Pemurnian dan Karakterisasi Pektinase dari Aspergillus ustus BL5
PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI PEKTINASE DARI
Aspergillus ustus BL5
FITRIA DEWI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ii
ABSTRAK
FITRIA DEWI. Pemurnian dan Karakterisasi Pektinase dari Aspergillus ustus BL5.
Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan YOPI.
Pektinase merupakan enzim ekstraseluler yang mampu mendegradasi senyawa pektin,
karena mempunyai aktifitas memecah polimer pektin menjadi molekul-molekul yang lebih
sederhana seperti asam galakturonat dan asam pektinat. Genus Aspergillus diketahui memproduksi
metabolit sekunder dan enzim ekstraseluler seperti hemiselulase, selulase dan pektinase. Pektinase
bermanfaat dalam industri sari buah dan minuman anggur, fermentasi daun teh serta industri tekstil
dan kertas. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan pemurnian dan karakterisasi pektinase
ekstraseluler dari Aspergillus ustus BL5. Hasil percobaan menunjukkan bahwa Aspergillus ustus
BL5 memiliki waktu produksi tertinggi pada konsentrasi substrat 2% dan pH 7, dengan waktu
inkubasi jam ke-120 memiliki aktivitas spesifik sebesar 0,6 U/mg. Pemurnian pektinase dengan
PEG 6000 dan ultrafiltrasi dilanjutkan dengan kromatografi filtrasi gel Sephadex G-75
menghasilkan aktivitas spesifik 4,14 U/mg, serta kemurniannya meningkat 6,94 kali dibandingkan
dengan ekstrak kasarnya. Pektinase ekstraseluler dari Aspergillus ustus BL5 yang telah dimurnikan
memiliki aktivitas optimum pada suhu 500 C dan pH 5. Penambahan 0,05 mM CuSO4 dapat
meningkatkan aktivitas enzim sebesar 163%.
Kata kunci : Pektinase, Aspergillus ustus BL5, pemurnian dan karakterisasi
ABSTRACT
FITRIA DEWI. Purification and Characterization of Pectinase from Aspergillus ustus BL5.
Under direction of ANJA MERYANDINI and YOPI.
Pectinase, an extracellular enzymes that degrades pectin to galacturonic acid and pectinat
acid. Aspergillus has been reported as a fungi that can produce secondary metabolite and
extracellular of enzymes such as hemiselulase, selulase and pectinase. Pectinase plays a vital role
in processing industries such as in the production of fruit juice, in fermentation tea leaves and used
also at paper and textile industry. This study aimed to purify and characterize the extracellular
pectinase from Aspergillus ustus BL5. Extracellular pectinase showed optimum activity with 2%
substrate concentration and pH 7, in 120 hours of incubation time with 0,6 U/mg specific activity.
The crude enzyme was concentrated with PEG-6000 and ultrafiltration. The crude enzyme of
pectinase was purified using Sephadex G-75 gel filtration chromatography. The partial purified
enzyme has specific activity 4,14 U/mg. The purity had increase 6,94 than crude enzymes. The
optimum temperature and pH were 500 C and 5. The Addition of 0.05 mM CuSO4 can increased
enzyme activity to 163.87%.
Key word : Pectinase, Aspergillus ustus BL5, purification and characterization
iii
PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI PEKTINASE DARI
Aspergillus ustus BL5
FITRIA DEWI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Program Studi Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
iv
Judul Skrispi : Pemurnian dan Karakterisasi Pektinase dari Aspergillus ustus BL5
Nama
: Fitria Dewi
NIM
: G34080081
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
(Prof. Dr. Anja Meryandini)
NIP 196203271987032001
(Dr. Yopi)
NIP 196912201989011001
Mengetahui:
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
(Dr. Ence Darmo Jaya Supena)
NIP 196410021989031002
Tanggal Lulus :
v
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia dan hidayah-Nya
sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Laporan ini berisi tentang kegiatan penelitian yang
berjudul “Pemurnian dan Karakterisasi Pektinase dari Aspergillus ustus BL5”. Penelitian ini
dilaksanakan selama bulan Februari-Juni tahun 2012 di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi,
Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI).
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Prof. Dr. Anja Meryandini dan Bapak Dr.
Yopi selaku pembimbing atas saran dan bimbingannya. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr.
Sulistijorini selaku penguji atas saran dan bimbingannya. Terima kasih penulis ucapkan kepada
peneliti dan staf di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Pusat Penelitian Bioteknologi,
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Mbak Nanik Rahmani, Mbak Ade Andriani, Mbak
Camelia, Mas Alex Prima dan Mas Dicky atas bantuannya selama pelaksanaan penelitian ini.
Terima kasih kepada keluarga tercinta Papah, Mamah, dan Patra atas doa, dukungan dan kasih
sayangnya. Terimakasih kepada Mas Indra atas dukungan dan perhatian yang telah diberikan.
Terima kasih kepada teman-teman di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi Mas Ashif, Widyo,
Ana, Yufi, Yana, Viska, Titi serta Ayi dan teman-teman Biologi 45 atas dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, November 2012
Fitria Dewi
vi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Kuningan pada tanggal 8 Desember 1989 dari ayah Beni Wijaya dan ibu
Eti Rostiati. Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara. Tahun 2008 penulis lulus dari
SMA Negeri 1 Sumber, Cirebon dan pada tahun yang sama diterima masuk di Program Studi
Biologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Ekologi Dasar pada tahun
ajaran 2011/2012 dan 2012/2013. Penulis aktif di organisasi kemahasiswaan yaitu sebagai staf
Dewan Perwakilan Mahasiswa (DPM), staf Kementrian Kebijakan Pertanian Badan Eksekutif
Mahasiswa Keluarga Mahasiswa (BEM KM) dan ketua divisi Biosains Himpunan Mahasiswa
Biologi (HIMABIO). Penulis melaksanakan Praktik Lapang (PL) di Bidang Sarana Bioproses
Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong periode Juli
sampai Agustus 2011. Penulis mendapatkan beberapa penghargaan prestasi akademik, diantaranya
adalah Program Kreativitas Mahasiswa di Bidang Penelitian didanai oleh DIKTI pada tahun 2010,
peserta Pelayaran Kebangsaan Ilmuwan Muda (PKIM) Pulau Bangka yang diselenggarakan oleh
Pusat Penelitian Oseanografi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) pada tahun 2011 dan
mendapatkan medali perak Program Kreativitas Mahasiswa Bidang Pengabdian Masyarakat
Pekan Ilmiah Mahasiswa Tingkat Nasional (PIMNAS) XXIV tahun 2012 di Universitas
Hassanudin Makasar.
Bogor,
November 2012
Fitria Dewi
vii
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..........................................................................................................................viii
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................................viii
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................................................... 8
PENDAHULUAN............................................................................................................................. 1
Latar Belakang .............................................................................................................................. 1
Tujuan ........................................................................................................................................... 1
Waktu dan Tempat ........................................................................................................................ 1
BAHAN DAN METODE ................................................................................................................. 1
Isolat Kapang ................................................................................................................................ 1
Penentuan Waktu Produksi Tertinggi ........................................................................................... 1
Pemekatan dengan Polietilen Glikol 6000 dan Ultrafiltrasi .......................................................... 2
Kromatografi Filtrasi Gel .............................................................................................................. 2
Analisis Elektroforesis SDS-PAGE .............................................................................................. 2
Pengaruh Suhu, pH dan Bahan Kimia .......................................................................................... 2
HASIL ............................................................................................................................................... 3
Penentuan Waktu Produksi Tertinggi ........................................................................................... 3
Pemekatan dengan Polietilen Glikol 6000 dan Ultrafiltrasi .......................................................... 3
Kromatografi Filtrasi Gel .............................................................................................................. 3
Analisis Elektroforesis SDS-PAGE .............................................................................................. 4
Pengaruh Suhu, pH dan Bahan Kimia .......................................................................................... 4
PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 4
Penentuan Waktu Produksi Tertinggi ........................................................................................... 5
Pemurnian Pektinase ..................................................................................................................... 5
Karakterisasi Pengaruh Suhu, pH dan Bahan Kimia .................................................................... 6
SIMPULAN ...................................................................................................................................... 7
SARAN ............................................................................................................................................. 7
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 7
viii
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Tahapan pemurnian enzim pektinase............................................................................... 4
2 Pengaruh penambahan bahan kimia terhadap aktivitas enzim......................................... 4
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Aktivitas pektinase Aspergillus ustus BL5 pada berbagai konsentrasi
substrat pH 7 suhu ruang................................................................................................ 3
2 Pengaruh pH media terhadap pertumbuhan Aspergillus ustus BL5 pada
konsentrasi substrat 2% dan suhu ruang............................................................................ 3
3 Kromatogram dari kolom filtrasi gel ...............................................................................3
4 Pola protein pada gel akrilamid hasil SDS-PAGE ........................................................ 4
5 Pengaruh suhu terhadap aktivitas pektinase dari Aspergillus ustus BL5
pada media pektin 2% dan pH 7....................................................................................... 4
6 Pengaruh pH terhadap aktivitas pektinase dari Aspergillus ustus BL5
pada media pektin 2% dan suhu 500 C............................................................................ 4
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Perhitungan aktivitas pektinase........................................................................................ 10
2 Prosedur pembuatan reagen yang digunakan dalam penelitian........................................ 10
3 Kurva standar asam galakturonat..................................................................................... 11
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Enzim merupakan salah satu produk
industri yang mempunyai nilai ekonomi cukup
tinggi di pasaran dunia saat ini. Sifat protein
enzim sangat menarik untuk digunakan sebagai
biokatalis. Enzim dapat diperoleh dari jaringan
hewan, tanaman, dan mikroorganisme. Namun
dari segi teknis dan ekonomi, enzim dari
mikroorganisme
memiliki
keunggulan
diantaranya enzim dapat diproduksi dalam
jumlah besar dengan mutu yang lebih seragam
(Jayani et al. 2005).
Enzim merupakan protein, beberapa enzim
memerlukan adanya komponen non-protein
yang disebut kofaktor. Tanpa kehadiran
kofaktor enzim tersebut berkurang aktivitas
katalitiknya. Pada kasus ini, bagian protein
yang tanpa kofaktor disebut apoenzim.
Kofaktor dapat berupa molekul organik,
sehingga enzim disebut koenzim, atau kofaktor
dapat berupa ion logam. Keseluruhan enzim
disebut holoenzim (Plamer 1991).
Salah satu mekanisme kerja enzim adalah
dengan memecah struktur substrat menjadi
suatu produk atau beberapa produk. Substrat
untuk enzim bersifat spesifik. Pektin
merupakan substrat bagi enzim pektinase.
Pektin merupakan suatu polisakarida
komplek yang terdapat di dalam lamela tengah
atau ruang antar sel dari jaringan tanaman
tingkat tinggi. Selain itu pektinase juga
dihasilkan dari bakteri dan fungi. Pektin terdiri
atas galakturonan dan rhamnogalakturonan.
Pektinase merupakan enzim ekstraseluler yang
mampu mendegradasi senyawa pektin menjadi
molekul-molekul yang lebih sederhana seperti
asam galakturonat (Rashad et al. 2011) dan
asam pektinat (Winarno 2010).
Enzim pektinase merupakan enzim yang
telah banyak digunakan untuk proses industri.
Sebagian besar pektinase diproduksi oleh fungi
(Panda et al. 2004). Genus Aspergillus
diketahui memproduksi metabolit sekunder
dan enzim ekstraseluler seperti hemiselulase,
selulase, dan pektinase.
Aspergillus merupakan kapang yang
bereproduksi secara aseksual. Aspergillus
menghasilkan spora ketika mendapatkan media
dan kondisi lingkungan yang sesuai.
Organisme ini mensekresikan enzim ke
lingkungan, memecah molekul menjadi lebih
sederhana dan kemudian mengabsorbsinya
kembali. Mikroorganisme ini memiliki
karakteristik membentuk koloni berbentuk
circular, sel berbentuk bulat berwarna abuabu, dan hifa bersepta (Bennett 2010).
Pektinase memiliki nilai komersial dalam
industri sari buah dan minuman anggur (Panda
et al. 2004), fermentasi daun teh
(Angayarkanni et al. 2002) serta industri tekstil
dan kertas (Kashyap et al. 2000). Spesies yang
biasa digunakan adalah Aspergillus niger
untuk industri pangan (Jayani et al. 2005).
Mikroorganisme lain yang telah diketahui
dapat
memproduksi
pektinase
yaitu
Aspergillus japonicus (Ishii & Yakotsuka
1975), Aspergillus oryzae (Lim et al. 1983),
Aspergillus flavus (Yadav 2008), Neurospora
crassa (Polizeli et al. 1991) dan Penicillium
chrysogenum (Banu et al. 2010).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan melakukan
pemurnian dan karakterisasi pektinase dari
Aspergillus ustus BL5. Hasil penelitian ini
diharapkan dapat memberikan informasi
ilmiah mengenai potensi Aspergillus ustus BL5
sebagai penghasil pektinase ekstraseluler serta
memberikan karakteristik pektinasenya.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Februari sampai dengan bulan Juni 2012
bertempat di Laboratorium Biokatalis dan
Fermentasi, Pusat Penelitian Bioteknologi,
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI).
Isolat Kapang
Isolat yang digunakan adalah Aspergillus
ustus BL5 koleksi Biotechnology Culture
Collection (BTCC) LIPI.
Penentuan Waktu Produksi Tertinggi
Konsentrasi substrat pektin yang digunakan
adalah 0,5; 1; 1,5; 2 dan 2,5%. Nilai pH yang
digunakan adalah 5, 6, 7, 8 dan 9. Sebanyak 1
mata ose Aspergillus ustus BL5 yang berumur
15 hari diinokulasikan pada 3 mL media
prekultur dengan komposisi (NH4)2PO4 0,3%;
KH2PO4 0,2%; K2HPO4 0,3%; MgSO4.7H2O
0,01%. Kemudian media prekultur diinkubasi
dan diagitasi pada suhu ruang selama 2 hari.
Media prekultur yang berisi isolat dipindahkan
ke dalam 97 mL media kultur dengan
komposisi yang sama, kemudian dilakukan
sampling setiap 24 jam sekali. Sampel
disentrifugasi 2 kali pada kecepatan 11.000
rpm selama 15 menit suhu 40 C. Supernatan
diambil kemudian disimpan dalam ruang
pendingin pada suhu 40 C. Uji aktivitas enzim
pektinase dilakukan dengan mencampur 0,25
2
mL substrat pektinase dengan 0,25 mL enzim
pektinase lalu diinkubasi selama 30 menit pada
suhu ruang. Reaksi dihentikan dengan
penambahan 0,75 mL reagen dinitrosalisilat
(DNS). Perlakuan kontrol dilakukan dengan
mereaksikan substrat dengan DNS lalu
ditambahkan enzim. Perlakuan blanko
dilakukan dengan mereaksikan 0,75 mL DNS
dengan 0,5 mL 0,01 M bufer sitrat pH 5.
Kemudian sampel, kontrol dan blanko
dididihkan selama 15 menit pada suhu 1000 C
lalu didinginkan. Setelah dingin sampel diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 540
nm (Miller 1959).
Satu unit aktivitas enzim pektinase
didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang
dapat memproduksi 1 µmol pektin dalam 1
menit. Pembuatan kurva standar dilakukan
dengan berbagai konsentrasi asam galakturonat
10-1.000 ppm direaksikan dengan 0,75 mL
DNS lalu dididihkan selama 15 menit pada
suhu 100 0C lalu didinginkan. Setelah dingin
sampel diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 540 nm.
Pemekatan dengan Polietilen Glikol 6000
dan Ultrafiltrasi
Sebanyak 80 mL enzim ekstrak kasar
dimasukkan ke dalam membran dialisis
kemudian ditaburi dengan PEG-6000 selama
semalam di ruang pendingin. Enzim yang
tersisa di dalam membran didialisis selama 6
jam dengan 0,01 M bufer sitrat pH 5 di dalam
ruang pendingin dan diaduk dengan batang
pengaduk. Kemudian enzim dipekatkan
kembali dengan cara ultrafiltrasi menggunakan
sentricon
Corning
Spin-X.
Sampel
disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 rpm,
suhu 40 C selama 15 menit.
Kromatografi Filtrasi Gel
Matriks Sephadex G-75 dikembangkan
dengan cara 10 g matriks direndam dalam 200
mL 0,01 M bufer sitrat pH 5, diaduk perlahan
dengan
batang
pengaduk,
kemudian
dipanaskan pada suhu 900 C selama 2 jam.
Setelah dingin matriks Sephadex G-75
disimpan pada ruang pendingin selama
semalam.
Dekantasi
dilakukan
untuk
menghilangkan serbuk yang terapung.
Pektinase yang dimurnikan sebanyak 1 mL dan
dimasukkan ke dalam kolom yang berdiameter
2 cm dan tinggi 18,5 cm. Matriks Sephadex G75 dielusi dengan 0,01 M bufer sitrat pH 5
dengan kecepatan 1 mL/menit. Volume fraksi
yang ditampung masing-masing sebanyak 1
mL. Fraksi yang dikumpulkan ada 100
microtube dan kadar protein masing-masing
microtube diukur menggunakan panjang
gelombang 280 nm. Aktivitas pektinase setiap
fraksi diukur dengan metode DNS.
Analisis Elektroforesis SDS-PAGE
Elektroforesis protein dengan SDS-PAGE
menggunakan gel pemisah 10% poliakrilamida
dan gel penahan 4% poliakrilamida. Ke dalam
tabung mikro dimasukkan 20 µl sampel protein
dan 5µl bufer sampel. Campuran dipanaskan
dalam air mendidih selama 10 menit. Sampel
dimasukkan ke dalam sumur gel penahan
menggunakan siring. Selanjutnya piranti
elektroforesis dipasang dan 300 mL bufer
elektroforesis dituangkan ke dalam bejana
elektroforesis.
Proses
elektroforesis
berlangsung selama 4 jam pada tegangan 60
volt dan 30 mA. Gel hasil elektroforesis
dilepas dari cetakan dan jarak migrasi
bromfenol biru diukur dari batas atas gel
pemisah. Pewarnaan yang digunakan adalah
pewarna perak. Prosedurnya sebagai berikut:
gel direndam dalam larutan fiksasi (25% (v/v)
metanol dan 12% (v/v) asam asetat) selama
semalam kemudian direndam dalam 50% (v/v)
etanol selama 20 menit, kemudian diganti
dengan 30% (v/v) etanol selama 2 x 20 menit,
setelah dicuci direndam dalam larutan
enhancer selama 1 menit, kemudian dicuci
dalam aquabidest 3 x 20 detik. Larutan
diwarnai dengan pewarna silver selama 30
menit, kemudian dicuci dengan aquabidest 2 x
20 detik, setelah itu direndam dalam larutan
developer maksimal 10 menit, reaksi
dihentikan dengan larutan fiksasi.
Pengaruh Suhu, pH dan Bahan Kimia
Penentuan suhu optimum dilakukan dengan
cara menguji aktivitas pektinase dalam
berbagai kisaran suhu 300 C sampai dengan 800
C (selang 100 C) dengan waktu inkubasi 30
menit. Penentuan pH optimum dilakukan
dengan cara menguji aktivitas pektinase dalam
berbagai nilai kisaran pH 3 sampai pH 8
(selang 0,5) pada suhu optimumnya. Pengaruh
bahan kimia terhadap aktivitas enzim
dilakukan dengan cara menguji aktivitas
pektinase pada suhu dan pH optimumnya
dengan menambahkan bahan kimia masingmasing 0,05 mM EDTA (Ethylene diamine
tetraacetic acid), CaCl2, SDS (Sodium dodecyl
sulfate), DMSO (Dimethyl sulfoxide), dan
CuSO4. Pengaruh suhu, pH dan bahan kimia
terhadap aktivitas enzim dilakukan dengan tiga
kali pengulangan.
3
Pemekatan dengan Polietilen Glikol 6000
dan Ultrafiltrasi
Aktivitas enzim ekstrak kasar dari waktu
produksi tertinggi dapat ditingkatkan dengan
pemekatan PEG 6000 dan ultrafiltrasi dari 3,45
U/mL menjadi 5,77 U/mL.
HASIL
Kromatografi Filtrasi Gel
Hasil kromatografi (Gambar 3) dari tahap
pemekatan menunjukkan 2 puncak aktivitas
enzim. Puncak pertama yaitu dari fraksi nomor
9-13 memiliki aktivitas enzim pektinase ratarata 3,4 U/mL. Puncak kedua yaitu dari fraksi
nomor 26-30 memiliki aktivitas enzim
pektinase rata-rata 2,1 U/mL.
Tahapan pemurnian yang dilakukan dari
pemekatan dengan PEG 6000 dan ultrafiltrasi
serta kromatografi filtrasi gel (Tabel 1)
didapatkan bahwa total aktivitas mengalami
penurunan dari tahap enzim ekstrak kasar ke
tahap kromatografi filtrasi gel. Total protein
dari tahap enzim ekstrak kasar sampai
kromatografi filtrasi gel juga mengalami
penurunan dari 462 mg sampai 2,7 mg.
Aktivitas spesifik dari produksi ekstrak
kasar sampai kromatografi filtrasi gel terjadi
kenaikan dari 0,6 U/mg menjadi 4,15 U/mg
(Gel filtrasi I) dan 3,3 U/mg (Gel filtrasi II).
Tingkat kemurnian meningkat dari 1 menjadi
6,94 (Gel filtrasi I) dan 5,53 (Gel filtrasi II).
Perolehan (Recovery) mengalami penurunan
dari enzim ekstrak kasar 100%
ke
pengendapan PEG 6000 dan ultrafiltrasi
sebesar 50% serta mengalami penurunan yang
drastis pada tahap kromatografi filtrasi gel
puncak 1 menjadi 5,37% dan puncak 2
menjadi 3,33%.
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
24
48 72 96 120 144 168
Waktu Inkubasi (Jam)
Konsentrasi substrat (%)
1
1,5
2
0,5
2,5
Gambar 1 Aktivitas pektinase Aspergillus
ustus
BL5
pada
berbagai
konsentrasi substrat pH 7 suhu
ruang
0
24
5
Gambar
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
2
4
3
OD 280 nm
Aktivitas Enzim (U/mL)
Pengaruh pH media kultur terhadap
pertumbuhan Aspergillus ustus BL5 pada
konsentrasi substrat 2% dan suhu ruang dapat
dilihat pada gambar 2. Pertumbuhan
Aspergillus ustus BL5 dengan aktivitas
pektinase tertinggi dimiliki oleh media kultur
pH 7 dengan aktivitas pektinase ekstrak kasar
sebesar 3,45 U/mL. Pertumbuhan Aspergillus
ustus BL5 dengan aktivitas pektinase ekstrak
kasar terendah dimiliki oleh media kultur pH
5 dengan aktivitas sebesar 0,65 U/mL.
48
72
96
120 144 168
Waktu Inkubasi (Jam)
pH
6
7
8
Pengaruh pH media terhadap
pertumbuhan Aspergillus ustus BL5
pada konsentrasi substrat 2% dan
suhu ruang
2
1
0
0
9
Aktivitas Enzim (U/ml)
Aktivitas Enzim (U/mL)
Penentuan Waktu Produksi Tertinggi
Aktivitas pektinase dengan berbagai
konsentrasi substrat pH 7 pada suhu ruang
dapat dilihat pada gambar 1. Konsentrasi
substrat 2% pada waktu fermentasi jam ke-120
memiliki aktivitas pektinase ekstrak kasar
tertinggi sebesar 3,45 U/mL. Konsentrasi
substrat 2,5% memberikan aktivitas pektinase
terendah sebesar 1,26 U/mL.
5
10 15 20 25 30 35 40 45
Fraksi [Volume (ml)]
Protein
enzim
Gambar 3 Kromatogram dari kolom filtrasi gel
dengan matriks Sephadex G-75,
elusi menggunakan 10 mM bufer
sitrat pH 5, kecepatan alir 1
menit/mL
4
Tabel 1 Tahapan pemurnian enzim pektinase
Tahap Pemurnian
Total
Aktivitas
(Unit)
Total
Protein
(mg)
Aktivitas
Spesifik
(U/mg)
Tingkat
kemurnian
Recovery
(%)
Enzim Ekstrak kasar
PEG-6000 &
Ultrafiltrasi
Filtrasi gel puncak 1
276
462
0,6
1
100
138,48
81,6
1,7
2,8
50
14,83
3,57
4,15
6,94
5,37
Filtrasi gel puncak 2
9,21
2,78
3,3
5,53
3,33
Hasil percobaan menunjukkan bahwa
pektinase dari Aspergillus ustus BL5 yang
diinkubasi pada suhu 500 C memiliki pH
optimum pada pH 5 dengan aktivitas pektinase
sebesar 4,53 U/mL (Gambar 6). Nilai pH
optimum pada pH 5 menunjukkan bahwa
enzim ini termasuk enzim asam.
Aktivitas Enzim (U/ml)
Analisis Elektroforesis SDS-PAGE
Hasil elektroforesis SDS-PAGE (Gambar
4) menunjukkan bahwa enzim ekstrak kasar
(2) mempunyai pita protein yang banyak,
setelah pemekatan dengan PEG 6000 dan
ultrafiltrasi (3) pita protein menjadi semakin
jelas terlihat.
1
2 3 4
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8
pH
Gambar 4 Pola protein pada gel akrilamid hasil
SDS-PAGE (1 : Marker; 2 : Enzim
ekstrak kasar; 3 : Polietilen glikol
6000 dan ultrafiltrasi; 4 : Gel filtrasi
Sephadex G-75)
Aktivitas Enzim (u/ml)
Pengaruh Suhu, pH dan Bahan Kimia
Pektinase hasil pemurnian memiliki
aktivitas optimum pada suhu 500 C dengan
aktivitas sebesar 4,54 U/mL (Gambar 5).
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
30
40
50
60
70
80
Suhu (0C)
Gambar 5 Pengaruh suhu terhadap aktivitas
pektinase dari Aspergillus ustus
BL5 pada media pektin 2% dan
pH 7
Gambar 6 Pengaruh pH terhadap aktivitas
pektinase dari Aspergillus ustus
BL5 pada media pektin 2% dan
suhu 500 C
Penambahan bahan kimia juga dapat
meningkatkan aktivitas enzim pektinase
Aspergillus ustus BL5. Penambahan 0,05 mM
CuSO4 dapat meningkatkan aktivitas enzim
sampai 163% dengan aktivitas enzim 5,65
U/mL (Tabel 2).
Tabel 2 Pengaruh penambahan bahan kimia
terhadap aktivitas enzim
Aktivitas
Peningkatan
Bahan
enzim
Aktivitas
Kimia
(U/mL)
(%)*
EDTA
4,25
123
CaCl2
3,47
100
SDS
1,55
45
DMSO
4,19
121
CuSO4
5,65
163
*Dibandingkan terhadap kontrol dengan aktivitas
enzim 3,45 U/mL.
5
PEMBAHASAN
Penentuan Waktu Produksi Tertinggi
Aspergillus ustus BL5 ditumbuhkan pada
media cair yang mengandung substrat pektin
yang berperan sebagai sumber karbon serta
untuk menginduksi produksi pektinase.
Keberadaan suatu substrat dapat memacu suatu
mikroorganisme untuk mensekresi metabolit
selnya. Penentuan konsentrasi substrat terbaik
dilihat dari peningkatan unit aktivitas pektinase
selama inkubasi kultur hingga waktu tertinggi.
Aktivitas enzim pektinase tertinggi yaitu
terdapat pada konsentrasi pektin 2%,
konsentrasi substrat yang sesuai ini
menyebabkan substrat dapat memasuki tempat
aktif enzim (Plamer 1991).
Penambahan konsentrasi substrat sampai
konsentrasi
substrat
optimum
dapat
meningkatkan aktivitas enzim. Semakin
banyak molekul substrat yang tersedia semakin
sering molekul-molekul tersebut memasuki
tempat aktif molekul enzim. Akan tetapi,
terdapat
keterbatasan
dalam
memacu
kecepatan reaksi dengan cara menambahkan
lebih banyak lagi substrat ke suatu konsentrasi
enzim. Pada konsentrasi substrat 2,5%,
konsentrasi substrat itu menjadi cukup tinggi
sehingga semua tempat aktif pada semua
molekul enzim sudah ditempati oleh substrat.
Pada konsentrasi substrat seperti ini enzim
mengalami kejenuhan, sehingga aktivitas
pektinasenya paling rendah (Plamer 1991).
Pertumbuhan Aspergillus ustus BL5
dipengaruhi oleh pH media, sehingga
diperlukan pH media yang sesuai supaya
mendapatkan produksi tertinggi. Pertumbuhan
Aspergillus ustus BL5 dengan menggunakan
pH 7, pada waktu inkubasi jam ke-168
aktivitas pektinase mengalami penurunan.
Perubahan aktivitas enzim diakibatkan
perubahan pH lingkungan (Winarno 2010).
Hal ini dapat terlihat dari perubahan pH media
yang digunakan, setelah isolat diinokulasikan
pada waktu inkubasi jam ke-0 nilai pH adalah
7,3 dan pada waktu inkubasi jam ke-168
mengalami kenaikan pH menjadi 8,9.
Penurunan unit aktivitas enzim juga
dimungkinkan dapat terjadi akibat menurunnya
jumlah substrat yang tersedia di dalam media
sehingga
mengakibatkan
kompetisi
penggunaan substrat oleh jumlah sel yang
semakin bertambah (Kansoh & Nagieb 2004).
Prinsip pengujian aktivitas pektinase
merupakan reaksi antara enzim dan substrat
yang akan menghasilkan produk berupa asam
galakturonat selama waktu inkubasi. Produk
ini akan bereaksi dengan reagen DNS
(Lampiran 2)
dan diukur dengan
spektrofotometer. Reagen DNS yang terdiri
atas komponen utama 3,5-dinitrosalisilat yang
berwarna kuning akan mengalami reaksi
reduksi
menjadi
3-amino-5-nitrosalisilat
(Miller 1959). Reaksi reduksi pada gugus nitro
dikarenakan adanya gula pereduksi yang
merupakan hasil hidrolisis substrat oleh
pektinase. Selain untuk menghentikan reaksi,
reagen DNS berfungsi untuk memberikan
warna pada sampel sehingga absorbannya
dapat diukur dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 540 nm. Warna yang
terbentuk dari kuning sampai jingga
bergantung pada kadar asam galakturonat
dalam larutan, semakin banyak kadar asam
galakturonat maka warnanya akan semakin
pekat.
Pemurnian Pektinase
Pemekatan enzim merupakan langkah awal
dari proses pemurnian enzim sebelum tahap
pemurnian selanjutnya. Pemekatan protein
berfungsi untuk memekatkan konsentrasi
protein enzim, mereduksi volume larutan
enzim, dan memisahkan enzim yang
diinginkan dari sebagian enzim kontaminan
yang tidak dikehendaki (Rosenberg 1996).
Aktivitas
enzim
setelah
dipekatkan
mempunyai aktivitas yang lebih tinggi
dibandingkan dengan enzim ekstrak kasarnya.
Tahapan pemekatan Aspergillus ustus BL5
berbeda dengan yang digunakan untuk
memekatkan enzim pektinase dari Penicilium
chrysogenum yang menggunakan etanol dan
memperoleh recovery 57% (Banu et al. 2010).
Perolehan kembali enzim (Recovery) menjadi
salah satu pertimbangan untuk memilih bahan
untuk memekatkan enzim.
Prinsip pemurnian dengan filtrasi gel
adalah pemisahan protein berdasarkan ukuran.
Matriks yang digunakan pada penelitian ini
adalah Sephadex G-75 yang dapat memisahkan
bobot molekul protein 3.000-80.000 Da
(Rosenberg 1996). Buga et al. (2010) dan
Polizeli et al. (1991) menggunakan matriks
Sephadex G-100 untuk memurnikan pektinase
dari Aspergillus niger SA6 dan Neurospora
crassa. Hasil pemurnian enzim pektinase dari
Aspergillus niger SA6 dan Neurospora crassa
menunjukkan adanya satu puncak enzim. Hasil
kromatografi filtrasi gel dari enzim Aspergillus
ustus BL5 yang dimurnikan mempunyai dua
puncak yang berbeda. Hal ini menunjukkan
bahwa terdapat dua enzim pektinase yang
berbeda ukurannya.
Total aktivitas merupakan aktivitas
keseluruhan enzim di dalam larutan, tetapi
6
total aktivitas bukan menunjukkan aktivitas
spesifik dari pektinase karena semakin banyak
volume enzim di dalam setiap tahapan maka
total aktivitasnya semakin besar. Total protein
dari tahap enzim ekstrak kasar sampai
kromatografi filtrasi gel mengalami penurunan.
Penurunan kadar protein dikarenakan pada
setiap tahap pemurnian terjadi pengurangan
pengotor yang terdapat di dalam larutan.
Pengotor dapat berupa protein lain yang tidak
diinginkan atau metabolit lain.
Aktivitas spesifik adalah besarnya aktivitas
enzim per miligram protein. Aktivitas dari
setiap
tahapan
pemurnian
mengalami
kenaikan.
Tingkat
kemurnian
adalah
perbandingan aktivitas spesifik tiap proses
pemurnian dengan aktivitas spesifik enzim
ekstrak kasar sehingga apabila aktivitas
spesifik dari tiap tahapan pemurnian
meningkat maka tingkat kemurnian meningkat.
Nilai tingkat kemurnian yang didapatkan lebih
kecil dibandingkan dengan pemurnian enzim
pada Penicilium chrysogenum sebesar 17,24
(Banu et al. 2010) dan Neurospora crassa
sebesar 20,73 (Polizeli et al. 1991).
Niture et al. (2008) menyatakan bahwa
enzim pektinase yang berasal dari fungi
memiliki bobot molekul 20 sampai 78 kDa.
Profil SDS PAGE menunjukkan bahwa
pemurnian dengan kromatografi filtrasi gel
tidak dapat memurnikan enzim pektinase. Hal
ini dapat dilihat dari banyaknya pita protein.
Tanpa teknik zymogram tidak dapat diketahui
keberadaan pita protein pektinase.
Tahapan pemunian pektinase Aspergillus
ustus BL5 berbeda jika dibandingkan dengan
proses pemurnian pektinase dari Aspergillus
niger SA6 dan Penicillium solitum yang
menggunakan kromatografi penukar ion
terlebih dahulu sebelum gel filtrasi.
Aspergillus niger SA6 menghasilkan pektinase
dengan bobot molekul 35 kDa dan 40 kDa
(Buga et al. 2010). Penicillium solitum
menghasilkan pektinase dengan bobot molekul
50 kDa (Wayne et al. 2009).
Karakterisasi Pengaruh Suhu, pH dan
Bahan Kimia
Suhu merupakan salah satu faktor
lingkungan yang penting dalam aktivitas suatu
enzim. Kecepatan suatu reaksi enzimatik
meningkat sejalan dengan meningkatnya suhu,
sebagian disebabkan karena substrat akan
bertubrukan dengan tempat aktif. Enzim
pektinase memiliki aktivitas maksimum pada
suhu tertentu. Suhu ini memungkinkan
terjadinya tubrukan molekuler paling banyak
tanpa mendenaturasikan enzim. Suhu optimum
pektinase dari isolat fungi dan bakteri memiliki
kisaran 37-550 C (Sartoglu et al. 2001).
Suhu yang lebih besar dari suhu optimum
menyebabkan reaksi enzimatik akan menurun
karena protein enzim mengalami perubahan
konformasi, sehingga molekul protein itu akan
mengalami denaturasi. Substrat juga dapat
mengalami perubahan konformasi sehingga
sisi reaktifnya tidak dapat lagi atau mengalami
hambatan dalam memasuki sisi aktif enzim
pada suhu tinggi (Winarno 2010).
Pektinase yang berasal dari fungi memiliki
aktivitas optimum di lingkungan yang asam.
Suryakant et al. (2001) menyatakan bahwa dari
30 isolat fungi yang telah diteliti memiliki
aktivitas poligalakturonase optimum pada pH
2,5-6,0. Peneliti lain mengungkapkan aktivitas
poligalakturonase dari isolat fungi memiliki
aktivitas optimum pada pH 3,8-6,5 (Buga et al.
2010).
Pektinase yang dihasilkan Aspergillus ustus
BL5 memiliki karakteristik yang berbeda
dibanding dengan berbagai mikroorganisme
lain yang menghasilkan pektinase diantaranya
yaitu, Penicillium chrysogenum optimum pada
350 C dan pH 6,5 (Banu et al. 2010),
Neurospora crassa pada 450 C dan pH 6
(Polizeli et al. 1991), Penicillium Sp. pada 350
C dan pH 6 (Patil & Dayanand 2006) dan
Pleurotus ostreatus pada 600 C dan pH 7,5
(Rashad et al. 2011).
Banyak bahan yang dapat mengubah
aktivitas
suatu
enzim
dengan
menggabungkannya dalam suatu jalur yang
mempengaruhi ikatan substrat dengan tempat
aktif. Peningkatan dan penurunan aktivitas
enzim sangat dipengaruhi oleh jenis garam
logam ataupun senyawa kimia yang
ditambahkan (Banu et al. 2010). Penambahan
EDTA dapat meningkatkan aktivitas enzim
karena berperan dalam stabilitas enzim dan
juga berperan sebagai suatu kofaktor
(Rosenberg 1996). Penambahan CaCl2 tidak
berpengaruh terhadap aktivitas enzim. Hasil ini
berbeda dengan penambahan CaCl2 yang dapat
meningkatkan aktivitas enzim Penicilium
chrysogenum hingga 104%. Penambahan SDS
memiliki nilai aktivitas enzim yang terendah,
karena SDS berperan mendenaturasi semua
jenis protein enzim (Banu et al. 2010).
Larutan CuSO4 mempunyai peranan
sebagai aktivator pada konsentrasi yang relatif
kecil. Perubahan muatan pada enzim akibat
penambahan CuSO4 menyebabkan enzim
mudah dalam mengikat substrat. Kation seperti
Cu (II) kemungkinan terlibat langsung dalam
proses katalis enzim, yaitu dalam pengikatan
7
substrat ke sisi aktif enzim (Khaimar et al.
2009).
SIMPULAN
Pektinase isolat Aspergillus ustus BL5
koleksi BTCC-LIPI merupakan enzim yang
aktif pada kondisi asam dan bersifat mesofil.
Pemekatan menggunakan PEG-6000 dan
ultrafiltrasi
mampu
memekatkan
dan
memisahkan enzim ekstrak kasar dari proteinprotein pengotor. Kromatografi gel filtrasi
menggunakan Sephadex-G75 belum dapat
memisahkan molekul enzim pektinase dari
protein lainnya. Penambahan CuSO4 dapat
meningkatkan aktivitas enzim pektinase.
SARAN
Perlu dilakukan tahapan teknik zymogram
agar dapat menentukan pita protein yang
diinginkan.
DAFTAR PUSTAKA
Angayarkanni J, Palniswamy M, Murugesan S,
Swaminathan K. 2002. Improvement of tea
leaves fermentation with Aspergillus spp.
Pectinase. J Biosci and Bioeng 94(4):299303.
Bennett JW. 2010. Aspergillus Molecular
Biology and Genomics. Japan:AIST.
Banu R et al. 2010. Production and
characterization of pectinase enzyme from
Penicillium chrysogenum. Ind J of Sci and
Technol 3:377-381.
Buga et al. 2010. Partially purified
polygalacturonase from Aspergillus niger
SA6. Afr J Biotechnol 9(52):8944-8954.
Ishii S, Yokotsuka T. 1975. Purification and
properties of pectin lyase from Aspergillus
japonicus. Agric Biol Chem 39:313-321.
Jayani RS, Saxena S, Gupta R. 2005.
Microbial pectinolytic enzymes: a review.
Elsevier 40:2931-2944.
Kansoh AL, Nagieb ZA. 2004. Xylanase and
mananase enzyme from Streptomyces
galbus NR and their use in biobleaching of
softwood kraft pulp. Ant van Lee 85:103114.
Kashyap DR, Chandra SKA, Tewari R. 2000.
Production,
purification
and
characterization of pectinase from a
Bacillus sp. DT7. World J Microbiol
Biotechnol 16:277−282.
Khaimar Y et al. 2009. Study of pectinase
production in submerged fermentation
using different strains of Aspergillus niger.
J Microbiol 1:13-17.
Lim JW, Fujio Y, Ueda S. 1983. Purification
and characterization of pectinesterase and
pectin lyase from Aspergillus oryzae A-3. J
Appl Biochem 193:265-275.
Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid
reagent for determination of reducing
sugar. Anal chem 31:426-428.
Niture SK et al. 2008. Comparative
biochemical and structural characterization
of fungal polygalacturonase. J Biotechnol
63:1-19.
Panda T, Nair SR, Kumar PM. 2004.
Regulation of synthesis of pectinolytic
enzymes of Aspergillus niger. Enzyme
Microb Technol 34:466−473.
Plamer T. 1991. Understanding Enzymes 3th
ed. West Sussex: Ellis Haorwood Limited.
Patil SR, Dayanand A. 2006. Production of
pectinase from deseeded sunflower head by
Aspergillus niger in submerged and solid
state condition. Biores Tech 97:
2054−2058.
Polizeli et al. 1991. Pectinase production by
Neurospora crassa: purification and
biochemical
characterization
of
extracellular polygalacturonase activity. J
of Gene Microbiol 137:1815-1823.
Rashad MM et al. 2011. Purification and
characterizationof
the
pectin
lyase
produced by Pleurotus ostreatus grown on
lemon pulp waste. Aus J of Basic and Appl
Sci 5(8):1377-1384.
Rosenberg IM. 1996. Protein Analysis and
Purification
Benchtcop
Techniques.
Boston:Birkhäuser.
Sartoglu et al. 2001. The use of commercial
pectinase in the fruit industry, part 2:
determination of kinetic behavior of
8
comercial pectinase.
47(4):271-274.
J
Food
Eng
Suryakant et al. 2001. Active site
characterization of the single endopolygalacturonase produced by Fusarium
moniforme. Afr J Biotechnol 268:832-840.
Wayne M et al .2009. Isolation, purification
and characterization of polygalacturonase
Penicillium solitum. J Biotechnol 99:637648
Winarno FG. 2010. Enzim Pangan Edisi
Revisi. Bogor : M-Brio Press.
Yadav SPK. 2008. Purification and
characterization of an alkaline pectin lyase
from Aspergillus flavus. Process Biochem
43:547-552.
9
LAMPIRAN
10
Lampiran 1 Perhitungan aktivitas pektinase
Aktivitas (U/mL) =
Aktivitas Total (U)
� −�
� �� �
�
=
Total protein (mg)
=
Aktivitas spesifik
=
Recovery
=
Tingkat kemurnian
=
Keterangan :
� 1000
��
��
�
��
� � �
� � � � �
�
� � � � �
� � �
� �
��
� �
��
��
�
)
� (
(U/mg)
�
� � � � �
� � �
�� � � � ( /
Xs
: Kadar asam galakturonat sampel
Xk
: Kadar asam galakturonat kontrol
t
: Waktu inkubasi (30 menit)
fp
: Faktor pengenceran
BM asam galakturonat
: 212 g/mol
)
� �
��
�
/
� �
Lampiran 2 Prosedur pembuatan reagen yang digunakan dalam penelitian
Reagen dinitrosalisilat (DNS) (Miller 1959)
Sebanyak 10 g NaOH padat; 182 g KNa-tartrat; 0,5 g Na2SO3; 2 g fenol, dan 10 g reagen DNS
dilarutkan dalam akuades sampai 1000 mL.
0,02 M bufer asetat pH 4
Sebanyak 20,5 mL CH3COOH 0,02 M dan 4,5 mL CH3COONa 0,02 M dicampur serta dilarutkan
dengan akuades sampai 50 mL. Pengaturan pH dilakukan dengan 1 N NaOH dan 1 N HCl.
0,02 M bufer asetat pH 5
Sebanyak 7,4 mL CH3COOH 0,02 M dan 17,6 mL CH3COONa 0,02 M dicampur serta dilarutkan
dengan akuades sampai 50 mL. Pengaturan pH dilakukan dengan 1 N NaOH dan 1 N HCl.
0,02 M bufer fosfat pH 6,0
Sebanyak 21,925 mL Na2HPO4.2H2O 0,02 M dan 3,075 mL NaH2PO4.2H2O 0,02 M dicampur
serta dilarutkan dengan akuades sampai 50 mL. Pengaturan pH dilakukan dengan 1 N NaOH dan 1
N HCl.
0,02 M bufer fosfat pH 6,5
Sebanyak 17,125 mL Na2HPO4.2H2O 0,02 M dan 7,875 mL NaH2PO4.2H2O 0,02 M dicampur
serta dilarutkan dengan akuades sampai 50 mL. Pengaturan pH dilakukan dengan 1 N NaOH dan 1
N HCl.
11
0,02 M bufer fosfat pH 7,0
Sebanyak 9,75 mL Na2HPO4.2H2O 0,02 M dan 15,25 mL NaH2PO4.2H2O 0,02 M dicampur serta
dilarutkan dengan akuades sampai 50 mL. Pengaturan pH dilakukan dengan 1 N NaOH dan 1 N
HCl.
0,02 M bufer fosfat pH 7,5
Sebanyak 4 mL Na2HPO4.2H2O 0,02 M dan 0,02 M NaH2PO4.2H2O 21 mL dicampur serta
dilarutkan dengan akuades sampai 50 mL. Pengaturan pH dilakukan dengan 1 N NaOH dan 1 N
HCl.
0,02 M bufer fosfat pH 8
sebanyak 1,325 mL Na2HPO4.2H2O 0,02 M dan 23,675 mL NaH2PO4.2H2O 0,02 M dicampur serta
dilarutkan dengan akuades sampai 50 mL. Pengaturan pH dilakukan dengan 1 N NaOH dan 1 N
HCl.
Lampiran 3 Kurva standar asam galakturonat
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1 0
Ppm
Nilai
10
0.001
20
0.002
40
0.0035
80
0.027
160
0.086
320
0.209
640
0.4205
1000
0.697
y = 0.0007x - 0.0202
R² = 0.9981
500
1000
ppm
1500
Aspergillus ustus BL5
FITRIA DEWI
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
ii
ABSTRAK
FITRIA DEWI. Pemurnian dan Karakterisasi Pektinase dari Aspergillus ustus BL5.
Dibimbing oleh ANJA MERYANDINI dan YOPI.
Pektinase merupakan enzim ekstraseluler yang mampu mendegradasi senyawa pektin,
karena mempunyai aktifitas memecah polimer pektin menjadi molekul-molekul yang lebih
sederhana seperti asam galakturonat dan asam pektinat. Genus Aspergillus diketahui memproduksi
metabolit sekunder dan enzim ekstraseluler seperti hemiselulase, selulase dan pektinase. Pektinase
bermanfaat dalam industri sari buah dan minuman anggur, fermentasi daun teh serta industri tekstil
dan kertas. Penelitian ini bertujuan untuk melakukan pemurnian dan karakterisasi pektinase
ekstraseluler dari Aspergillus ustus BL5. Hasil percobaan menunjukkan bahwa Aspergillus ustus
BL5 memiliki waktu produksi tertinggi pada konsentrasi substrat 2% dan pH 7, dengan waktu
inkubasi jam ke-120 memiliki aktivitas spesifik sebesar 0,6 U/mg. Pemurnian pektinase dengan
PEG 6000 dan ultrafiltrasi dilanjutkan dengan kromatografi filtrasi gel Sephadex G-75
menghasilkan aktivitas spesifik 4,14 U/mg, serta kemurniannya meningkat 6,94 kali dibandingkan
dengan ekstrak kasarnya. Pektinase ekstraseluler dari Aspergillus ustus BL5 yang telah dimurnikan
memiliki aktivitas optimum pada suhu 500 C dan pH 5. Penambahan 0,05 mM CuSO4 dapat
meningkatkan aktivitas enzim sebesar 163%.
Kata kunci : Pektinase, Aspergillus ustus BL5, pemurnian dan karakterisasi
ABSTRACT
FITRIA DEWI. Purification and Characterization of Pectinase from Aspergillus ustus BL5.
Under direction of ANJA MERYANDINI and YOPI.
Pectinase, an extracellular enzymes that degrades pectin to galacturonic acid and pectinat
acid. Aspergillus has been reported as a fungi that can produce secondary metabolite and
extracellular of enzymes such as hemiselulase, selulase and pectinase. Pectinase plays a vital role
in processing industries such as in the production of fruit juice, in fermentation tea leaves and used
also at paper and textile industry. This study aimed to purify and characterize the extracellular
pectinase from Aspergillus ustus BL5. Extracellular pectinase showed optimum activity with 2%
substrate concentration and pH 7, in 120 hours of incubation time with 0,6 U/mg specific activity.
The crude enzyme was concentrated with PEG-6000 and ultrafiltration. The crude enzyme of
pectinase was purified using Sephadex G-75 gel filtration chromatography. The partial purified
enzyme has specific activity 4,14 U/mg. The purity had increase 6,94 than crude enzymes. The
optimum temperature and pH were 500 C and 5. The Addition of 0.05 mM CuSO4 can increased
enzyme activity to 163.87%.
Key word : Pectinase, Aspergillus ustus BL5, purification and characterization
iii
PEMURNIAN DAN KARAKTERISASI PEKTINASE DARI
Aspergillus ustus BL5
FITRIA DEWI
Skripsi
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Program Studi Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2012
iv
Judul Skrispi : Pemurnian dan Karakterisasi Pektinase dari Aspergillus ustus BL5
Nama
: Fitria Dewi
NIM
: G34080081
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
(Prof. Dr. Anja Meryandini)
NIP 196203271987032001
(Dr. Yopi)
NIP 196912201989011001
Mengetahui:
Ketua Departemen Biologi
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
(Dr. Ence Darmo Jaya Supena)
NIP 196410021989031002
Tanggal Lulus :
v
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia dan hidayah-Nya
sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Laporan ini berisi tentang kegiatan penelitian yang
berjudul “Pemurnian dan Karakterisasi Pektinase dari Aspergillus ustus BL5”. Penelitian ini
dilaksanakan selama bulan Februari-Juni tahun 2012 di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi,
Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI).
Penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Prof. Dr. Anja Meryandini dan Bapak Dr.
Yopi selaku pembimbing atas saran dan bimbingannya. Terima kasih penulis ucapkan kepada Dr.
Sulistijorini selaku penguji atas saran dan bimbingannya. Terima kasih penulis ucapkan kepada
peneliti dan staf di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi, Pusat Penelitian Bioteknologi,
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Mbak Nanik Rahmani, Mbak Ade Andriani, Mbak
Camelia, Mas Alex Prima dan Mas Dicky atas bantuannya selama pelaksanaan penelitian ini.
Terima kasih kepada keluarga tercinta Papah, Mamah, dan Patra atas doa, dukungan dan kasih
sayangnya. Terimakasih kepada Mas Indra atas dukungan dan perhatian yang telah diberikan.
Terima kasih kepada teman-teman di Laboratorium Biokatalis dan Fermentasi Mas Ashif, Widyo,
Ana, Yufi, Yana, Viska, Titi serta Ayi dan teman-teman Biologi 45 atas dukungannya.
Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, November 2012
Fitria Dewi
vi
RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di Kuningan pada tanggal 8 Desember 1989 dari ayah Beni Wijaya dan ibu
Eti Rostiati. Penulis merupakan putri pertama dari dua bersaudara. Tahun 2008 penulis lulus dari
SMA Negeri 1 Sumber, Cirebon dan pada tahun yang sama diterima masuk di Program Studi
Biologi, Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten mata kuliah Ekologi Dasar pada tahun
ajaran 2011/2012 dan 2012/2013. Penulis aktif di organisasi kemahasiswaan yaitu sebagai staf
Dewan Perwakilan Mahasiswa (DPM), staf Kementrian Kebijakan Pertanian Badan Eksekutif
Mahasiswa Keluarga Mahasiswa (BEM KM) dan ketua divisi Biosains Himpunan Mahasiswa
Biologi (HIMABIO). Penulis melaksanakan Praktik Lapang (PL) di Bidang Sarana Bioproses
Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI), Cibinong periode Juli
sampai Agustus 2011. Penulis mendapatkan beberapa penghargaan prestasi akademik, diantaranya
adalah Program Kreativitas Mahasiswa di Bidang Penelitian didanai oleh DIKTI pada tahun 2010,
peserta Pelayaran Kebangsaan Ilmuwan Muda (PKIM) Pulau Bangka yang diselenggarakan oleh
Pusat Penelitian Oseanografi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) pada tahun 2011 dan
mendapatkan medali perak Program Kreativitas Mahasiswa Bidang Pengabdian Masyarakat
Pekan Ilmiah Mahasiswa Tingkat Nasional (PIMNAS) XXIV tahun 2012 di Universitas
Hassanudin Makasar.
Bogor,
November 2012
Fitria Dewi
vii
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL ..........................................................................................................................viii
DAFTAR GAMBAR .....................................................................................................................viii
DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................................................................... 8
PENDAHULUAN............................................................................................................................. 1
Latar Belakang .............................................................................................................................. 1
Tujuan ........................................................................................................................................... 1
Waktu dan Tempat ........................................................................................................................ 1
BAHAN DAN METODE ................................................................................................................. 1
Isolat Kapang ................................................................................................................................ 1
Penentuan Waktu Produksi Tertinggi ........................................................................................... 1
Pemekatan dengan Polietilen Glikol 6000 dan Ultrafiltrasi .......................................................... 2
Kromatografi Filtrasi Gel .............................................................................................................. 2
Analisis Elektroforesis SDS-PAGE .............................................................................................. 2
Pengaruh Suhu, pH dan Bahan Kimia .......................................................................................... 2
HASIL ............................................................................................................................................... 3
Penentuan Waktu Produksi Tertinggi ........................................................................................... 3
Pemekatan dengan Polietilen Glikol 6000 dan Ultrafiltrasi .......................................................... 3
Kromatografi Filtrasi Gel .............................................................................................................. 3
Analisis Elektroforesis SDS-PAGE .............................................................................................. 4
Pengaruh Suhu, pH dan Bahan Kimia .......................................................................................... 4
PEMBAHASAN ............................................................................................................................... 4
Penentuan Waktu Produksi Tertinggi ........................................................................................... 5
Pemurnian Pektinase ..................................................................................................................... 5
Karakterisasi Pengaruh Suhu, pH dan Bahan Kimia .................................................................... 6
SIMPULAN ...................................................................................................................................... 7
SARAN ............................................................................................................................................. 7
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................................... 7
viii
DAFTAR TABEL
Halaman
1 Tahapan pemurnian enzim pektinase............................................................................... 4
2 Pengaruh penambahan bahan kimia terhadap aktivitas enzim......................................... 4
DAFTAR GAMBAR
Halaman
1 Aktivitas pektinase Aspergillus ustus BL5 pada berbagai konsentrasi
substrat pH 7 suhu ruang................................................................................................ 3
2 Pengaruh pH media terhadap pertumbuhan Aspergillus ustus BL5 pada
konsentrasi substrat 2% dan suhu ruang............................................................................ 3
3 Kromatogram dari kolom filtrasi gel ...............................................................................3
4 Pola protein pada gel akrilamid hasil SDS-PAGE ........................................................ 4
5 Pengaruh suhu terhadap aktivitas pektinase dari Aspergillus ustus BL5
pada media pektin 2% dan pH 7....................................................................................... 4
6 Pengaruh pH terhadap aktivitas pektinase dari Aspergillus ustus BL5
pada media pektin 2% dan suhu 500 C............................................................................ 4
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
1 Perhitungan aktivitas pektinase........................................................................................ 10
2 Prosedur pembuatan reagen yang digunakan dalam penelitian........................................ 10
3 Kurva standar asam galakturonat..................................................................................... 11
PENDAHULUAN
Latar Belakang
Enzim merupakan salah satu produk
industri yang mempunyai nilai ekonomi cukup
tinggi di pasaran dunia saat ini. Sifat protein
enzim sangat menarik untuk digunakan sebagai
biokatalis. Enzim dapat diperoleh dari jaringan
hewan, tanaman, dan mikroorganisme. Namun
dari segi teknis dan ekonomi, enzim dari
mikroorganisme
memiliki
keunggulan
diantaranya enzim dapat diproduksi dalam
jumlah besar dengan mutu yang lebih seragam
(Jayani et al. 2005).
Enzim merupakan protein, beberapa enzim
memerlukan adanya komponen non-protein
yang disebut kofaktor. Tanpa kehadiran
kofaktor enzim tersebut berkurang aktivitas
katalitiknya. Pada kasus ini, bagian protein
yang tanpa kofaktor disebut apoenzim.
Kofaktor dapat berupa molekul organik,
sehingga enzim disebut koenzim, atau kofaktor
dapat berupa ion logam. Keseluruhan enzim
disebut holoenzim (Plamer 1991).
Salah satu mekanisme kerja enzim adalah
dengan memecah struktur substrat menjadi
suatu produk atau beberapa produk. Substrat
untuk enzim bersifat spesifik. Pektin
merupakan substrat bagi enzim pektinase.
Pektin merupakan suatu polisakarida
komplek yang terdapat di dalam lamela tengah
atau ruang antar sel dari jaringan tanaman
tingkat tinggi. Selain itu pektinase juga
dihasilkan dari bakteri dan fungi. Pektin terdiri
atas galakturonan dan rhamnogalakturonan.
Pektinase merupakan enzim ekstraseluler yang
mampu mendegradasi senyawa pektin menjadi
molekul-molekul yang lebih sederhana seperti
asam galakturonat (Rashad et al. 2011) dan
asam pektinat (Winarno 2010).
Enzim pektinase merupakan enzim yang
telah banyak digunakan untuk proses industri.
Sebagian besar pektinase diproduksi oleh fungi
(Panda et al. 2004). Genus Aspergillus
diketahui memproduksi metabolit sekunder
dan enzim ekstraseluler seperti hemiselulase,
selulase, dan pektinase.
Aspergillus merupakan kapang yang
bereproduksi secara aseksual. Aspergillus
menghasilkan spora ketika mendapatkan media
dan kondisi lingkungan yang sesuai.
Organisme ini mensekresikan enzim ke
lingkungan, memecah molekul menjadi lebih
sederhana dan kemudian mengabsorbsinya
kembali. Mikroorganisme ini memiliki
karakteristik membentuk koloni berbentuk
circular, sel berbentuk bulat berwarna abuabu, dan hifa bersepta (Bennett 2010).
Pektinase memiliki nilai komersial dalam
industri sari buah dan minuman anggur (Panda
et al. 2004), fermentasi daun teh
(Angayarkanni et al. 2002) serta industri tekstil
dan kertas (Kashyap et al. 2000). Spesies yang
biasa digunakan adalah Aspergillus niger
untuk industri pangan (Jayani et al. 2005).
Mikroorganisme lain yang telah diketahui
dapat
memproduksi
pektinase
yaitu
Aspergillus japonicus (Ishii & Yakotsuka
1975), Aspergillus oryzae (Lim et al. 1983),
Aspergillus flavus (Yadav 2008), Neurospora
crassa (Polizeli et al. 1991) dan Penicillium
chrysogenum (Banu et al. 2010).
Tujuan
Penelitian ini bertujuan melakukan
pemurnian dan karakterisasi pektinase dari
Aspergillus ustus BL5. Hasil penelitian ini
diharapkan dapat memberikan informasi
ilmiah mengenai potensi Aspergillus ustus BL5
sebagai penghasil pektinase ekstraseluler serta
memberikan karakteristik pektinasenya.
BAHAN DAN METODE
Waktu dan Tempat
Penelitian ini dilaksanakan pada bulan
Februari sampai dengan bulan Juni 2012
bertempat di Laboratorium Biokatalis dan
Fermentasi, Pusat Penelitian Bioteknologi,
Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI).
Isolat Kapang
Isolat yang digunakan adalah Aspergillus
ustus BL5 koleksi Biotechnology Culture
Collection (BTCC) LIPI.
Penentuan Waktu Produksi Tertinggi
Konsentrasi substrat pektin yang digunakan
adalah 0,5; 1; 1,5; 2 dan 2,5%. Nilai pH yang
digunakan adalah 5, 6, 7, 8 dan 9. Sebanyak 1
mata ose Aspergillus ustus BL5 yang berumur
15 hari diinokulasikan pada 3 mL media
prekultur dengan komposisi (NH4)2PO4 0,3%;
KH2PO4 0,2%; K2HPO4 0,3%; MgSO4.7H2O
0,01%. Kemudian media prekultur diinkubasi
dan diagitasi pada suhu ruang selama 2 hari.
Media prekultur yang berisi isolat dipindahkan
ke dalam 97 mL media kultur dengan
komposisi yang sama, kemudian dilakukan
sampling setiap 24 jam sekali. Sampel
disentrifugasi 2 kali pada kecepatan 11.000
rpm selama 15 menit suhu 40 C. Supernatan
diambil kemudian disimpan dalam ruang
pendingin pada suhu 40 C. Uji aktivitas enzim
pektinase dilakukan dengan mencampur 0,25
2
mL substrat pektinase dengan 0,25 mL enzim
pektinase lalu diinkubasi selama 30 menit pada
suhu ruang. Reaksi dihentikan dengan
penambahan 0,75 mL reagen dinitrosalisilat
(DNS). Perlakuan kontrol dilakukan dengan
mereaksikan substrat dengan DNS lalu
ditambahkan enzim. Perlakuan blanko
dilakukan dengan mereaksikan 0,75 mL DNS
dengan 0,5 mL 0,01 M bufer sitrat pH 5.
Kemudian sampel, kontrol dan blanko
dididihkan selama 15 menit pada suhu 1000 C
lalu didinginkan. Setelah dingin sampel diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 540
nm (Miller 1959).
Satu unit aktivitas enzim pektinase
didefinisikan sebagai banyaknya enzim yang
dapat memproduksi 1 µmol pektin dalam 1
menit. Pembuatan kurva standar dilakukan
dengan berbagai konsentrasi asam galakturonat
10-1.000 ppm direaksikan dengan 0,75 mL
DNS lalu dididihkan selama 15 menit pada
suhu 100 0C lalu didinginkan. Setelah dingin
sampel diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 540 nm.
Pemekatan dengan Polietilen Glikol 6000
dan Ultrafiltrasi
Sebanyak 80 mL enzim ekstrak kasar
dimasukkan ke dalam membran dialisis
kemudian ditaburi dengan PEG-6000 selama
semalam di ruang pendingin. Enzim yang
tersisa di dalam membran didialisis selama 6
jam dengan 0,01 M bufer sitrat pH 5 di dalam
ruang pendingin dan diaduk dengan batang
pengaduk. Kemudian enzim dipekatkan
kembali dengan cara ultrafiltrasi menggunakan
sentricon
Corning
Spin-X.
Sampel
disentrifugasi dengan kecepatan 15.000 rpm,
suhu 40 C selama 15 menit.
Kromatografi Filtrasi Gel
Matriks Sephadex G-75 dikembangkan
dengan cara 10 g matriks direndam dalam 200
mL 0,01 M bufer sitrat pH 5, diaduk perlahan
dengan
batang
pengaduk,
kemudian
dipanaskan pada suhu 900 C selama 2 jam.
Setelah dingin matriks Sephadex G-75
disimpan pada ruang pendingin selama
semalam.
Dekantasi
dilakukan
untuk
menghilangkan serbuk yang terapung.
Pektinase yang dimurnikan sebanyak 1 mL dan
dimasukkan ke dalam kolom yang berdiameter
2 cm dan tinggi 18,5 cm. Matriks Sephadex G75 dielusi dengan 0,01 M bufer sitrat pH 5
dengan kecepatan 1 mL/menit. Volume fraksi
yang ditampung masing-masing sebanyak 1
mL. Fraksi yang dikumpulkan ada 100
microtube dan kadar protein masing-masing
microtube diukur menggunakan panjang
gelombang 280 nm. Aktivitas pektinase setiap
fraksi diukur dengan metode DNS.
Analisis Elektroforesis SDS-PAGE
Elektroforesis protein dengan SDS-PAGE
menggunakan gel pemisah 10% poliakrilamida
dan gel penahan 4% poliakrilamida. Ke dalam
tabung mikro dimasukkan 20 µl sampel protein
dan 5µl bufer sampel. Campuran dipanaskan
dalam air mendidih selama 10 menit. Sampel
dimasukkan ke dalam sumur gel penahan
menggunakan siring. Selanjutnya piranti
elektroforesis dipasang dan 300 mL bufer
elektroforesis dituangkan ke dalam bejana
elektroforesis.
Proses
elektroforesis
berlangsung selama 4 jam pada tegangan 60
volt dan 30 mA. Gel hasil elektroforesis
dilepas dari cetakan dan jarak migrasi
bromfenol biru diukur dari batas atas gel
pemisah. Pewarnaan yang digunakan adalah
pewarna perak. Prosedurnya sebagai berikut:
gel direndam dalam larutan fiksasi (25% (v/v)
metanol dan 12% (v/v) asam asetat) selama
semalam kemudian direndam dalam 50% (v/v)
etanol selama 20 menit, kemudian diganti
dengan 30% (v/v) etanol selama 2 x 20 menit,
setelah dicuci direndam dalam larutan
enhancer selama 1 menit, kemudian dicuci
dalam aquabidest 3 x 20 detik. Larutan
diwarnai dengan pewarna silver selama 30
menit, kemudian dicuci dengan aquabidest 2 x
20 detik, setelah itu direndam dalam larutan
developer maksimal 10 menit, reaksi
dihentikan dengan larutan fiksasi.
Pengaruh Suhu, pH dan Bahan Kimia
Penentuan suhu optimum dilakukan dengan
cara menguji aktivitas pektinase dalam
berbagai kisaran suhu 300 C sampai dengan 800
C (selang 100 C) dengan waktu inkubasi 30
menit. Penentuan pH optimum dilakukan
dengan cara menguji aktivitas pektinase dalam
berbagai nilai kisaran pH 3 sampai pH 8
(selang 0,5) pada suhu optimumnya. Pengaruh
bahan kimia terhadap aktivitas enzim
dilakukan dengan cara menguji aktivitas
pektinase pada suhu dan pH optimumnya
dengan menambahkan bahan kimia masingmasing 0,05 mM EDTA (Ethylene diamine
tetraacetic acid), CaCl2, SDS (Sodium dodecyl
sulfate), DMSO (Dimethyl sulfoxide), dan
CuSO4. Pengaruh suhu, pH dan bahan kimia
terhadap aktivitas enzim dilakukan dengan tiga
kali pengulangan.
3
Pemekatan dengan Polietilen Glikol 6000
dan Ultrafiltrasi
Aktivitas enzim ekstrak kasar dari waktu
produksi tertinggi dapat ditingkatkan dengan
pemekatan PEG 6000 dan ultrafiltrasi dari 3,45
U/mL menjadi 5,77 U/mL.
HASIL
Kromatografi Filtrasi Gel
Hasil kromatografi (Gambar 3) dari tahap
pemekatan menunjukkan 2 puncak aktivitas
enzim. Puncak pertama yaitu dari fraksi nomor
9-13 memiliki aktivitas enzim pektinase ratarata 3,4 U/mL. Puncak kedua yaitu dari fraksi
nomor 26-30 memiliki aktivitas enzim
pektinase rata-rata 2,1 U/mL.
Tahapan pemurnian yang dilakukan dari
pemekatan dengan PEG 6000 dan ultrafiltrasi
serta kromatografi filtrasi gel (Tabel 1)
didapatkan bahwa total aktivitas mengalami
penurunan dari tahap enzim ekstrak kasar ke
tahap kromatografi filtrasi gel. Total protein
dari tahap enzim ekstrak kasar sampai
kromatografi filtrasi gel juga mengalami
penurunan dari 462 mg sampai 2,7 mg.
Aktivitas spesifik dari produksi ekstrak
kasar sampai kromatografi filtrasi gel terjadi
kenaikan dari 0,6 U/mg menjadi 4,15 U/mg
(Gel filtrasi I) dan 3,3 U/mg (Gel filtrasi II).
Tingkat kemurnian meningkat dari 1 menjadi
6,94 (Gel filtrasi I) dan 5,53 (Gel filtrasi II).
Perolehan (Recovery) mengalami penurunan
dari enzim ekstrak kasar 100%
ke
pengendapan PEG 6000 dan ultrafiltrasi
sebesar 50% serta mengalami penurunan yang
drastis pada tahap kromatografi filtrasi gel
puncak 1 menjadi 5,37% dan puncak 2
menjadi 3,33%.
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
24
48 72 96 120 144 168
Waktu Inkubasi (Jam)
Konsentrasi substrat (%)
1
1,5
2
0,5
2,5
Gambar 1 Aktivitas pektinase Aspergillus
ustus
BL5
pada
berbagai
konsentrasi substrat pH 7 suhu
ruang
0
24
5
Gambar
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
2
4
3
OD 280 nm
Aktivitas Enzim (U/mL)
Pengaruh pH media kultur terhadap
pertumbuhan Aspergillus ustus BL5 pada
konsentrasi substrat 2% dan suhu ruang dapat
dilihat pada gambar 2. Pertumbuhan
Aspergillus ustus BL5 dengan aktivitas
pektinase tertinggi dimiliki oleh media kultur
pH 7 dengan aktivitas pektinase ekstrak kasar
sebesar 3,45 U/mL. Pertumbuhan Aspergillus
ustus BL5 dengan aktivitas pektinase ekstrak
kasar terendah dimiliki oleh media kultur pH
5 dengan aktivitas sebesar 0,65 U/mL.
48
72
96
120 144 168
Waktu Inkubasi (Jam)
pH
6
7
8
Pengaruh pH media terhadap
pertumbuhan Aspergillus ustus BL5
pada konsentrasi substrat 2% dan
suhu ruang
2
1
0
0
9
Aktivitas Enzim (U/ml)
Aktivitas Enzim (U/mL)
Penentuan Waktu Produksi Tertinggi
Aktivitas pektinase dengan berbagai
konsentrasi substrat pH 7 pada suhu ruang
dapat dilihat pada gambar 1. Konsentrasi
substrat 2% pada waktu fermentasi jam ke-120
memiliki aktivitas pektinase ekstrak kasar
tertinggi sebesar 3,45 U/mL. Konsentrasi
substrat 2,5% memberikan aktivitas pektinase
terendah sebesar 1,26 U/mL.
5
10 15 20 25 30 35 40 45
Fraksi [Volume (ml)]
Protein
enzim
Gambar 3 Kromatogram dari kolom filtrasi gel
dengan matriks Sephadex G-75,
elusi menggunakan 10 mM bufer
sitrat pH 5, kecepatan alir 1
menit/mL
4
Tabel 1 Tahapan pemurnian enzim pektinase
Tahap Pemurnian
Total
Aktivitas
(Unit)
Total
Protein
(mg)
Aktivitas
Spesifik
(U/mg)
Tingkat
kemurnian
Recovery
(%)
Enzim Ekstrak kasar
PEG-6000 &
Ultrafiltrasi
Filtrasi gel puncak 1
276
462
0,6
1
100
138,48
81,6
1,7
2,8
50
14,83
3,57
4,15
6,94
5,37
Filtrasi gel puncak 2
9,21
2,78
3,3
5,53
3,33
Hasil percobaan menunjukkan bahwa
pektinase dari Aspergillus ustus BL5 yang
diinkubasi pada suhu 500 C memiliki pH
optimum pada pH 5 dengan aktivitas pektinase
sebesar 4,53 U/mL (Gambar 6). Nilai pH
optimum pada pH 5 menunjukkan bahwa
enzim ini termasuk enzim asam.
Aktivitas Enzim (U/ml)
Analisis Elektroforesis SDS-PAGE
Hasil elektroforesis SDS-PAGE (Gambar
4) menunjukkan bahwa enzim ekstrak kasar
(2) mempunyai pita protein yang banyak,
setelah pemekatan dengan PEG 6000 dan
ultrafiltrasi (3) pita protein menjadi semakin
jelas terlihat.
1
2 3 4
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8
pH
Gambar 4 Pola protein pada gel akrilamid hasil
SDS-PAGE (1 : Marker; 2 : Enzim
ekstrak kasar; 3 : Polietilen glikol
6000 dan ultrafiltrasi; 4 : Gel filtrasi
Sephadex G-75)
Aktivitas Enzim (u/ml)
Pengaruh Suhu, pH dan Bahan Kimia
Pektinase hasil pemurnian memiliki
aktivitas optimum pada suhu 500 C dengan
aktivitas sebesar 4,54 U/mL (Gambar 5).
5,0
4,5
4,0
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
30
40
50
60
70
80
Suhu (0C)
Gambar 5 Pengaruh suhu terhadap aktivitas
pektinase dari Aspergillus ustus
BL5 pada media pektin 2% dan
pH 7
Gambar 6 Pengaruh pH terhadap aktivitas
pektinase dari Aspergillus ustus
BL5 pada media pektin 2% dan
suhu 500 C
Penambahan bahan kimia juga dapat
meningkatkan aktivitas enzim pektinase
Aspergillus ustus BL5. Penambahan 0,05 mM
CuSO4 dapat meningkatkan aktivitas enzim
sampai 163% dengan aktivitas enzim 5,65
U/mL (Tabel 2).
Tabel 2 Pengaruh penambahan bahan kimia
terhadap aktivitas enzim
Aktivitas
Peningkatan
Bahan
enzim
Aktivitas
Kimia
(U/mL)
(%)*
EDTA
4,25
123
CaCl2
3,47
100
SDS
1,55
45
DMSO
4,19
121
CuSO4
5,65
163
*Dibandingkan terhadap kontrol dengan aktivitas
enzim 3,45 U/mL.
5
PEMBAHASAN
Penentuan Waktu Produksi Tertinggi
Aspergillus ustus BL5 ditumbuhkan pada
media cair yang mengandung substrat pektin
yang berperan sebagai sumber karbon serta
untuk menginduksi produksi pektinase.
Keberadaan suatu substrat dapat memacu suatu
mikroorganisme untuk mensekresi metabolit
selnya. Penentuan konsentrasi substrat terbaik
dilihat dari peningkatan unit aktivitas pektinase
selama inkubasi kultur hingga waktu tertinggi.
Aktivitas enzim pektinase tertinggi yaitu
terdapat pada konsentrasi pektin 2%,
konsentrasi substrat yang sesuai ini
menyebabkan substrat dapat memasuki tempat
aktif enzim (Plamer 1991).
Penambahan konsentrasi substrat sampai
konsentrasi
substrat
optimum
dapat
meningkatkan aktivitas enzim. Semakin
banyak molekul substrat yang tersedia semakin
sering molekul-molekul tersebut memasuki
tempat aktif molekul enzim. Akan tetapi,
terdapat
keterbatasan
dalam
memacu
kecepatan reaksi dengan cara menambahkan
lebih banyak lagi substrat ke suatu konsentrasi
enzim. Pada konsentrasi substrat 2,5%,
konsentrasi substrat itu menjadi cukup tinggi
sehingga semua tempat aktif pada semua
molekul enzim sudah ditempati oleh substrat.
Pada konsentrasi substrat seperti ini enzim
mengalami kejenuhan, sehingga aktivitas
pektinasenya paling rendah (Plamer 1991).
Pertumbuhan Aspergillus ustus BL5
dipengaruhi oleh pH media, sehingga
diperlukan pH media yang sesuai supaya
mendapatkan produksi tertinggi. Pertumbuhan
Aspergillus ustus BL5 dengan menggunakan
pH 7, pada waktu inkubasi jam ke-168
aktivitas pektinase mengalami penurunan.
Perubahan aktivitas enzim diakibatkan
perubahan pH lingkungan (Winarno 2010).
Hal ini dapat terlihat dari perubahan pH media
yang digunakan, setelah isolat diinokulasikan
pada waktu inkubasi jam ke-0 nilai pH adalah
7,3 dan pada waktu inkubasi jam ke-168
mengalami kenaikan pH menjadi 8,9.
Penurunan unit aktivitas enzim juga
dimungkinkan dapat terjadi akibat menurunnya
jumlah substrat yang tersedia di dalam media
sehingga
mengakibatkan
kompetisi
penggunaan substrat oleh jumlah sel yang
semakin bertambah (Kansoh & Nagieb 2004).
Prinsip pengujian aktivitas pektinase
merupakan reaksi antara enzim dan substrat
yang akan menghasilkan produk berupa asam
galakturonat selama waktu inkubasi. Produk
ini akan bereaksi dengan reagen DNS
(Lampiran 2)
dan diukur dengan
spektrofotometer. Reagen DNS yang terdiri
atas komponen utama 3,5-dinitrosalisilat yang
berwarna kuning akan mengalami reaksi
reduksi
menjadi
3-amino-5-nitrosalisilat
(Miller 1959). Reaksi reduksi pada gugus nitro
dikarenakan adanya gula pereduksi yang
merupakan hasil hidrolisis substrat oleh
pektinase. Selain untuk menghentikan reaksi,
reagen DNS berfungsi untuk memberikan
warna pada sampel sehingga absorbannya
dapat diukur dengan spektrofotometer pada
panjang gelombang 540 nm. Warna yang
terbentuk dari kuning sampai jingga
bergantung pada kadar asam galakturonat
dalam larutan, semakin banyak kadar asam
galakturonat maka warnanya akan semakin
pekat.
Pemurnian Pektinase
Pemekatan enzim merupakan langkah awal
dari proses pemurnian enzim sebelum tahap
pemurnian selanjutnya. Pemekatan protein
berfungsi untuk memekatkan konsentrasi
protein enzim, mereduksi volume larutan
enzim, dan memisahkan enzim yang
diinginkan dari sebagian enzim kontaminan
yang tidak dikehendaki (Rosenberg 1996).
Aktivitas
enzim
setelah
dipekatkan
mempunyai aktivitas yang lebih tinggi
dibandingkan dengan enzim ekstrak kasarnya.
Tahapan pemekatan Aspergillus ustus BL5
berbeda dengan yang digunakan untuk
memekatkan enzim pektinase dari Penicilium
chrysogenum yang menggunakan etanol dan
memperoleh recovery 57% (Banu et al. 2010).
Perolehan kembali enzim (Recovery) menjadi
salah satu pertimbangan untuk memilih bahan
untuk memekatkan enzim.
Prinsip pemurnian dengan filtrasi gel
adalah pemisahan protein berdasarkan ukuran.
Matriks yang digunakan pada penelitian ini
adalah Sephadex G-75 yang dapat memisahkan
bobot molekul protein 3.000-80.000 Da
(Rosenberg 1996). Buga et al. (2010) dan
Polizeli et al. (1991) menggunakan matriks
Sephadex G-100 untuk memurnikan pektinase
dari Aspergillus niger SA6 dan Neurospora
crassa. Hasil pemurnian enzim pektinase dari
Aspergillus niger SA6 dan Neurospora crassa
menunjukkan adanya satu puncak enzim. Hasil
kromatografi filtrasi gel dari enzim Aspergillus
ustus BL5 yang dimurnikan mempunyai dua
puncak yang berbeda. Hal ini menunjukkan
bahwa terdapat dua enzim pektinase yang
berbeda ukurannya.
Total aktivitas merupakan aktivitas
keseluruhan enzim di dalam larutan, tetapi
6
total aktivitas bukan menunjukkan aktivitas
spesifik dari pektinase karena semakin banyak
volume enzim di dalam setiap tahapan maka
total aktivitasnya semakin besar. Total protein
dari tahap enzim ekstrak kasar sampai
kromatografi filtrasi gel mengalami penurunan.
Penurunan kadar protein dikarenakan pada
setiap tahap pemurnian terjadi pengurangan
pengotor yang terdapat di dalam larutan.
Pengotor dapat berupa protein lain yang tidak
diinginkan atau metabolit lain.
Aktivitas spesifik adalah besarnya aktivitas
enzim per miligram protein. Aktivitas dari
setiap
tahapan
pemurnian
mengalami
kenaikan.
Tingkat
kemurnian
adalah
perbandingan aktivitas spesifik tiap proses
pemurnian dengan aktivitas spesifik enzim
ekstrak kasar sehingga apabila aktivitas
spesifik dari tiap tahapan pemurnian
meningkat maka tingkat kemurnian meningkat.
Nilai tingkat kemurnian yang didapatkan lebih
kecil dibandingkan dengan pemurnian enzim
pada Penicilium chrysogenum sebesar 17,24
(Banu et al. 2010) dan Neurospora crassa
sebesar 20,73 (Polizeli et al. 1991).
Niture et al. (2008) menyatakan bahwa
enzim pektinase yang berasal dari fungi
memiliki bobot molekul 20 sampai 78 kDa.
Profil SDS PAGE menunjukkan bahwa
pemurnian dengan kromatografi filtrasi gel
tidak dapat memurnikan enzim pektinase. Hal
ini dapat dilihat dari banyaknya pita protein.
Tanpa teknik zymogram tidak dapat diketahui
keberadaan pita protein pektinase.
Tahapan pemunian pektinase Aspergillus
ustus BL5 berbeda jika dibandingkan dengan
proses pemurnian pektinase dari Aspergillus
niger SA6 dan Penicillium solitum yang
menggunakan kromatografi penukar ion
terlebih dahulu sebelum gel filtrasi.
Aspergillus niger SA6 menghasilkan pektinase
dengan bobot molekul 35 kDa dan 40 kDa
(Buga et al. 2010). Penicillium solitum
menghasilkan pektinase dengan bobot molekul
50 kDa (Wayne et al. 2009).
Karakterisasi Pengaruh Suhu, pH dan
Bahan Kimia
Suhu merupakan salah satu faktor
lingkungan yang penting dalam aktivitas suatu
enzim. Kecepatan suatu reaksi enzimatik
meningkat sejalan dengan meningkatnya suhu,
sebagian disebabkan karena substrat akan
bertubrukan dengan tempat aktif. Enzim
pektinase memiliki aktivitas maksimum pada
suhu tertentu. Suhu ini memungkinkan
terjadinya tubrukan molekuler paling banyak
tanpa mendenaturasikan enzim. Suhu optimum
pektinase dari isolat fungi dan bakteri memiliki
kisaran 37-550 C (Sartoglu et al. 2001).
Suhu yang lebih besar dari suhu optimum
menyebabkan reaksi enzimatik akan menurun
karena protein enzim mengalami perubahan
konformasi, sehingga molekul protein itu akan
mengalami denaturasi. Substrat juga dapat
mengalami perubahan konformasi sehingga
sisi reaktifnya tidak dapat lagi atau mengalami
hambatan dalam memasuki sisi aktif enzim
pada suhu tinggi (Winarno 2010).
Pektinase yang berasal dari fungi memiliki
aktivitas optimum di lingkungan yang asam.
Suryakant et al. (2001) menyatakan bahwa dari
30 isolat fungi yang telah diteliti memiliki
aktivitas poligalakturonase optimum pada pH
2,5-6,0. Peneliti lain mengungkapkan aktivitas
poligalakturonase dari isolat fungi memiliki
aktivitas optimum pada pH 3,8-6,5 (Buga et al.
2010).
Pektinase yang dihasilkan Aspergillus ustus
BL5 memiliki karakteristik yang berbeda
dibanding dengan berbagai mikroorganisme
lain yang menghasilkan pektinase diantaranya
yaitu, Penicillium chrysogenum optimum pada
350 C dan pH 6,5 (Banu et al. 2010),
Neurospora crassa pada 450 C dan pH 6
(Polizeli et al. 1991), Penicillium Sp. pada 350
C dan pH 6 (Patil & Dayanand 2006) dan
Pleurotus ostreatus pada 600 C dan pH 7,5
(Rashad et al. 2011).
Banyak bahan yang dapat mengubah
aktivitas
suatu
enzim
dengan
menggabungkannya dalam suatu jalur yang
mempengaruhi ikatan substrat dengan tempat
aktif. Peningkatan dan penurunan aktivitas
enzim sangat dipengaruhi oleh jenis garam
logam ataupun senyawa kimia yang
ditambahkan (Banu et al. 2010). Penambahan
EDTA dapat meningkatkan aktivitas enzim
karena berperan dalam stabilitas enzim dan
juga berperan sebagai suatu kofaktor
(Rosenberg 1996). Penambahan CaCl2 tidak
berpengaruh terhadap aktivitas enzim. Hasil ini
berbeda dengan penambahan CaCl2 yang dapat
meningkatkan aktivitas enzim Penicilium
chrysogenum hingga 104%. Penambahan SDS
memiliki nilai aktivitas enzim yang terendah,
karena SDS berperan mendenaturasi semua
jenis protein enzim (Banu et al. 2010).
Larutan CuSO4 mempunyai peranan
sebagai aktivator pada konsentrasi yang relatif
kecil. Perubahan muatan pada enzim akibat
penambahan CuSO4 menyebabkan enzim
mudah dalam mengikat substrat. Kation seperti
Cu (II) kemungkinan terlibat langsung dalam
proses katalis enzim, yaitu dalam pengikatan
7
substrat ke sisi aktif enzim (Khaimar et al.
2009).
SIMPULAN
Pektinase isolat Aspergillus ustus BL5
koleksi BTCC-LIPI merupakan enzim yang
aktif pada kondisi asam dan bersifat mesofil.
Pemekatan menggunakan PEG-6000 dan
ultrafiltrasi
mampu
memekatkan
dan
memisahkan enzim ekstrak kasar dari proteinprotein pengotor. Kromatografi gel filtrasi
menggunakan Sephadex-G75 belum dapat
memisahkan molekul enzim pektinase dari
protein lainnya. Penambahan CuSO4 dapat
meningkatkan aktivitas enzim pektinase.
SARAN
Perlu dilakukan tahapan teknik zymogram
agar dapat menentukan pita protein yang
diinginkan.
DAFTAR PUSTAKA
Angayarkanni J, Palniswamy M, Murugesan S,
Swaminathan K. 2002. Improvement of tea
leaves fermentation with Aspergillus spp.
Pectinase. J Biosci and Bioeng 94(4):299303.
Bennett JW. 2010. Aspergillus Molecular
Biology and Genomics. Japan:AIST.
Banu R et al. 2010. Production and
characterization of pectinase enzyme from
Penicillium chrysogenum. Ind J of Sci and
Technol 3:377-381.
Buga et al. 2010. Partially purified
polygalacturonase from Aspergillus niger
SA6. Afr J Biotechnol 9(52):8944-8954.
Ishii S, Yokotsuka T. 1975. Purification and
properties of pectin lyase from Aspergillus
japonicus. Agric Biol Chem 39:313-321.
Jayani RS, Saxena S, Gupta R. 2005.
Microbial pectinolytic enzymes: a review.
Elsevier 40:2931-2944.
Kansoh AL, Nagieb ZA. 2004. Xylanase and
mananase enzyme from Streptomyces
galbus NR and their use in biobleaching of
softwood kraft pulp. Ant van Lee 85:103114.
Kashyap DR, Chandra SKA, Tewari R. 2000.
Production,
purification
and
characterization of pectinase from a
Bacillus sp. DT7. World J Microbiol
Biotechnol 16:277−282.
Khaimar Y et al. 2009. Study of pectinase
production in submerged fermentation
using different strains of Aspergillus niger.
J Microbiol 1:13-17.
Lim JW, Fujio Y, Ueda S. 1983. Purification
and characterization of pectinesterase and
pectin lyase from Aspergillus oryzae A-3. J
Appl Biochem 193:265-275.
Miller GL. 1959. Use of dinitrosalicylic acid
reagent for determination of reducing
sugar. Anal chem 31:426-428.
Niture SK et al. 2008. Comparative
biochemical and structural characterization
of fungal polygalacturonase. J Biotechnol
63:1-19.
Panda T, Nair SR, Kumar PM. 2004.
Regulation of synthesis of pectinolytic
enzymes of Aspergillus niger. Enzyme
Microb Technol 34:466−473.
Plamer T. 1991. Understanding Enzymes 3th
ed. West Sussex: Ellis Haorwood Limited.
Patil SR, Dayanand A. 2006. Production of
pectinase from deseeded sunflower head by
Aspergillus niger in submerged and solid
state condition. Biores Tech 97:
2054−2058.
Polizeli et al. 1991. Pectinase production by
Neurospora crassa: purification and
biochemical
characterization
of
extracellular polygalacturonase activity. J
of Gene Microbiol 137:1815-1823.
Rashad MM et al. 2011. Purification and
characterizationof
the
pectin
lyase
produced by Pleurotus ostreatus grown on
lemon pulp waste. Aus J of Basic and Appl
Sci 5(8):1377-1384.
Rosenberg IM. 1996. Protein Analysis and
Purification
Benchtcop
Techniques.
Boston:Birkhäuser.
Sartoglu et al. 2001. The use of commercial
pectinase in the fruit industry, part 2:
determination of kinetic behavior of
8
comercial pectinase.
47(4):271-274.
J
Food
Eng
Suryakant et al. 2001. Active site
characterization of the single endopolygalacturonase produced by Fusarium
moniforme. Afr J Biotechnol 268:832-840.
Wayne M et al .2009. Isolation, purification
and characterization of polygalacturonase
Penicillium solitum. J Biotechnol 99:637648
Winarno FG. 2010. Enzim Pangan Edisi
Revisi. Bogor : M-Brio Press.
Yadav SPK. 2008. Purification and
characterization of an alkaline pectin lyase
from Aspergillus flavus. Process Biochem
43:547-552.
9
LAMPIRAN
10
Lampiran 1 Perhitungan aktivitas pektinase
Aktivitas (U/mL) =
Aktivitas Total (U)
� −�
� �� �
�
=
Total protein (mg)
=
Aktivitas spesifik
=
Recovery
=
Tingkat kemurnian
=
Keterangan :
� 1000
��
��
�
��
� � �
� � � � �
�
� � � � �
� � �
� �
��
� �
��
��
�
)
� (
(U/mg)
�
� � � � �
� � �
�� � � � ( /
Xs
: Kadar asam galakturonat sampel
Xk
: Kadar asam galakturonat kontrol
t
: Waktu inkubasi (30 menit)
fp
: Faktor pengenceran
BM asam galakturonat
: 212 g/mol
)
� �
��
�
/
� �
Lampiran 2 Prosedur pembuatan reagen yang digunakan dalam penelitian
Reagen dinitrosalisilat (DNS) (Miller 1959)
Sebanyak 10 g NaOH padat; 182 g KNa-tartrat; 0,5 g Na2SO3; 2 g fenol, dan 10 g reagen DNS
dilarutkan dalam akuades sampai 1000 mL.
0,02 M bufer asetat pH 4
Sebanyak 20,5 mL CH3COOH 0,02 M dan 4,5 mL CH3COONa 0,02 M dicampur serta dilarutkan
dengan akuades sampai 50 mL. Pengaturan pH dilakukan dengan 1 N NaOH dan 1 N HCl.
0,02 M bufer asetat pH 5
Sebanyak 7,4 mL CH3COOH 0,02 M dan 17,6 mL CH3COONa 0,02 M dicampur serta dilarutkan
dengan akuades sampai 50 mL. Pengaturan pH dilakukan dengan 1 N NaOH dan 1 N HCl.
0,02 M bufer fosfat pH 6,0
Sebanyak 21,925 mL Na2HPO4.2H2O 0,02 M dan 3,075 mL NaH2PO4.2H2O 0,02 M dicampur
serta dilarutkan dengan akuades sampai 50 mL. Pengaturan pH dilakukan dengan 1 N NaOH dan 1
N HCl.
0,02 M bufer fosfat pH 6,5
Sebanyak 17,125 mL Na2HPO4.2H2O 0,02 M dan 7,875 mL NaH2PO4.2H2O 0,02 M dicampur
serta dilarutkan dengan akuades sampai 50 mL. Pengaturan pH dilakukan dengan 1 N NaOH dan 1
N HCl.
11
0,02 M bufer fosfat pH 7,0
Sebanyak 9,75 mL Na2HPO4.2H2O 0,02 M dan 15,25 mL NaH2PO4.2H2O 0,02 M dicampur serta
dilarutkan dengan akuades sampai 50 mL. Pengaturan pH dilakukan dengan 1 N NaOH dan 1 N
HCl.
0,02 M bufer fosfat pH 7,5
Sebanyak 4 mL Na2HPO4.2H2O 0,02 M dan 0,02 M NaH2PO4.2H2O 21 mL dicampur serta
dilarutkan dengan akuades sampai 50 mL. Pengaturan pH dilakukan dengan 1 N NaOH dan 1 N
HCl.
0,02 M bufer fosfat pH 8
sebanyak 1,325 mL Na2HPO4.2H2O 0,02 M dan 23,675 mL NaH2PO4.2H2O 0,02 M dicampur serta
dilarutkan dengan akuades sampai 50 mL. Pengaturan pH dilakukan dengan 1 N NaOH dan 1 N
HCl.
Lampiran 3 Kurva standar asam galakturonat
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
-0,1 0
Ppm
Nilai
10
0.001
20
0.002
40
0.0035
80
0.027
160
0.086
320
0.209
640
0.4205
1000
0.697
y = 0.0007x - 0.0202
R² = 0.9981
500
1000
ppm
1500