BAB 3 METODE PENELITIAN
3.1 Alat-alat
1. Gelas ukur Pyrex
2. Gelas Beaker
Pyrex 3.
Gelas Erlenmeyer Pyrex
4. Corong kaca
5. Corong pisah 500 mL
Pyrex 6.
Ekstraktor 5000 mL
Schoot Duran 7.
Tabung reaksi Pyrex
8. Pipet tetes 9. Pipa kapiler
10. Spatula 11. Rotarievaporator
Bűchi R-114 12. Labu rotarievaporator
1000 mL Schoot Duran
13. Alat destilasi 14. Labu takar
250 mL Pyrex
15. Kolom kromatografi 16. Botol vial
15 mL 17. Neraca analitis
Mettler AE 200 18. Lampu UV
254 nm356 nm UVGL 58 19. Statif dan klem
20. Penangas air 21. Batang pengaduk
22. Chamber 23. Spektrofotometer
1
H-NMR JeolDelta2NMR 500MHz
24. Spektrofotometer FT-IR Shimadzu
25. Spektrofotometer UV-Vis
Universitas Sumatera Utara
3.2 Bahan-bahan
1. Daun Buni
2. Metanol
Destilasi 3.
Etil asetat Teknis
4. Aquadest
5. N-heksana
Teknis 6.
Silika gel 40 70-230 mesh ASTM E.Merck. KgA 7.
FeCl
3
5 8.
NaOH 10 9.
Serbuk Mg 10. HCl
p
11. H
2
SO
4p
12. Pereaksi Benedict 13. HCl 6
14. Kapas 15. Kloroform
Teknis 16. Plat KLT silika gel 60 F
254
E.Merck.Art 554 17. Plat KLT Preparatif 60 F
254
18. Benzena p.a. E. Merck
19. Aseton p.a. E. Merck
3.3 Prosedur Penelitian 3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun Buni yang diperoleh dari daerah Jalan Pelajar Timur Ujung No.51 , kecamatan Medan Denai, Sumatera Utara. Daun buni dikeringkan di
udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun Buni sebanyak 1200 g.
Universitas Sumatera Utara
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Buni
Serbuk daun Buni diidentifikasi dengan menggunakan cara Skrining Fitokimia. Untuk membuktikan adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun buni maka
dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna sebagai berikut: 1. Dimasukkan 10 gram serbuk daun Buni yang telah dikeringkan ke dalam dua
gelas Erlenmeyer 2. Ditambahkan 100 mL metanol ke dalam gelas Erlenmeyer
3. Didiamkan selama 1 malam 4. Disaring
5. Dibagi masing-masing ekstrak sampel ke dalam 4 tabung reaksi 6. Ditambahkan masing-masing pereaksi
a. Tabung I : dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan serbuk Mg, dan HCl
p
menghasilkan larutan merah jambu c. Tabung III: dengan NaOH 10 menghasilkan larutan hijau kekuningan
d. Tabung IV: dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutan orange kekuningan
3.3.3 Ekstraksi Daun Tumbuhan Buni
Serbuk daun buni ditimbang sebanyak 1200 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 5 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama 24 jam.
Maserasi ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut
metanol menguap. Lalu dilakukan pemisahan tanin dengan cara melarutkan fraksi pekat metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian di rotarievaporator
lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol dan di ekstraksi partisi berulang-ulang dengan n-heksana
sampai lapisan n-heksana hampir bening. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n- heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali
sehingga diperoleh ektrak pekat lapisan metanol. Fraksi metanol di uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict, lalu di hidrolisis dengan menggunakan HCl 6 sambil di
Universitas Sumatera Utara
panaskan diatas penangas air selama ± 45 menit jam. Kemudian disaring dan filtrat yang diperoleh di ektraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali. Ekstrak
kloroform dipekatkan dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 0,65 g.
3.3.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak kloroform dengan menggunakan fase diam silika gel 60F
254
Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari sistem dan perbandingan pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom. Fasa
gerak yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 vv.
Dimasukkan 10 ml campuran larutan fase gerak n-heksana: etil asetat 90:10 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Di totolkan ekstrak pekat
kloroform pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, lalu di tutup dan di elusi.
Plat yang telah di elusi, di keluarkan dari bejana, lalu di keringkan. Di amati noda yang terbentuk dibawah sinar UV, kemudian difiksasi dengan
pereaksi FeCl
3
5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-heksana:etil
asetat dengan perbandingan 80:20, 70:30, 60:40 vv.
3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40
70-230 mesh ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n- heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40 vv.
Universitas Sumatera Utara
Dirangkai alat kromatografi kolom. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen
lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dibuburkan 0,65
g ekstrak pekat kloroform dengan silika gel dengan pelarut kloroform, kemudian dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu
ditambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat 90:10 vv secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan
penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 80:20 vv, 70:30 vv, dan 60:40
vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap ± 10 mL, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk pasta.
3.3.6 Pemurnian
Pasta yang diperoleh dari isolasi dengan kromatografi kolom dilarutkan kembali dengan kloroform lalu dianalisis KLT untuk mengetahui apakah senyawa yang
diperoleh sudah murni atau belum sekaligus mencari fasa gerak yang sesuai unuk KLT preparatif. Kloroform : metanol 90:10 vv adalah fasa gerak yang menunjukkan
pemisahan paling baik untuk selanjutnya digunakan untuk menjenuhkan bejana KLT preparatif. Sedangkan pasta yang telah dilarutkan tadi ditotolkan secara perlahan-
lahan dan sama rata disepanjang tepi bawah plat KLT yang telah diaktifkan. Plat dimasukkan kedalam bejana yang berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan,
kemudian ditutup. Setelah dielusi, plat dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, dan hasilnya diperiksa di bawah sinar UV. Tiap zona diberi tanda dan dikeruk lalu dielusi
dengan metanol:etil asetat 1:1. Hasil elusi diuapkan hingga diperoleh pasta kuning kecoklatan.
Universitas Sumatera Utara
3.3.7 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian pasta dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana:etil asetat 70:30 vv, dan kloroform:metanol 70:30 vv.
Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi lapis tipis, lalu dijenuhkan. Ditotolkan pasta yang sebelumnya dilarutkan dengan kloroform
pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi lapis tipis yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat
KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, diamati di bawah sinar UV, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
3
5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida.
3.3.8 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi 3.3.8.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Penelitian Farmasi, Fakultas Farmasi USU Gambar 4.1.
3.3.8.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan
menggunakan KBr Gambar 4.2.
Universitas Sumatera Utara
3.3.8.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H- NMR
Analisis dengan alat Spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Laboratorium Pusat Penelitian Kimia – LIPI, Kawasan PUSPITEK Serpong, Tangerang dengan
menggunakan Aseton sebagai pelarut Gambar 4.3.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Bagan Skrining Fitokimia
Diekstraksi maserasi dengan metanol Disaring
Dibagi kedalam 4 tabung reaksi
Tabung I Tabung II
Tabung III Tabung IV
Ditambahkan pereaksi
FeCl
3
5
Larutan hitam
Ditambahkan pereaksi
NaOH 10 Diamati
perubahan warna
Larutan hijau kekuningan
Ditambahkan pereaksi
Mg-HCl Diamati
perubahan warna
Larutan merah muda Ditambahkan
pereaksi H
2
SO
4p
Diamati perubahan
warna
Positif Flavonoida
Negatif Flavonoida
Positif Flavonoida
Positif Flavonoida
Diamati perubahan
warna Larutan orange
kekuningan Serbuk daun tumbuhan buni
Antidesma bunius L Spreng
Universitas Sumatera Utara
3.5 Bagan Penelitian
1200 gram serbuk daun tumbuhan buni Antidesma bunius LSpreng.
diskrining fitokimia dimaserasi dengan metanol sebanyak 5 L
didiamkan selama ± 24 jam dilakukan sebanyak 6 kali
disaring Ekstrak metanol
Residu diskrining fitokimia
Ekstrak pekat metanol diuapkan hingga semua metanol menguap
dilarutkan dengan etil asetat disaring
Ekstrak etil asetat Endapan
diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator
Ekstrak pekat etil asetat diuapkan hingga semua etil asetat menguap
dilarutkan dengan metanol diekstraksi partisi dengan n-heksana sampai bening
Lapisan metanol Lapisan n-heksana
diskrining fitokimia dipekatkan dengan rotarievaporator
diuapkan hingga pekat dilakukan uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict +
dihidrolisis dengan HCl 6 sambil dipanaskan selama 45 menit didinginkan
disaring Ekstrak metanol asam
Residu diekstraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali
Lapisan kloroform Lapisan metanol asam
dipekatkan Ekstrak pekat kloroform
dipekatkan dengan rotarievaporator
diskrining fitokimia
Universitas Sumatera Utara
Lanjutan Ekstrak pekat kloroform
diskrining fitokimia diuji Kromatografi Lapis Tipis untuk mengetahui eluen yang sesuai
dikolom kromatografi dengan fasa diam silika gel dan fasa gerak eluen n-heksana:etil asetat 90:10; 80:20; 70:30; 60:40vv
ditampung tiap fraksi sebanyak ± 10 mL dalam botol vial digabung fraksi dengan Rf yang sama
diuji Kromatografi Lapis Tipis Fraksi 1-23 90:10
Fraksi 28-4680:20 Fraksi 47-70 70:30
Fraksi 71-84 60:40 diuji FeCl
3
5 diuji FeCl
3
5 diuji FeCl
3
5 diuji FeCl
3
5 Hasil negatif
Hasil positif Hasil positif
Hasil positif dianalisis Kromatografi Lapis Tipis
dipreparatif dengan eluen kloroform : metanol 90:10 vv
dikeringkan disinari di bawah lampu UV
digerus dari plat dilarutkan dengan campuran
metanol:etil asetat 1:1 disaring
Senyawa murni dianalisis Kromatografi Lapis Tipis
diuapkan dianalisis dengan
spektrofotometer UV-Vis, spektrofotometer Inframerah FT-IR,
spektrometer
1
H-NMR Hasil Analisis
Universitas Sumatera Utara
BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil Peneltian
Dari hasil skrining pendahuluan terhadap ekstrak metanol dan etil asetat dari daun tumbuhan buni A.bunius L Spreng. dengan adanya penambahan pereaksi-pereaksi
warna untuk menentukan golongan senyawa kimia yang dikandung dengan menggunakan pereaksi flavonoida ternyata sampel positif mengandung flavonoida.
Hasil elusi dari perbandingan pelarut n-heksana:etil asetat 70:30 vv pada fraksi 47-71, dilakukan KLT preparatif dengan eluen kloroform: metanol 90:10 vv
untuk mendapatkan senyawa murni. Sehingga diperoleh senyawa murni berupa pasta berwarna kuning kecoklatan, seberat 30 mg, dan nilai Rf= 0,31.
Spektrum UV-Visible senyawa hasil isolasi dengan menggunakan pelarut metanol ditunjukkan pada gambar 4.1 dibawah ini :
Gambar 4.1 Spektrum UV-VISIBLE Senyawa Hasil Isolasi 1. Pita I memberikan panjang gelombang 330,0 nm
2. Pita II memberikan panjang gelombang 266,0 nm
Universitas Sumatera Utara
Kategori