Senyawa DMBA dengan konsentrasi 20 mg/kgBB yang dilarutkan dengan
minyak jagung sampai homogen diinduksi pada tikus. Induksi karsinogen DMBA
dilakukan peroral dengan dosis 20 mg/kgBB 3 hari sekali sebanyak 5 kali
Pengambilan Darah
Darah diambil melalui sinus orbital mata kanan atau kiri sebanyak ± 2 cc,
kemudian ditampung dalam tabung yang sudah diberikan EDTA sebagai
antikoagulan. Kemudian darah disentrifus pada 10000 rpm selama 10 menit,
kemudian plasma dipindahkan ke tabung baru.
Isolasi Makrofag Peritoneal
Tikus dimatikan melalui dislokasi tulang leher, lalu tikus diletakkan dalam
posisi terlentang, kemudian kulit bagian perut dibuka dan selubung peritoneum
dibersihkan dengan alkohol 70%. Sebanyak 10 ml medium RPMI 1640 diinjeksikan
secara intraperitoneal menggunakan spuit. Kemudian dibiarkan selama 3 menit
sambil ditekan-tekan perlahan atau digerakkan supaya medium menyebar ke seluruh
bagian peritoneal dan sel makrofag disuspensikan. Cairan peritoneum diaspirasi
dengan cara menekan organ dalam dengan jari jari kemudian cairan diambil
menggunakan jarum spuit secara intraperitoneal pada bagian yang tidak berlemak dan
jauh dari usus. Aspirat yang diperoleh disentrifugasi dengan kecepatan 1200 rpm
pada suhu 4 °C selama 10 menit. Endapan disuspensikan dalam medium RPMI 1640FBS. Sebanyak 10 µL suspensi sel diteteskan ke dalam hemositometer kemudian

6
dihitung jumlah sel pada 4 bilik dan disuspensikan dengan kerapatan sel 2.5x10 6
sel/ml. Plate diinkubasi dalam inkubator CO 2 5%, suhu 37 o C selama 15 menit. Lalu
ditambahkan 1 ml RPMI komplit ke dalam setiap well, plate diinkubasi kembali
selama 2 jam, lalu media dibuang dan well dibilas dengan media basal sebanyak 2
kali dan ditambahkan 1 ml RPMI 1640-FBS dan diinkubasi 24 jam dalam inkubator
CO2 5%, suhu 37 o C.
Pengukuran Kadar NO (Nitrit Oksida)
Setelah 24 jam, plate dikeluarkan dari inkubator, lalu 100 µL supernatan
dimasukkan ke dalam plate 96 well. Sebanyak 100 µL reagen Griess ditambahkan
kesetiap well, lalu plate dibungkus dengan aluminium foil atau dibiarkan ditempat
gelap selama 10 menit. Terakhir diukur menggunakan ELISA Reader pada =546 nm.
Larutan standar NO dibuat dari 5 mg Natrium Nitrit yang dilarutkan dalam 5 ml aqua
bidestilata (konsentrasi larutan 1000 ppm). Dilakukan pengenceran hingga diperoleh
larutan standar dengan konsentrasi 25 ppm, 12.5 ppm, 6.25 ppm, 3.125 ppm, 0.156
ppm dan 0.75 ppm. Kemudian dibuat kurva standar menggunakan analisis regresi
linear sederhana dan digunakan untuk menghitung konenstrasi nitrit dari sampel.
Pengukuran IFN-γ & TNF-α (The rmo SCIENTIFIC)
Pengujian dilakukan menggunakan Rat IFN-γ & TNF-α ELISA Kit. Wash
buffer dibuat dengan pengenceran 24x dari larutan konsentrat. Standar disiapkan
dengan memasukkan 150 µL standar ke dalam tabung dan dihomogenkan, lalu
dilakukan pengenceran bertingkat dari konsentrasi 500 pg/mL hingga didapat enam
konsentrasi.
Microplate di kelompokkan ke dalam standar dan sampel masing- masing 1
strip well, sebanyak 50 µL sampel & 50 µL standar dimasukkan dalam well,
kemudian plate diinkubasi pada suhu ruang (20-25 o C) selama 1 jam. Kemudian plate
dicuci dengan wash buffer (3X) dan ditambahkan 100 µL reagent biotinylat antibodi
kesemua well dan diinkubasi pada suhu ruang (20-25 o C) selama 30 menit. Plate
dicuci dengan wash buffer (3X) dan ditambahkan 100µL solusi streptavidin- HRP,
lalu diinkubasi kembali pada suhu ruang (20-25 o C) selama 30 menit. Plate dicuci
dengan wash buffer (3X) dan ditambahkan 100 µL substrat TMB kesetiap well. Plate
di tutup dengan strip penutup dan diinkubasi pada ruang gelap selama 30 menit.
Setelah 30 menit ditambahkan 100 µL stop solution kesetiap well dan diukur pada kur
absorbansi pada 450 nm
Analisis Data
Data penelitian berupa kadar NO dianalisis secara statistika dengan uji
analysis of variant (ANOVA). Apabila terdapat perbedaan nyata dilakukan uji lanjut
menggunakan uji Tukey dengan taraf kepercayaan sebesar 95% (α=0,05). Sedangkan
IFN- dan TNF-α dilakukan analisis dua arah, yaitu terhadap perlakuan dan waktu.
Apabila tidak ditemukan perbedaan yang bermakna, maka dilanjutkan dengan analisis
deskriptif.

7
3. HASIL
Insidensi Tumor
Insidensi adalah perbandingan antara jumlah hewan coba yang terkena tumor
dengan total hewan coba dalam 1 kelompok perlakuan dikali 100%. Pada Tabel 1
dapat dilihat bahwa, angka insidensi tertinggi ditunjukkan oleh kelompok kontrol
negatif DMBA sebesar 100%, artinya semua tikus pada kelompok tersebut terkena
tumor. Kemudian diikuti oleh kelompok PTI-1 dan PTI-3 sebesar 62.5%. Sedangkan
insidensi pada kelompok PTI-2 masing sebesar 50%. Dari data tersebut dapat dilihat
bahwa kelompok dengan dosis paling efisien dalam mengurangi angka insidensi
adalah PTI-2. Berdasarkan angka insidensi pada kelompok DMBA, maka model
kanker pada penelitian ini dapat diterima.
Tabel 1 Angka insidensi pada berbagai kelompok perlakuan (BPPT 2015, Data tidak
dipublikasi)
Kel ompok
Normal
Meniran DMBA
PTI-1
PTI-2
PTI-3
Insidensi (% )
0
75
100
62.5
50
62.5
Hasil Analisis Sekresi NO (Nitric Oxide)
Analisis sekresi NO makrofag peritoneum tikus dilakukan 2 kali, uji sekresi
NO pertama dilakukan pada minggu ke-5 (T2) atau seminggu setelah induksi DMBA
terakhir. Dosis DMBA yang diberikan adalah 4 mg/200g BB selama 5 kali dengan
selang 3 hari sekali, DMBA diberikan selama 2 minggu. Pada mingu ini hewan coba
tetap mendapatkan perlakuan berdasarkan kelompoknya (PTI & Meniran), sedangkan
kelompok Normal dan DMBA diberikan CMC-Na 0.5% sebagai pengganti perlakuan
untuk menyamakan tingkat stres. Jumlah sekresi NO makrofag peritoneum tikus pada
minggu ke-5 (T2) disajikan pada Tabel 2. Berdasarkan Tabel 2 dapat dilihat bahwa,
kadar NO makrofag kelompok PTI-2 dan PTI-3 (P Ftabel (2.51)). Berdasarkan uji lanjut pada T3 diperoleh hasil sebagai
berikut; PTI-1 dan PTI-3 signifikan lebih tinggi dari Kontrol Normal. Sedangkan
rata-rata NO tertinggi ditunjukkan oleh PTI-3, lalu diikuti oleh PTI-1 dan PTI-2. Dan
rerata kadar NO semua kelompok perlakuan lebih tinggi dibandingkan Kontrol
Normal pada T3. Hanya kelompok PTI-2 mengalami penurunan kadar NO pada T3.
Tabel 3 Kadar NO makrofag peritoneum tikus pada T3
Kelompok
Kontrol Normal (CMC-Na)
Kontrol (+) Meniran (40 mg/200g BB)
Kontrol (-) DMBA (20 mg/kgBB)
PTI-1 (dosis 40 mg/200g BB)
PTI-2 (dosis 80 mg/200g BB)
PTI-3 (dosis 160 mg/200g BB)

Konsentrasi NO (ppm)
0.536 ± 0.258
0.688 ± 0.205
1.624 ± 0.706
1.873 ± 1.018 #
1.218 ± 0.441
2.744 ± 0.953 #

Keterangan : (#) signifikan lebih tinggi dari Kontrol Normal

Analisis selanjutnya dilakukan terhadap pengaruh waktu pada T2 terhadap T3.
Perbandingan sekresi NO makrofag pada berbagai perlakuan terhadap waktu dapat
dilihat pada Gambar 1. Pada gambar tersebut dapat dilihat bahwa kelompok PTI-2
menunjukkan bahwa, level NO pada T2 signifikan lebih tinggi terhadap T3.
Sedangkan PTI-1 dan PTI-3, level NO pada T3 signifikan lebih tinggi terhadap T2.

*

*

*

PTI-1

PTI-2

PTI-3

4
3.5
3
2.5
2
1.5
1
0.5

0
Normal

Meniran

DMBA

Gambar 1 Perbandingan sekresi NO makrofag terhadap waktu. (*) signifikan tinggi
terhadap waktu T2/T3
Keterangan:

9
Hasil Analisis Kadar IFN-γ
Analisis kadar IFN- dilakukan terhadap plasma darah yang diambil dari tikus
pada empat waktu berbeda. Berdasarkan Tabel 4 dapat dilihat bahwa bahwa pengaruh
perlakuan terhadap level IFN- pada T0 menunjukkan perbedaan signifikan pada
PTI-1 dan PTI-2 terhadap Normal. Pada T1 signifikansi ditunjukkan oleh semua PTI
terhadap Normal dan DMBA. Pada T2 kelompok PTI-1 dan PTI-2 signifikan lebih
tinggi terhadap kelompok kontrol. Dan pada T3 kelompok PTI-2 dan PTI-3 signifikan
lebih tinggi terhadap PTI-1 dan kontrol. Tetapi kelompok PTI-1 lebih rendah dari
DMBA.
Tabel 4 Level IFN- (pg/mL) pada berbagai perlakuan berdasarkan waktu.
T

Normal

T0

45.17±0.14

T1

43.16±0.13

T2

41.34±0.27

Meniran
c

48.17±10.48

c

bc

58.67±16.33

c

45.17±0.95

c

tn

b

DMBA
42±4.63

49.33±8.16
46.28±3.89

c

PTI-1

tn

47.5±0.95
c
b

b

PTI-2
b

75.93±8.31
57.89±5.76

PTI-3

62.83±12.38

b
a

85.39±3.04
60.06±8.03

c

a

a
a

47±4.89

tn

62.67±15.3

b

49.78±10.91

a

tn

a

42.33±0.27
42.5±1.49
50±0.82
41.17±2.04
55.17±3.4
55.83±1.49
T3
Keterangan : Huruf superskrip yang berbeda pada baris yang sama menunjukkan pengaruh perlakuan yang
berbeda nyata, (tn) tidak berbeda nyata (Uji Tukey’s P