Identifikasi Kandidat Gen Nucleotide Binding Site (NBS) dari Pisang Musa acuminata Colla var.malaccensis (Ridl.) Nasution dan Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish

IDENTIFIKASI KANDIDAT GEN Nucleotide Binding Site (NBS)
DARI PISANG Musa acuminata Colla var. malaccensis (Ridl.)
Nasution DAN Musa,AAA, sub-kelompok Cavendish

DIYAH MARTANTI

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN
SUMBER INFORMASI SERTA PELIMPAHAN HAK CIPTA*
Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis berjudul Identifikasi Kandidat Gen
Nucleotide Binding Site (NBS) dari Pisang Musa acuminata Colla var.
malaccensis (Ridl.) Nasution dan Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish adalah
benar karya saya dengan arahan dari komisi pembimbing dan belum diajukan
dalam bentuk apa pun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang
berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari
penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di
bagian akhir tesis ini.

Dengan ini saya melimpahkan hak cipta dari karya tulis saya kepada LIPI
dan Institut Pertanian Bogor.
Bogor, April 2015
Diyah Martanti
NIM. G353110181

RINGKASAN
DIYAH MARTANTI. Identifikasi Kandidat Gen Nucleotide Binding Site (NBS)
Dari Pisang Musa acuminata Colla var. malaccensis (Ridl.) Nasution dan Musa,
AAA, sub-kelompok Cavendish. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI, YUYU
SURYASARI POERBA dan RITA MEGIA.
Indonesia merupakan negara yang kaya akan keragaman pisang, baik pisang
budidaya maupun pisang liar. Namun, adanya penyakit layu fusarium oleh
cendawan Fusarium oxysporum f.sp.cubense menyebabkan penurunan produksi
pisang Indonesia. Pengembangan varietas pisang yang tahan penyakit, secara
konvensional dihambat oleh waktu generasi yang panjang, partenokarpi,
poliploidi dan sterilitas dari kebanyakan kultivar.yang dapat dimakan seperti
pisang Cavendish. M. acuminata var. malaccensis merupakan pisang liar yang
berbiji dan diploid dan mempunyai resistensi yang tinggi terhadap penyakit layu
fusarium.Sehingga, pisang ini dapat dijadikan sebagai sumber gen untuk

ketahanan penyakit.
Salah satu kelas gen resistensi (R) yang paling besar yang telah
dikarakterisasi adalah Nucleotide Binding Site (NBS). Motif asam amino yang
conserved pada daerah NBS mencakup motif p-loop/kinase-1, kinase-2,
GLPL/kinase-3 dan RNBS A,B,C dan D. Oleh karena itu, penelitian ini bertujuan
untuk mengidentifikasi kandidat gen Nucleotide Binding Site (NBS) pada aksesi
pisang liar M. acuminate var. malaccensis dan Musa, AAA, subkelompok
Cavendish serta uji tantang terhadap Fusarium oxysporum f.sp. cubense TR4 pada
M. acuminate var. malacensis dan Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish
Aksesi M. acuminate var. malaccensis (II.17B#5/LIPI010) dan Musa, AAA,
sub-kelompok Cavendish (II.13B#3/LIPI090) yang digunakan dalam penelitian
ini berasal dari Kebun Plasma Nutfah Pisang, Cibinong Science Center, Pusat
Penelitian Biologi-LIPI. Metode CTAB digunakan dalam ekstraksi DNA dari
daun. Tiga pasang primer degenerate digunakan dalam amplifikasi DNA.
Fragmen yang diperoleh dilanjutkan dengan kloning dan sekuensing. Analisis
BLASTp digunakan untuk menentukan homologi urutan basa nukleotida dan
asam amino pada Genbank dan Musa Genome. Program CHROMAS PRO
digunakan untuk analisis contig. Program MEGA5 dengan metode MUSCLE
digunakan dalam pensejajaran asam amino dan kontruksi pohon filogenetik.
Metode double tray digunakan dalam uji tantang terhadap Fusarium oxysporum

f.sp. cubense ras 4 pada M. acuminata var. malaccensis dan Musa, AAA,
subkelompok Cavendish.
Dari tiga pasang primer degenerate, diperoleh 11 fragmen analog gen
ketahanan yang berhasil diisolasi dari DNA pisang M. acuminate var. malaccensis
dan Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish dengan produk berukuran antara 3001000 pb. Dari 11 sampel produk PCR yang telah dikloning, semua mengandung
insersi fragmen berukuran antara 323-1114 pb. Berdasarkan hasil analisis
nukleotida dan deduksi asam amino dengan menggunakan analisis BLASTp yang
terdapat di Genbank, ditemukan 3 sekuen yaitu P5-8, P5-10 dan P5-11 dengan
ukuran berturut-turut 770, 1114 dan 791 bp.Sekuen P5-8 dan P5-10 berasal dari
Musa acuminata var. malaccensis. Sekuen P5-11 berasal dari Musa, AAA, subkelompok Cavendish. Sekuen P5-8 mempunyai kesamaan identitas 97% dengan

disease resistance protein RPS2 pada M. acuminata var. malaccensis dengan
aksesi XM009418398. Sedangkan sekuen P5-10 dan P5-11 mempunyai kesamaan
identitas berturut-turut 99% dan 100% dengan disease resistance protein RPM1
pada M. acuminata var. malaccensis dengan aksesi XM009419073. BLAST pada
Musa Genome, hasilnya menunjukkan ketiga sekuen memiliki coverage > 90%
dan terdapat pada kromosom nomor 9. Ketiga sekuen ini telah dideposit ke
Genbank dengan nomor akses KP691062-KP691064.
Hasil pensejajaran prediksi asam amino dari ketiga fragmen dengan
protein NBS-LRR tanaman pisang serta gen-R tanaman lain yang telah dideposit

di Genbank menunjukkan terdapat empat struktur konservatif NBS. Keempat
struktur konservatif asam amino yaitu motif P-loop/kinase-1a (GGVGKTT),
kinase-2 (LVLDDIW), RNBS-B/kinase-3a (CKVLFTTRS) dan asam amino
hidrofobik (hydrophobic domain) (GLPL).
Hasil analisis filogenetik sekuen prediksi asam amino menunjukkan bahwa
protein R dan protein pisang terbagi kedalam dua kelompok yaitu TIR-NBS dan
non-TIR-NBS.Fragmen P5-8 tergabung satu kelompok dengan protein RPS2 dari
M. acuminate var. malaccensis dan protein NBS-LRR dari M. balbisiana.
Sedangkan, fragmen P5-10 dan P5-11 tergabung satu kelompok dengan berturutturut protein RPM1 dari M. acuminate var.malaccensis dan protein RX01 dari
jagung. Fragmen yang diperoleh dari penelitian ini bersama protein pada pisang
lain dan tanaman monokotil seperti tebu, gandum dan jagung termasuk kedalam
kelas non-TIR-NBS.
Hasil pengamatan daun dan bonggol terhadap Foc TR4menunjukkan bahwa
pisang M. acuminate var. malaccensis berada pada status toleran, sedangkan
Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish berada pada status sangat rentan. Hal ini
menunjukkan bahwa M. acuminata var. malaccensis lebih tahan daripada Musa,
AAA, sub-kelompok Cavendish
Kata Kunci: Pisang, Nucleotide Binding Site, daerah konservatif, Musa acuminata
var. malaccensis, Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish

SUMMARY
DIYAH MARTANTI. Identification of Gene Candidate of Nucleotide Binding
Site (NBS) from Banana Musa acuminata Colla var. malaccensis (Ridl.) Nasution
and Musa, AAA, Cavendish sub-group. Supervised by UTUT WIDYASTUTI,
YUYU SURYASARI POERBA and RITA MEGIA.
Indonesia is one of the centers of banana genetic diversity in the world, both
cultivated and wild. However, the presence of fusarium wilt which is caused by
the fungus onescan reduced banana production in Indonesia.The disease-resistant
banana varieties improvement, conventionally inhibited by long time generation,
parthenocarpy, polyploidy and sterility of the most cultivars like Cavendish. Musa
acuminatavar.malaccensisis a wild seeded diploid banana and it has a high
resistance to Fusarium oxysporum f.sp. cubense TR4. Thus, it can be used as a
source of genes for disease resistance.
The largest class of resistance (R) genes is Nucleotide Binding Site (NBS).
Conserved amino acid motifs in the NBS region include P-loop (kinase-1), kinase2, GLPL (kinase-3) and RNBS A, B, C and D motifs. Therefore, the aim of this
study was to identify the gene candidate of Nucleotide Binding Site (NBS) on the
accession of M. acuminata var. malaccensis and Musa, AAA, Cavendish
subgroup and bioassay to Fusarium oxysporum f.sp cubense in M. acuminata var.
malaccensis and Musa, AAA, Cavendish sub-group.
The banana cultivars used in this study consist of a wild banana M.

acuminata var. malaccensis (II.17B#5/LIPI010) and Musa, AAA, Cavendish subgroup (II.13B#3/LIPI090) collected from Banana Germplasm Gardens, Research
Center for Biology, Indonesian Institute of Sciences. CTAB method was used to
extract DNA from leaves.Three pairs of degenerate primers were used to DNA
amplification. The fragments were cloned and sequenced. BLASTp analysis was
used to determine homology of nucleotide and amino acid in Genbank and Musa
Genome. CHROMAS PRO program was used to contig analysis. MEGA5
program with MUSCLE method was used to allign amino acid and construct
phylogenetic tree. Double tray method was used to bioassay to Fusarium
oxysporum f.sp. cubense in M. acuminata var. malaccensis and Musa, AAA,
Cavendish sub-group.
Three pairs of degenerate primers were able to produce 11 analogue
resistance gene fragments that were isolated from M. acuminata var. malaccensis
andMusa, AAA, Cavendish sub-group. The size of the fragments between 3001000 bp. The PCR product of the 11 fragments have been cloned. All of the
fragments contained the inserted fragment between 323-1114 bp in size. Based on
the analysis of nucleotide and the deduced amino acid using BLASTp analysis in
Genbank, it was found that three sequences consisted of P5-8, P5-10, and P5-11
with the size of 770, 1114, and 791 bp respectively. P5-8 and P5-10 were isolated
from Musa acuminata var. malaccensis and P5-11 was isolated from Musa, AAA,
Cavendish sub-group.P5-8 has97% similarityto the disease resistance protein
RPS2 on M. acuminata subsp. malaccensis(XM009418398). While, P5-10 and

P5-11 have 98% and 100% similarity to the disease resistance protein RPM1 on
M. acuminata subsp. malaccensis (XM009419073). BLAST in Musa genome
showed that all of the three sequences are located on chromosome number 9.

Contig sequences were deposited in Genbank and assigned as number KP691062
- KP691064.
Sequence allignment between amino acid of three fragments, NBS-LRR
protein from bananas, and R-gene from other plants that have been deposited in
Genbank showed that there were four conservative structure of NBS.The four
conserved regions of amino acids wereP-loop/kinase-1a (GGVGKTT), kinase-2
(LVLDDIW), RNBS-B/kinase-3a (CKVLFTTRS) and hydrophobic amino acids
(hydrophobic domain) (GLPL).
The phylogenetic analysis showed that R proteins and bananas protein are
divided into two groups: TIR-NBS and non-TIR-NBS. P5-8 fragment was
grouped in RPS2 protein from M. acuminata var. malaccensis. Meanwhile, P5-10
and P5-11 fragments were grouped in RPM1 protein from M. acuminata var.
malaccensis and RX01 protein from corn respectively. These fragments with
another banana and protein in monocotyledonous plant such as sugarcane, wheat,
and corn were included in the class of non-TIR-NBS.
The result of observation to leaves and rhizomes showed that M. acuminate

var. malaccensis was in tolerant status, meanwhile Musa, AAA,Cavendish subgroup was in highly susceptible status. That showed that M. acuminata var.
malaccensisis more resistant than Musa, AAA, Cavendish sub-group.

Key words: Banana, Nucleotide Binding Site, conserved domain, Musa acuminate
var. malaccensis, Musa, AAA, Cavendish sub-group

© Hak Cipta Milik IPB& LIPI, Tahun 2015
Hak Cipta Dilindungi Undang-Undang
Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan
atau menyebutkan sumbernya. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan,
penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik, atau
tinjauan suatu masalah; dan pengutipan tersebut tidak merugikan kepentingan
IPB &LIPI
Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis ini
dalam bentuk apa pun tanpa izin IPB&LIPI

IDENTIFIKASI KANDIDAT GEN Nucleotide Binding Site (NBS)
DARI PISANG Musa acuminata Colla var. malaccensis (Ridl.)
Nasution DAN Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish

DIYAH MARTANTI

Tesis
sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar
Magister Sains
pada
Program Studi Biologi Tumbuhan

SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2015

Penguji luar komisi pada Ujian Tesis: Dr Ir Aris Tjahjoleksono, DEA

Judul Tesis : Identifikasi Kandidat Gen Nucleotide Binding Site (NBS) dari Pisang
Musa acuminata Colla var.malaccensis (Ridl.) Nasution dan Musa,
AAA, sub-kelompok Cavendish
Nama
: Diyah Martanti

NIM
: G353110181

Disetujui oleh
Komisi Pembimbing

Dr Ir Utut Widyastuti, MSi
Ketua

Dr Yuyu Suryasari Poerba
Anggota

Dr Rita Megia, DEA
Anggota

Diketahui oleh

Ketua Program Studi
Biologi Tumbuhan

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr Ir Miftahudin, MSi

Dr Ir Dahrul Syah, MScAgr

Tanggal Ujian: 6 Februari 2015

Tanggal Lulus:

PRAKATA
Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala berkah,
rahmat dan karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini berhasildiselesaikan dengan
baik. Tema yang saya pilih dalam penelitian ini ialah genetika molekuler yang
berjudul “Identifikasi Kandidat Gen Nucleotide Binding Site (NBS) dari Pisang
Musa acuminata Colla var.malaccensis (Ridl.) Nasution dan Musa acuminata
Colla cv.Cavendish (AAA). Penelitian ini telah dilaksanakan pada bulan Februari
2013 sampai dengan bulan Desember 2014, bertempat di Laboratorium Genetika
Tumbuhan, Pusat Penelitian Biologi LIPI.
Penelitian ini dapat dilaksanakan atas bantuan karyasiswa LIPI 2011 dan
ditunjang oleh beberapa kegiatan penelitian di Pusat Penelitian Biologi LIPI, yaitu
program Kompetitif LIPI Sub-Program Domestikasi dan Pemanfaatan Terukur
dengan tema „Pemuliaan pisang untuk ketahanan terhadap penyakit layu
Fusarium‟ tahun 2012 dan 2013.
Penulis menyampaikan banyak terimakasih kepada Ibu Dr Ir Utut
Widyastuti, MSi., Ibu Dr Yuyu Suryasari Poerba dan Ibu Dr Rita Megia,
DEA.yang telah memberikan bimbingan, saran dan masukan. Penulis juga
mengucapkan banyak terimakasih kepada Bapak Dr Ir Aris Tjahjoleksono, DEA
selaku dosen penguji atas saran dan masukannya. Ungkapan terimakasih juga
disampaikan kepada Ibu Dr Kusumadewi Sri Yulita, Dr. Marlina Ardiyani,
Achirul Nditasari, MSc., Dewi Wulansari, MSc. dan Bapak Dr Iman Hidayat yang
telah memberikan saran dalam pengerjaan penelitian. Kepada seluruh staff dan
teknisi Laboratorium Genetika Tumbuhan, Laboratorium Biak Sel dan Jaringan
serta Laboratorium Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi LIPI, penulis ucapkan
terimakasih banyak atas bantuannya.
Ungkapan terimakasih dan cinta yang tak terhingga atas doa dan dukungan
seluruh keluarga besar, suami Gembong Agronomianto dan putri Alya Zahra
Afifatulkhonsa serta Bapak/Ibu Sugito Surodiharjo dan Bapak/Ibu
Syahidin.Semoga Allah SWT senantiasa memberikan rahmat dan kemuliaan
kepada semua pihak yang telah membantu dalam penelitian ini.
Semoga karya ilmiah ini memberikan manfaat bagi kemajuan ilmu
pengetahuan Indonesia.

Bogor, April 2015
Diyah Martanti

DAFTAR ISI
DAFTAR TABEL

xiii

DAFTAR GAMBAR

xiii

1 PENDAHULUAN
Latar Belakang
Tujuan Penelitian

1
1
3

2 TINJAUAN PUSTAKA
Musa acuminata Colla
Gen Ketahanan Nucleotide Binding Site- Leusine Rich Repeat

3
3
4

3 BAHAN DAN METODE
6
A. Identifikasi Kandidat Gen Nucleotide Binding Site (NBS) Dari Pisang
Musaacuminata Colla var.malaccensis (Ridl.) Nasution dan Musa, AAA,
sub-kelompok Cavendish
6
Waktu dan Tempat Penelitian
6
Bahan Penelitian
6
Ekstraksi DNA total
6
Amplifikasi DNA
6
Analisis sekuen DNA
7
B. Uji tantang terhadap cendawan Fusarium oxysporum f.sp
cubenseTR4
7
Waktu dan Tempat Penelitian
7
Bahan tanaman dan isolat cendawan
7
Persiapan bahan uji
8
Pengujian ketahanan terhadap Fusarium oxysporum f.sp. cubenseTR4 8
Pengamatan dan analisis data
8
4 HASIL DAN PEMBAHASAN
10
Amplifikasi PCR dengan menggunakan primer degenerate
10
Analisis sekuen fragmen produk PCR dari DNA genom pisang
11
Analisis pensejajaran sekuen dan filogenetik prediksi asam amino dengan
protein RGA dan gen-R tanaman lain
13
Uji tantang terhadap Fusarium oxysporum f.sp.cubenseTR4
16
5 SIMPULAN DAN SARAN
UCAPAN TERIMAKASIH

18
18

DAFTAR PUSTAKA

19

RIWAYAT HIDUP

22

DAFTAR TABEL
1 Primer yang digunakan untuk mengisolasi gen NBS dari genom pisang
7
2 Index kategori ketahanan
9
3 Sequence identity antara sekuen prediksi asam amino tanaman pisang
Musa acuminatavar.malaccensis dan Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish
dengan protein ketahanan penyakit Musa yang telah dideposit pada
GenBank.
11
4 BLAST di Musa genome
12
5 Status ketahanan/kerentanan Musa acuminatavar.malaccensis dan Musa, AAA,
sub-kelompok Cavendish4 minggu setelah inokulasi Foc TR4
konsentrasi 106 konidia/ml
18

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8

9

10

Negara-negara penghasil pisang tertinggi tahun 2012
1
Total produksi buah nasional tahun 2013
2
Representasi dari kelas R-gen utama yang mengandung daerah
konservatif
5
SkorLeaf Symptom Index (LSI)
8
SkorRhizome Discoloration Index (RDI)
9
Hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan primer degenerate
10
Kromosom pisang
12
Analisis pensejajaran sekuen prediksi asam amino dengan beberapa
protein Musa pada daerah NBS dan protein R yang terdeposit pada
genbank NCBI
14
Pohon filogenetik sekuen prediksi asam amino dari RGA pisang dan
beberapa protein Musa dan protein tanaman lain berdasarkan
analisis pensejajaran menggunakan MUSCLE dan dibuat berdasarkan
metode NJ
15
Uji tantang ketahanan terhadap Fusarium oxysporum f.sp cubenseTR4
pada M. acuminatavar.malaccensis dan Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish
setelah 4 minggu pengamatan
17

1 PENDAHULUAN

Latar Belakang
Indonesia merupakan negara yang kaya akan keragaman pisang, baik pisang
budidaya maupun pisang liar. Pada tahun 2012, Indonesia menduduki peringkat
ke-6 dunia dalam produksi pisang sebanyak 6.189.052 ton setelah India, China,
Filipina, Ekuador dan Brazil(Gambar 1) (FAO 2013). Di Indonesia, produksi
pisang mencapai 5.359.126 ton (34%) dari keseluruhan produksi buah nasional
yang mencapai 15.767.472 ton pada tahun 2013 (Gambar 2) (BPS 2014). Namun,
adanya penyakit layu fusarium menyebabkan 1300 hektar pisang Barangan milik
petani di Sumatera Utara dan 300 hektar perkebunan pisang Cavendish untuk
tujuan ekspor ke Singapura di Riau pada tahun 1995 menjadi rusak berat
(Jumjunidang et al.2005). Penyakit layu fusarium disebabkan oleh cendawan
Fusarium oxysporumf.sp.cubense(Foc) yang mampu hidup di dalam tanah dalam
bentuk klamidospora dan dapat bertahan di tanah dalam jangka waktu
lama,akibatnya sulit untuk dikendalikan (Widono et al. 2003). Cendawan ini akan
berkecambah untuk menginfeksi akar lateral ketika kontak dengan akar pisang
dan akan membentuk koloni yang menyumbat sistem vaskular tanaman, sehingga
menyebabkan layu dan kematian tanaman pisang. Tropical Race 4(TR4) dari
cendawan ini menjadi ras yang paling virulen pada saat ini sehingga dapat
menginfeksi hampir semua tanaman kultivar pisang, termasuk yang tahan
terhadap ras lain dari penyakit layu fusarium (Sun et al. 2010).

(FAO, 2013)

Gambar 1 Negara-negara penghasil pisang tertinggi tahun 2012
Pengembangan varietas pisang yang tahan penyakit, secara konvensional
dihambat oleh waktu generasi yang panjang, triploid, partenokarpi dan sterilitas
dari kebanyakan kultivar. yang dapat dimakan. M. acuminata Colla liar
merupakan pisangyang berbiji dan diploid. Di Indonesia, ada 15 varietas M.

2
acuminata liar tersebar dari Sumatera sampai Papua yaitu M. acuminata var.
acuminata, var. alasensis Nasution, var. bantamensis Nasution, var. breviformis
Nasution, var. cerifera Back. Nasution, var. flava (Ridl.) Nasution, var.
halabanensis (Meijer) Nasution, var. longipetiolata Nasution, var. malaccensis
(Ridl.) Nasution, var. microcarpa (Becc.) Nasution, var. nakaii Nasution, var.
rutilifes (Back.) Nasution, var. sumatrana (Becc.) Nasution, var. tomentosa
(K.Sch.) Nasution, and var. zebrina (v.Houtte) Nasution (Nasution 1991).
Menurut Kayat et al. (2004) pisang liar Musa acuminata var. malaccensis
mempunyai resistensi yang tinggi terhadap penyakit layu Fusarium oxysporum
f.sp.cubense TR4. Sehingga, pisang liar ini dapat dijadikan sebagai sumber gen
untuk ketahanan penyakit.

Produksi Buah Nasional 2013
1%
1% 1% 0% 1%
3%
3% 0%1% 2% 1%
1%
1%
4%

6%

12%
13%

9%
34%

6%

alpukat
belimbing
langsat
jambu biji
jambu air
nangka
salak
mangga
jeruk
pepaya
pisang
nanas
durian
manggis
rambutan
sawo
sirsak
markisa
sukun
melinjo
(BPS, 2014)

Gambar 2 Total produksi buah nasional tahun 2013
Salah satu kelas gen resistensi (R) yang paling besar yang telah
dikarakterisasi adalah Nucleotide Binding Site- Leusine Rich Repeat (NBS-LRR).
Daerah NBS penting untuk pengikatan ATP dan hidrolisis serta diyakini terlibat
dalam sinyal transduksi yang dipicu oleh infeksi patogen. Motif asam amino yang
conserved pada daerah NBS mencakup motif p-loop/kinase-1, kinase-2, GlysineLeusine-Proline-Leusine (GLPL)/kinase-3 dan Resistance NBS (RNBS) A,B,C
dan D (Meyers et al. 1999). Daerah LRR terlibat dalam interaksi berbagai protein
dan mengenali molekul elisitor dari patogen (Fluhr 2001). Dalam penelitian ini,
hanya daerah NBS saja yang diidentifikasi sedangkan daerah LRR tidak. Sun et
al.(2010), mendapatkan 20 fragmen gen analog ketahanan layu fusarium pada
pisang „Goldfinger‟ dengan ukuran sekitar 530 bp dan termasuk ke dalam
kandidat gen resisten kelas non-Toll/interleukin-1-Receptor TIR-NBS yang
mengandung 4 daerah konservatif asam amino yaitu p-loop, kinase-2, RNBS-B
dan asam amino GLPL hidrofobik. Penelitian terkait gen NBS-LRR ini sudah

3
banyak dilakukan yaitu pada tomat dan Arabidopsis (Pan et al. 2000), kentang
(Bendahmaneyet al. 2002) dan tebu (Glynn et al. 2008). Sedangkan penelitian
pada tanaman pisang diantaranya mencakup pisang liar M. acuminata Colla
(Miller et al. 2008; Peraza-Echeverria et al. 2008), pisang Cavendish (Li et al.
2012), pisang Goldfinger (Sun et al. 2010) dan Musa AAB cv. Nendran
(Augustine & Joseph 2014).

Tujuan Penelitian
Penelitian ini bertujuan untuk mengidentifikasi kandidat gen Nucleotide
Binding Site (NBS) pada aksesi pisang liar M. acuminata Colla var. malaccensis
(Ridl.) Nasution dan Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish dan uji tantang
terhadap cendawan Fusarium oxysporum f.sp. cubenseTR4 pada M. acuminata
Colla var. malaccensis(Ridl.) Nasution dan Musa, AAA, sub-kelompok
Cavendish
.

2 TINJAUAN PUSTAKA
Musa acuminata Colla
Genus Musa merupakan salah satu dari tiga genus yang termasuk kedalam
keluarga Musaceae dari ordo Zingiberales. Berdasarkan jumlah kromosom, genus
Musa dibagi kedalam lima section. Dua section Callimusa dan Australimusa
mempunyai jumlah kromosom 2n=20, dua section, Eumusa dan Rhodochlamys
mempunyai jumlah kromosom 2n=22, dan section terakhir Ingentimusa
mempuyai jumlah kromosom 2n=14 (Horry et al. 1997).Genus Musa merupakan
yang terbesar dalam section Eumusa yang termasuk kedalamnya yaitu semua
pisang budidaya, M. acuminata dan M. balbisiana (Simmond 1962).
Saat ini, Hakkinen (2013) membagi genus Musa kedalam dua section, yaitu
Musa dan Callimusa berdasarkan analisis DNA. Section Musa terdiri dari
subgenus Rhodochlamys dan Eumusa. Section Callimusa terdiri dari Australimusa
dan Ingentimusa.
Musa acuminata Colla berasal dari Asia Tenggara. Di Indonesia, ada 15
varietas M. acuminata liar tersebar dari Sumatera sampai Papua yaitu
M.acuminata var. acuminata, var. alasensis Nasution, var. bantamensis Nasution,
var. breviformis Nasution, var. cerifera Back. Nasution, var. flava (Ridl.)
Nasution, var. halabanensis (Meijer) Nasution, var. longipetiolata Nasution, var.
malaccensis (Ridl.) Nasution, var. microcarpa (Becc.) Nasution, var. nakaii
Nasution, var. rutilifes (Back.) Nasution, var. sumatrana (Becc.) Nasution, var.
tomentosa (K.Sch.) Nasution, and var. zebrina (v.Houtte) Nasution (Nasution
1991). M. balbisiana berasal dari India Selatan dan dibudidaya di semua wilayah
Thailand. M. acuminata dan M. balbisiana menghasilkan pisang diploid, triploid
dan tetraploid yang tidak berbiji (seedless). Pengelompokan genom

4
diklasifikasikan sebagai AA, AB, AAA, AAB, ABB, AABB, AAAB, ABBB
dengan sumber genom A berasal dariM. acuminata dan genom B dari M.
balbisiana (Simmonds & Shepperd 1955). Pada saat ini, klasifikasi pisang
budidaya menggunakan sistem genome score card untuk menentukan jenis genom
pada pisangberdasarkan morfologi (Singh & Uma 1996), flowcytometer untuk
menentukan tingkat ploidi dan marka molekular untuk menentukan komposisi
genom.
Menurut Kayat et al. (2004) pisang liar M. acuminata var. malaccensis
mempunyai resistensi yang tinggi terhadap penyakit layu Fusarium oxysporum
f.sp. cubense TR4. Sehingga, pisang liar ini dapat dijadikan sebagai sumber gen
untuk ketahanan penyakit.

Gen Ketahanan Nucleotide Binding Site-Leusine Rich Repeat
Sebagai sumber resistensi terhadap adanya patogen di dalam plasma nutfah,
khususnya pada genus Musa, adanya gen ketahanan (gen-R) dalam tanaman
menawarkan potensi untuk pemuliaan non-konvensional. Genotipe tanaman yang
resisten dapat mencegah patogen masuk melalui gene for gene mechanism, yaitu
diinisiasi melalui interaksi langsung maupun tidak langsung antara produk gen
ketahanan konstitutif (gen R) dan produk gen avirulen biotropik patogen spesifik
(gen Avr) atau elisitor. Interaksi ini memicu rantai transduksi sinyal yang
mengaktivasi mekanisme pertahanan seperti respon hipersensitif (HR), sintesis
protein dan metabolit anti mikrobia, penebalan dinding sel dan penghambatan
vaskuler. Selama lebih dari 15 tahun, lebih dari 40 gen-R telah dikarakterisasi dari
tanaman model dan tanaman pertanian yang penting (Martin et al. 2003).
Ada lima kelas gen ketahanan yang telah diidentifikasi berdasarkan daerah
domain protein yang konservatif. Kelas yang paling banyak adalah domainprotein
Nucleotida Binding Site- Leusine Rich Repeat (NBS-LRR) (Rommens & Kishore
2000). Kelas lainnya merupakan protein dengan ekstrasitoplasmik LRRs (eLRRs)
terikat pada daerah transmembran (TM), reseptor serine-threonin (Ser/thr) mirip
kinase dengan ekstraseluler LRR, Ser/Thr sitoplasmik tanpa LRR) dan protein
dengan membran terikat pada daerah coiled coil (CC domain) (Gambar 3).
Protein NBS-LRR merupakan protein yang paling banyak termasuk ke
dalamnya lebih dari 20 gen R fungsional dari berbagai spesies tanaman. Protein
ini berukuran besar, berlimpah dan terlibat dalam mendeteksi berbagai patogen
termasuk bakteri, virus, cendawan, nematoda, serangga dan oomycetes (McHale
et al. 2006).
Daerah NBS penting untuk pengikatan ATP dan hidrolisis ATPserta
diyakini terlibat dalam transduksi sinyal yang dipicu oleh infeksi patogen. Daerah
ini mengandung beberapa motif yang khas dari transduksi sinyal ATP-ase dengan
sejumlah protein Signal Ttransduction ATPases with Numerous Domains
STAND. Protein STAND berfungsi sebagai tombol molekular dalam jalur sinyal
penyakit. Hidrolisis ATP diyakini sebagai perubahan konformasi yang mengatur
sinyal (McHale et al. 2006). Daerah LRR terlibat dalam interaksi berbagai protein
dan mengenali molekul elisitor dari patogen (Fluhr 2001). Daerah ini merupakan
motif umum terdapat lebih dari dua ribu protein dari virus sampai eukariot dan
terlibat dalam interaksi protein-protein dan pengikatan ligan (McHale et al. 2006).

5
Laju mutasi yang tinggi pada daerah LRR menyebabkan keragaman genetik
diperlukan dalam pengenalan secara spesifik rekombinasi keanekaragaman
patogen (Michelmore & Meyers 1998). Dua subfamili yang terdapat pada protein
NBS-LRR berdasarkan motif N-terminal yaitu TIR dan Non-TIR. Subfamili TIRNBS menunjukkan homologi antara motif asam amino N-terminal dan daerah
Toll Like Receptor (TLRs) pada Drosophilladan Interleukin (IL) pada mamalia
sebagai faktor imunitas pada hewan. Subfamili ini terdapat terbatas pada Dikotil
dan Gymnospermae (Parker et al. 1997). Subfamili Non-TIR dapat mengandung
motif coiled-coil yang merupakan bagian dari Leucine Zipper Sequence (LZ),
terdapat dalam Monokotil dan Dikotil. Asam amino konservatif mengandung
ikatan fosfat loop atau “P loop” (disebut Kinase 1), Kinase 2, GLPL (disebut
Kinase 3) dan motif RNBS-A,B, C dan D. Asam amino terakhir pada motif
Kinase 2 dapat berbeda antara tipe TIR dan non-TIR, dengan residu asam aspartat
pada TIR dan triptofan pada non-TIR (Meyers et al. 1999).

Keterangan : Kinase (Segiempat merah); LRR=Leusine Rich Repeat (Segitiga biru),
NBS=Nucleotide-Binding-Site (Segienam kuning); TIR= Toll-Interleukin1-Receptor (Oval
oranye); CC= Coiled Coil Sequence (Segitiga hijau) ; TM=Transmembran Protein ( + pink);
Kelas 1: Kinase, Kelas 2: LRR-NBS-CC; kelas 3=LRR-NBS-TIR; Kelas 4=TM-LRR; Kelas 5=
Kinase-TM-LRR(Nogueira et al, 2007)

Gambar 3. Representasi dari kelas gen-R utama yang mengandung daerah
konservatif.
Berbagai macam penyakit yang disebabkan oleh cendawan dan virus
merupakan masalah besar dalam produksi pisang. Melalui bioteknologi tanaman
yaitu teknologi DNA rekombinan bersama dengan teknologi kultur jaringan
tanaman menawarkan cara alternatif untuk mengembangkan tanaman yang tahan
penyakit yang tidak dapat dilakukan melalui pemuliaan tanaman konvensional.
Transformasi genetik pada pisang dapat menjadi solusi bagi permasalahan yang
terkait dengan pemuliaan pisang konvensional dan dapat memfasilitasi

6
pemindahan sifat tahan penyakit dari kultivar liar ke kultivar komersial yang
rentan penyakit (Arvanitoyannis et al. 2008).

3 BAHAN DAN METODE
A. Identifikasi Kandidat Gen Nucleotide Binding Site (NBS) dari Pisang M.
acuminata Colla var.malaccensis (Ridl.) Nasution danMusa, AAA, subkelompok Cavendish
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan mulai bulan Februari 2013-Oktober 2014 di
Laboratorium Genetika Tumbuhan,Pusat Penelitian Biologi, LIPI.
Bahan Penelitian
Dua aksesi pisang yang digunakan dalam penelitian ini yaitu pisang liar M.
acuminata var. malaccensis (II.17B#5/LIPI010) dan pisang budidaya Musa,
AAA, sub-kelompok Cavendish(II.13B#3/LIPI090) yang dikoleksi dari Kebun
Plasma Nutfah Pisang, Pusat Penelitian Biologi LIPI. Material DNA yang
digunakan berasal dari daun muda tanaman pisang yang ditanam di kebun Plasma
Nutfah Pisang, Pusat Penelitian Biologi LIPI.
Ekstraksi DNA Total
DNA total diekstrak dari daun muda menggunakan metode
Cetyltrimetylammoniumbromide (Delaporta et al.1983; Syamkumar et al. 2003)
yang telah dimodifikasi dengan penambahan Polyvinylpirrolidone (PVP) pada
saat penggerusan dan β-Mercaptoethanol pada buffer ekstraksi.
Amplifikasi DNA
Amplifikasi DNA menggunakan primer degenerate berdasarkan daerah
konservatif gen NBS-LRR. Tiga pasang primer yang telah didesain oleh Sun et al.
(2010) digunakan untuk mengisolasi analog gen R dari DNA genom pada pisang
Goldfinger (AAAB) yang tahan penyakit layu fusarium (Tabel 1).
Campuran reaksi PCR sebanyak 15 µl mengandung 7.5 µl GoTaq® Green
Master Mix 2X, 0.75 µl 20 pmol primer forward dan reverse, 1 µl DNA 50 ng/µl
dan ditambah air sampai 15 µl. Kondisi PCR meliputi predenaturasi pada 95oC
selama 3 menit, kemudian diikuti 40 siklus dengan denaturasi pada 94oC selama
45 detik, annealing masing-masing pada 44oC (F1+F2); 54oC (F5+F6); 58oC
(F9+F10) selama 30 detik dan elongasi pada 72oC selama 60 detik, dengan tahap
pasca elongasi pada 72oC selama 10 menit. Proses PCR menggunakan mesin
Thermal Cycler Takara Gradient PCR TP600. Amplikon dipurifikasi dari gel dan
diligasikan dengan pGEM-T Easy Vector (Promega, USA) dengan mencampur 1

7
μl hasil PCR (50 ng), 1 μl pGEM-T Easy vektor 25 ng, 1 μl T4 DNA ligase 5
Unit, 5 μl 2x rapid buffer ligasi dan H2O sampai volume 10 ml, kemudian
diinkubasipada 4°C semalam. Hasil ligasi ditransformasikan kedalam bakteri E.
coliJM109 (Promega, USA) dengan metode heatshock dari Maniatis et al.(1982).
Plasmid yang mengandung rekombinan diekstrak menggunakan High Speed
Plasmid Mini Kit (GenAid) dan dikirim ke perusahaan jasa sekuensing 1st Base
untuk proses sekuensing.
Tabel 1 Primer yang digunakan untuk mengisolasi gen NBS dari genom pisang
Primer
Peptida
Sekuen Primer
Referensi
Degenerate
F1(F)
P-loop
GGDGTDGGNAARACWAC
Deng et al., 2000
F2(R)
GLPL
AANGCHAGNGGYAANCC
Deng et al., 2000
F5(F)
P-loop
GGIGGIGTIGGIAAIACIAC
Peraza-Echeverria et al.2008
F6(R)
GLPL
AAGIGCTAAGIGGIAAGICC
Peraza-Echeverria et al.2008
F9(F)
P-loop
GGNGGNRTIGGIAARACIAC
Sun et al., 2010
F10(R)
GLPL
GAGGGCNARNGGNAAICC
Sun et al., 2010
catatan: kode untuk basa campuran: R=A/G, W=A/T, Y=C/T, H=A/T/C, D=A/T/G, N=A/G/T/C,
I=Hypoxanthine

Analisis sekuen DNA
Analisis sekuen produk PCR yang telah teridentifikasi dengan cara
membandingkan sekuen DNA dan prediksi asam amino produk PCR tersebut
dengan aksesi tanaman lain yang terdapat dalam pangkalan data Genbank NCBI
menggunakan algoritma Basic Local Allignment Search Tool untuk protein
BLASTp (www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) dan BLAST di Musa
Genome(http://banana-genome.cirad.fr).
Analisis
contig
sekuen
DNA
menggunakan program Chromas Pro. Analisis pensejajaran (allignment) dengan
metode Multiple Sequence Allignment (MUSCLE) dan pohon filogenetik
dikonstruksi dengan metode neighbor-joining dengan program Molecular
Evolutionary Genetics Analysis (MEGA5) (Tamura et al. 2011). Bootstrap 1000
kali ulangan digunakan untuk mengevaluasi derajat pola pengelompokan pada
pohon filogenetik.

B. Uji tantang terhadap cendawan F. oxysporum f.sp.cubenseTR4
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilaksanakan di rumah kaca laboratorium Genetika Tumbuhan,
Pusat Penelitian Biologi, LIPI pada bulan Januari-Desember 2014.
Bahan Tanaman dan Isolat Cendawan.
Tanaman yang digunakan yaitu M. acuminata var. malaccensis (II. 17B#5/
LIPI010) dan Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish (II.13B#3/ LIPI090). Isolat
F. oxysporum f.sp. cubense TR4 diperoleh dari koleksi laboratorium
Mikrobiologi, Pusat Penelitian Biologi LIPI.

8

Persiapan Bahan Uji
Bahan tanaman yang digunakan untuk uji tantang adalah plantlet hasil
perbanyakan kultur jaringan yang ditanam dalam media pertumbuhan optimum
selama 2 bulan dengan tinggi mencapai 40-50 cm. Sebanyak 5 tanaman untuk
setiap nomor aksesisebagai ulangan.
Isolat F. oxysporum f.sp. cubense TR4 diremajakan dalam media Potato
Dextrose Broth (PDB) dan diinkubasi dalam suhu ruang selama 14 hari.
Konsentrasi inokulum yang dikehendaki sebesar 106 konidia ml-1 dihitung
menggunakan Haemocytometer.
Pengujian ketahanan terhadap F. oxysporum f.sp. cubenseTR4.
Pengujian berdasarkan metoda Mak et al. (2004) dengan menggunakan
teknik wadah ganda (double tray). Wadah pertama dengan bagian bawah seperti
saringan untuk menaruh polibag berisi tanaman. Sedangkan wadah kedua berada
dibawah wadah pertama untuk menampung kelebihan air dan nutrisi.
Perlakuan meliputi kontrol dan 106 konidia ml-1. Plantlet diinokulasi
dengan larutan 106 konidia ml-1 dengan cara merendam akar tanaman selama 2
jam, kemudian ditanam dalam polibag berisi pasir steril. Penyiraman dilakukan
setiap hari dan pemupukan menggunakan pupuk cair Growmore dilakukan
seminggu sekali.
Pengamatan dan analisis data.
Pengamatan meliputi gejala luar yang muncul pada daun (Leaf Symptom
Index=LSI) dan gejala dalam pada bonggol (Rhizome Discoloration Index=RDI).
Pengamatan LSI dilakukan pada minggu ke-2 dan ke-4 setelah penanaman.
Pengamatan RDI dilakukan pada minggu ke-4 setelah penanaman.
Evaluasi pengamatan Leaf Symptom Index (LSI) berdasarkan Mak et al.
(2004), terdiri atas 5 skor dengan kriteria sebagai berikut (Gambar 4):
1. Tidak ada warna kuning pada daun, tanaman sehat
2. Sedikit penguningan pada daun bagian bawah
3. Penguningan pada sebagian besar daun bagian bawah
4. Penguningan meluas pada sebagian besar daun
5. tanaman mati

Gambar 4 SkorLeaf Symptom Index (LSI)

9
Evaluasi pengamatan Root Symptom Index (RDI) berdasarkan Mak et al.
(2004), terdiri atas 8 skor dengan kriteria sebagai berikut:
1. Tidak ada diskolorasi pada jaringan empulur bonggol atau sekitarnya
2. Tidak ada diskolorasi pada jaringan empulur bonggol; ada diskolorisasi pada
daerah pertemuan akar dengan bonggol.
3. Diskolorasi sebanyak 5% pada empulur bonggol.
4. Diskolorasi sebanyak 6-20% pada empulur bonggol.
5. Diskolorasi sebanyak 21-50% pada empulur bonggol
6. Diskolorasi lebih dari 50% pada empulur bonggol
7. Diskolorasi pada seluruh empulur bonggol
8. Tanaman mati

Gambar 5SkorRhizome Discoloration Index (RDI)

Setelah dicatat LSI dan RDI, kemudian dihitung Disease Severity Index
(DSI) dengan rumus:
DSI = Σ ( skor x jumlah tanaman pada skor tersebut)
jumlah tanaman yang diperlakukan
DSI terdiri atas empat kategori yaitu sangat tahan, tahan, rentan dan sangat
rentan. Berdasarkan nilai DSI,tanaman tersebut dapat ditentukan masuk kedalam
salah satu dari 4 kategori tersebut (Tabel 2).
Tabel 2 Indeks kategori ketahanan
Nilai DSI untuk LSI
1
Antara 1.1 -2
Antara 2.1 - 3
Antara 3.1 - 4

Nilai DSI untuk RDI
1
Antara 1.1 - 3
Antara 3.1- 5
Antara 5.1 - 8

Status ekspresi penyakit
Sangat tahan
Toleran
Rentan
Sangat rentan

10

4 HASIL DAN PEMBAHASAN
Amplifikasi PCR dengan menggunakan primer degenerate
Primer degenerate telah didesain untuk mengamplifikasi daerah antara motif
p-loop dan GLPL dari area Nucleotide Binding Site dari kelas gen ketahanan NBS.
Dari tiga pasang primer degenerate, diperoleh 11 fragmen analog gen ketahanan
yang berhasil diisolasi dari DNA pisang M. acuminata var.malaccensis dan Musa,
AAA, sub-kelompok Cavendish dengan produk berukuran antara 300 pb sampai
1000 pb (Gambar 6). Pasangan primer F5(F)+ F6 (R) menghasilkan pita dengan
ukuran 350 dan650 pb. Pasangan primer F1(F)+F2(R) menghasilkan pita dengan
ukuran 500 dan1000 pb dan F9(F)+F10(R) menghasilkan pita 500 dan1000 bp.
A M C

M C

M C

A

A

1000 bp
650 bp

1000 bp

500 bp

350 bp

500 bp

Primer
F1(F)+F2(R)

Primer
F5(F)+F6(R)

Primer
F9(F)+F10(R))

Keterangan: A: Marker 100 bp (Fermentas), M:Musa acuminata var. malaccensis, C:Musa
acuminatacv. Cavendish .

Gambar 6Hasil amplifikasi DNA dengan menggunakan primer degenerate.
Dari ketiga pasang primer, lima fragmen berasal dari M. acuminata var.
malaccensis dan enam fragmen berasal dari Musa, AAA, sub-kelompok
Cavendish. Pada primer F1(F)+ F2(R), M. acuminata var. malaccensis hanya
teramplifikasi satu fragmen sedangkan pada Musa, AAA, sub-kelompok
Cavendish ada dua fragmen. Semua fragmen tersebut diisolasi dari gel dan
dilakukan kloning ke dalam bakteri Eschericia coli.

11
Analisis sekuen fragmen produk PCR dari DNA genom pisang
Dari 11 fragmen produk PCR yang telah disekuensing, semua mengandung
insersi fragmen berukuran antara 323-1114 pb. Berdasarkan hasil analisis
nukleotida dan deduksi asam amino dengan menggunakan BLASTp pada
Genbank, ditemukan 3 sekuen yang mengandung daerah NBS yaitu P5-8, P5-10
dan P5-11 dengan ukuran berturut-turut 770, 1114 dan 791 bp. Sekuen P5-8 dan
P5-10 berasal dari M. acuminata var. malaccensis. Sedangkan, Sekuen P5-11
berasal dari Musa, AAA, sub-kelompok Cavendish. Sekuen P5-8 mempunyai
kesamaan identitas 97% dengan disease resistance proteinRPS2 pada M.
acuminatavar.malaccensis. Sedangkan sekuen P5-10 dan P5-11 mempunyai
kesamaan identitas 99% dan 100% dengan disease resistance protein RPM1 pada
M. acuminata var. malaccensis (Tabel 3). Ketiga sekuen fragmen ini telah
dideposit ke Genbank dengan nomor akses KP691062-KP691064.
Tabel 3 Sequence identity antara sekuen prediksi asam amino tanaman pisang
Musa acuminata var. malaccensis dan Musa, AAA, sub-kelompok
Cavendish dengan protein ketahanan penyakit Musa yang telah dideposit
pada GenBank.
Fragmen

No aksesi

Aksesi Genbank

P5-8

KP691062

P5-10

KP691063

P5-11

KP691064

Disease resistant protein
RPS2 like (M. acuminata
subsp.malaccensis)
Predicted:
disease
resistance protein RPM1
like (M. acuminata subsp
malaccensis)
Predicted:
disease
resistance protein RPM1
like
(M.
acuminata
subsp.malaccensis)

Query
coverage
66%

E
value
3e-108

Identity

Aksesi

97%

XM009
418398

98%

0.0

99%

XM009
419073

99%

0.0

100%

XM009
419073

Hasil penelitian Sun et al. (2010), dari 20 Resistance Gene Analog (RGA)
yang berhasil diisolasi dari pisang Goldfinger (AAAB), prediksi asam aminonya
berbagi homologi 28-54% dengan gen yang telah diketahui yaitu Fom2, I2C1,
I2C2 dan I2. Agustine dan Joseph (2014) mengisolasi fragmen 517 bp dari pisang
AAB cv. Nendran menunjukkan homologi 97-99% dengan protein NBS-LRR
varietas Musa. Sedangkan Sutanto et al. (2014), mendapatkan 17 fragmen yang
berhasil diisolasi dan menunjukkan homologi 91,7-98,8% dengan protein
ketahanan penyakit NBS-LRR pada M. acuminata var. malaccensis, grup AAA,
AAB dan ABB.
Ketiga sekuen dilakukan BLAST pada Musa Genome (http://bananagenome.cirad.fr), hasilnya menunjukkan ketiga sekuen memiliki coverage > 90%
dan terdapat pada kromosom nomor 9 (Tabel 4 dan Gambar 7). Fragmen P5-8
memiliki kesamaan dengan disease resistance protein putatif RPS2, sedangkan
P5-10 dan P5-11 memiliki kesamaan dengan disease resistance protein putatif

12
RPM1 dengan persentase coverage berturut-turut 92,76%, 96,68% dan 97,11%.
Jarak antara lokus RPS1 dan RPM2 yaitu 0.156 Kbp
Tabel 4 BLAST di Musa genome
Fragmen

%coverage

Locus
ID

Chro
mosom

P5-8
(KP691062)

92.76

GSMUA_Ach
r9P02520_001

9

Jarak
lokus
(Kbp)
2.616

P5-10
(KP691063)

96.68

GSMUA_Ach
r9P12800_001

9

2.772

P5-11
(KP691064)

97.11

GSMUA_Ach
r9P12800_001

9

2.772

Fungsi

Putative
disease
resistance protein RPS2
complete
Putative
disease
resistance
protein
RPM1 complete
Putative
disease
resistance
protein
RPM1 complete

Pada penelitian Li et al. (2012), peningkatan ekspresi gen pada Cavendish
cv. Nongke no.1 terjadi pada komplek protein RPM1/RIN4. Pada Arabidopsis
thaliana, RPM1 terkait dengan ketahanan terhadap Pseudomonas syringae yang
mengekspresikan avrRPM1 atau avrB (Boyes et al. 1998). AvrB dan AvrRPM1
menyebabkan hiperfosforilasi RPM1 yang saling berinteraksi dengan protein4
(RIN4) (Torres et al. 2006). Penghambatan ekspresi RIN4 oleh efektor yang belum
diketahui dari F. oxysporum f.sp. cubense TR4 akan mengaktifkan jalur RPS2.

RPS2
A
B

RPM1

A. Lokus RPS2
B. Lokus RPM1
(http://banana-genome.cirad.fr)
Gambar 7 Kromosom pisang

13
Analisis pensejajaran sekuen dan filogenetik prediksi asam amino
dengan protein RGA dan gen-R tanaman lain.
Hasil analisis konsensus prediksi asam amino dari ketiga fragmen dengan
protein NBS-LRRtanaman pisang serta gen-R tanaman lain yang telah dideposit
di Genbank menunjukkan terdapat empat struktur konservatif NB-ARC yang
merupakan ciri khas daerah NBS. Keempat struktur konservatif asam amino yaitu
motif P-loop/kinase-1a (GGVGKTT), kinase-2 (LVLDDIW), RNBS-B/kinase-3a
(CKVLFTTRS) dan asam amino hidrofobik (hydrophobic domain) (GLPL)
(Gambar 8).
A
10
20
30
40
50
60
70
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NBS-LRR_Musa_balbisiana
--GGVGKTTLLKTLNNELK-ENTRDYHVVIMI---EVANSETLNVV--DMQKIIA-N------RLGLPWN 55
NBS-LRR_Musa_AAB_Group
---GLGKTTLAQQAYNHER--VKDYFQHEVWVCV.SDNFNVERLTKE--IIESITE-N------KCDLS--54
NBS-LRR_Musa_laterita
-MGGVGKTTLAQQAYNHER--VQDYFQHEVWVCV.SDNFNVERLTKE--IIESITE-N------KCDLS--56
NBS-LRR_Musa_ABB_Group
-MGGVGKTTLAQQAYNPER--VKDYFHHKVWVCV.SDNFNVERLSKE--IIESITE-N------KCDLS--56
NBS-LRR_Musa_textilis
GMGGVGKTTLAQQAYNHER--VQDYFHPKVWLCV.SDNFNVERLTKD--IIESITE-N------KCDLS--57
NBS-LRR_Musa_schizocarpa
GMGGVGKTTLAQQAYNHER--VKDYFHXKVWVCV.SDNFNVERFTKE--IIESLTR-K------RCDLN--57
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._miGMGGVGKTTLAQQAYNHER--VKDYFHPKVWLCV.SDNFNVERLTKD--IVESITE-E------KCDLS--57
NBS-LRR_Musa_acuminata_AAA_GroGMGGVGKTTLAQQAYNHAR--VQDCFQLKVWVCV.SDNFNVERLTKE--IIESLTR-N------TCDLN--57
NBS-LRR_Musa_banksii
GMGGVGKTTLAQQAYNHER--VKDYFHPKVWLCV.SDNFNVERLTKE--IIESLTR-N------KCDLN--57
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._siGMGGVGKTTLAQQAYNHER--VKDYFHHKVWVCV.SDNFNVERLTKE--IIESLTR-N------KCDLN--57
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._erGMGGVGKTTLAQQAYNHES--VKDYFQHEVWVCV.SYNFNVERLTKE--IIESITE-N------KCDLS--57
NBS-LRR_Musa_velutina
GMGGVGKTTLAQQAYNNER--VKDYFYHKVWVCV.SDNFNVERLTKE--IRESLTR-N------TCDLN--57
NBS-LRR_Musa_ornata
GMGGVGKTTLAQFVYNDAT--VRKHFELKIWVCV.SDSFDVKRLTKE--IIESVTNEK------QSDLM--58
NBS-LRR Musa_acuminata_subsp.C--GGVGKTTLLKTLNNELK-ENTRDYHVVILI---EVANSETLNVV--DMQKIIA-N------RLGLPWN 55
NBS-LRR Klutuk_Wulung(NBS1)
--GGVGKTTLLKTLNNELK-ENTRDYHVVIMI---EVANSETLNVV--DMQKIIA-N------RLGLPWN 55
NBS-LRR Musa_acuminata_cult Re--GGVGKTTLLKTLNNELK-ENTRDYHVVIMI---EVANSETLNVV--DMQKIIA-N------RLGLPWN 55
P5-11
--GGVGKTTLVTRVYRDRA--ILSHFSCRAWVFVSQNYNIDDLLRK--ILRALLQ-E------RMEEAAD 57
P5-10
--GGVGKTTLVTRVYRDRA--ILSHFSCRAWVFVSQNYNVDDLLRK--ILRALLQ-E------RMEEAAD 57
P5-8
--GGVGKTTLLSRFHNEFL-ADATHLDVVIFMDACRGLGVDRIQRM-------IG-D------RLGLSRK 53
RPM1_Musa_acuminata_var._malacGMGGVGKTTLVTRVYRDRA--ILSHFSCRAWVFVSQNYNIDDLLRK--ILRALLQ-E------RMEEAAD 59
RPS2_Musa_acuminata_var._malacGMGGVGKTALLSRFHNEFL-ADATHLDVVIFIDACRGLGVDRIQRM-------IG-D------RLGLSRK 55
BS2_Capsicum_chacoense
GMGGIGKTTLAKEVYNDES--ILCRFDVHAWATISQQHNKKEILLG--LLHSTIKMDD-----RVKMIGE 61
FOM-2_Cucumis_melo
GMGGLGKTTLAKLVFSHEL--VRQHFDKTVWVCV.SEPFIVNKILLD--ILQSL----------KGGISNG56
I2_Solanum_lycopersicum
GMGGQGKTTLAKAVYNDER--VKNHFDLKAWYCV.SEGFDALRITKE--LLQEIGKFD------SKDVHN-59
Saccharum_hybrid_N11
--GGVGKTTLTQLIYNDER--VKEHFQLRVWLCV.SENFDEMKLTKE--TIESVAS--------GFSSATT56
Gpa2_Solanum_tuberosum
GMGGIGKTTLAAKLYSDPY--IMSRFDIRAKATVSQEYCV.RNVLLG--LLSL-----------TSDEPDY55
Theobroma_cacao
GRGGVGKTTLAQLVYTDSN--IRDHFDLKAWVCV.SHEFDVIKITKT--ILESVTF-L------PCDIT--57
Triticum_aestivum
- -GGVGKTTLTQLVYNDTR--IKEHSQLRVWLCV.SENFDQMKLTKE--PIESVAS-EFGSTIIGVSSVTT63
RXO1_Zea_mays
GMGGVGKSTLVNNVYKNE----GSNFDCRAWVSISQSYRLEDIWKK--MLTDLIGKD------KIEF--- 55
N_Nicotiana_glutinosa
GMGGVGKTTIARAIFDTLLGRMDSSYQFDGACFLKDIKENKRGMHS--LQNALLS-E------LLREKA- 60
RPS4_Arabidopsis_thaliana
GMPGIGKTTLLKELYKTWQGKFSRHALIDQIRVKSKHLELDRLPQM--LLGEL---S------KLNHP-- 57
RPP4_Arabidopsis_thaliana
GQSGIGKSTIGRALFSQLS----SQFHHRAFITYKSTSGSDVSGMKLSWEKELLS-E------ILGQK-- 57
P2_Linum_usitatissimum
GMGGVGKTTLAEACYERVT-SSNKGIKHLFVRNVNEICEKHHGVEK--IVHKLYS-K------LLDEN-- 58
RPP5_Arabidopsis_thaliana
GQSGIGKSTIGRALFSQLS----SQFHHRAFLTYKSTSGSDVSGMKLSWQKELLS-E------ILGQK-- 57

B

C

80
90
100
110
120
130
140
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NBS-LRR_Musa_balbisiana
-ESETERER--STFLRRALRRKKFVVLLDDVWKKF-----QLADV--GIPTPSSD---NGCKLIVASRSN 112
NBS-LRR_Musa_AAB_Group
-NLDTLQVV-----LKKNLTSKRFLLVLDDVWNEDSL---KWGRF--CAPLRYGE---PGSKILITTRSK 110
NBS-LRR_Musa_laterita
-NLDTLQVV-----LKKNLTSKRFLLVLDDVWNEDSL---KWERF--CAPLRYGE---PGSKILVTTRSK 112
NBS-LRR_Musa_ABB_Group
-NLDTLQVV-----VKKKLTSKRFLLVLDDVWNEDSL---KWERF--CAPLRYGE---PGSKILVTTRSK 112
NBS-LRR_Musa_textilis
-NLDTLQVV-----VKKKLTSKRFLLVLDDVWNEDSL---KWERF--CAPLRYGE---QGSKILVTTRSR 113
NBS-LRR_Musa_schizocarpa
-NFDTLQVE-----VKEKLTSKRFLLVLDDVWNEDSL---KWERF--CAPLRYGE---PGSKILVTTRSK 113
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._micNLDTLQVV-----VKKKLTSKRFLLVLDDVWNEDGL---KWERF--CASLRYGE---QGSKILVTTRSK 113
NBS-LRR_Musa_acuminata_AAA_Gro-NFDTLQVV-----VKEKLTSKRFLPVLDDVWSEDSL---KWERF--CAPLKHGE---PGSKILVTTRSK 113
NBS-LRR_Musa_banksii
- FDTLQVI-----VKDMLTSKRFLLVLDDVWDEDGL---KWERF--CASLRYGE---QGSKILVTTRSK 113
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._siaNFDTLQVV-----VKEELTSKRFLLVLDDVWNEDSL---KWERF--CAPLRYGV---PGSKILVTTRSE 113
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._errNLDTLQVV-----LKKNLTSKRFLLVLDDVWNEDSL---KWERF--CAPLRYGE---PGSKILVTTRSK 113
NBS-LRR_Musa_velutina
-NFDTLQVE-----VKEALTSKRFLLVLDDVWSEDSL---KWERF--CAPLKYGE---PGSKILVTTRSK 113
NBS-LRR_Musa_ornata
-NLDTLQVI-----LKVKIASKRFLLVLDDVWSVDTHDMDEWQKL--CAPLRFGA---RGSMVMVTTRDL 117
NBS-LRR Musa_acuminata_subsp.C-ESETERER--STFLRRALRRKKFVVLLDDVWKKF-----QLADV--GIPTPSSD---YGCKLILASRSN 112
NBS-LRR Klutuk_Wulung(NBS1)
-ESETERER--STFLRRALRRKKFVVLLDDVWKKF-----QLADV--GIPTPSSD---NGCKLIVASRSN 112
NBS-LRR Musa_acuminata_cult Re-ESETERER--STFLRRALKRKKFVVLLDDVWKKF-----QLADV--GIPTPSSD---NGCKLILASRSN 112
P5-11
-DFDSMEYRRLVEALRAHLDRQRYLIVLDDVWQVS-----IWTDI--SYALLANS---CRSRVVITTRMQ 116
P5-10
-DFDSMEYRRLVEALRAHLDRQRYLIVLDDVWQVS-----IWTDI--SYALLANS---CRSRVVITTRMQ 116
P5-8
-NRGSQEEK--AATLFRVLNKMRFVLILDGVCRSL-----DLRMV--GVPIPKRR---SKCKIVLATRNE 110
RPM1_Musa_acuminata_var._malaccDFDSMEYRRLVEALRAHLDRQRYLIVLDDVWQVS-----IWTDI--SYALLANS---CRSRVVITTRMQ 118
RPS2_Musa_acuminata_var._malaccNRGSQEEK--AATLFRVLNKMRFVLILDGVCRSL-----DLRTV--GVPIPKRR---SKCKIVLATRNE 112
BS2_Capsicum_chacoense
AELADM--------LQKSLKRKRYLIVLDDIWSCE-----VWDGVRRCFPTE-DN---AGSRILLTTRND 114
FOM-2_Cucumis_melo
GDSKEVLLR----ELQKEMLGQTYFLVLDDVWNENSF---LWGELKYCLLKITGN---SKNSIVVTTRSA 116
I2_Solanum_lycopersicum
-NLNQLQVK-----LKESLKGKKFLIVLDDVWNENYN---EWNDL--RNIFAQGD---IGSKIIVTTRKD 115
Saccharum_hybrid_N11
-NMNLLQED-----LSKKLQGKRFLLVLDDVWNEDPE---KWDRY--RCALVSGG---KGSKIIITTRNK 112
Gpa2_Solanum_tuberosum
Q-LADQ--------LQKHLKGRRYLVVIDDIWTTE-----AWDDI--KLCFPDCD---NGSRILLTTRNV 106
Theobroma_cacao
-DLNLLQFK-----LKEKLSRKKFLFVLDDVWTENYN---DWMRL--RSPFDAGI---SGSKIIITTRSS 113
Triticum_aestivum
-NMNLLQED-----LSKKLKDKRFLLVLDDVWNEDPE---KWGTY--RSALLTGG---KGSRIVVTTRNK 119
RXO1_Zea_mays
-DLGTMDSAELREQLTKTLDKRQYLIILDDVWMAN-----VFFKI--KEVLVDNG---LGSRVIITTRIE 114
N_Nicotiana_glutinosa
-NYNNEEDG--KHQMASRLRSKKVLIVLDDIDNKDH----YLEYL--AGDLDWFG---NGSRIIITTRDK 118
RPS4_Arabidopsis_thaliana
-HVDNLKDP------YSQLHERKVLVVLDDVSKREQI--DALREI--LDWIKEGK---EGSRVVIATSDM 113
RPP4_Arabidopsis_thaliana
-DIKIDHFG----VVEQRLKHKKVLILLDDVDNLE-----FLKTL--VGKAEWFG---SGSRIIVITQDK 112
P2_Linum_usitatissimum
-NIDREDLN--IGYRRERLSRSRVFVVLDNVETLE-----QLEQLALGYVFNLSKVFAAGSRIIITTRNK 120
RPP5_Arabidopsis_thaliana
-DIKIEHFG----VVEQRLNHKKVLILLDDVDNLE-----FLKTL--VGKAEWFG---SGSRIIVITQDR 112

14
D
150
160
170
180
190
200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
NBS-LRR_Musa_balbisiana
QVCV.EMGDKEPMEMPCLNENESLRLFRSNLMAEVSAAIDHDSDMRESAMDIIQSCGGLPLSP-- 174
NBS-LRR_Musa_AAB_Group
MIAEMVG---NPIPLGGLDETSYWKLFKKCAF--GSEDEGEFPQLEAIAKKIAGRLKGLPLAAK- 169
NBS-LRR_Musa_laterita
NVFENGW---NPIPLGGLDEASYWKLFKKCAF--GSEDAGEFPHLE------------------- 153
NBS-LRR_Musa_ABB_Group
KIAEMVG---NPFPLGGLDEASYWKLFKKCAF--GSEYAGE------------------------ 148
NBS-LRR_Musa_textilis
KIADMVG---NPIPLDGLDEASYWKLFKKCAF--GSEDVGEFPQLEAIAGMIVGRLKGLPLAAR- 172
NBS-LRR_Musa_schizocarpa
KIAEMVG---NPIPLGGMAGASYWKLFKKCAF--GSEDAGEFPHLEAIAKKIAGRLKGLPLAAK- 172
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._miKIAEMVG---KPIPLGGLDEASYWEFFKKCAF--GSEDAGEFPQLEAIAKKIAGRLKGLPLAAK- 172
NBS-LRR_Musa_acuminata_AAA_GroKIADMFG---NPFPLDGLDDASYWEFFKQCAF--GSEYAGECPQLEAIAKKIAYRLNGLPLAAK- 172
NBS-LRR_Musa_banksii
KIAEMVG---KPIPLGGLDEASYWEFFKKCAF--GSEDAGEFPQLEAIAKKIAGRLKGLPLAAK- 172
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._siKIAEMVG---NRIHLGGLDEASYWKLFKKCAF--GSEDAGEFPQLEAIAKKVVGRLKAFPSLQR- 172
NBS-LRR_Musa_acuminata_var._erKIAEMVG---NPIPLGGLDEASYWKLFKECAF--GSEDAGEFPQLEAIAKKIAGRLKGLPLAAK- 172
NBS-LRR_Musa_velutina
KIADMVG---NPFPLDGLDDASYWEFFKQCAF--GSEYAGECPQLEAIAKKIAYRLNGLPLAAK- 172
NBS-LRR_Musa_ornata
RIASIVG-TMKEILLEGLEDDDYWELFKKCAF--GSLNPKEHPELEAIGRKIAGKLKAYPSLQR- 178
NBS-LRR Musa_acuminata_subsp.CQVCV.EMGDKEPMEMPCLGDNESLRLFRSNL