3.4 Prosedur Kerja
3.4.1
Pembuatan kurva tumbuh Escherichia coli
Kultur bakteri berumur 1 hari pada medium NA diinokulasikan sebanyak 3 ose ke dalam 30 ml medium NB dan diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37
o
C dan agitasi 120 rpm sebagai kultur inokulum. Setelah itu kultur diukur
absorbannya dengan spektrofotometer vissible pada panjang gelombang 660 nm. Kultur diukur pada menit ke-0, 30, 60, 90, 150, 210, 270, 330, dan 390. Hasil
pengukuran dibuat kurva dengan axis waktu dan ordinat absorbansi.
3.4.2 Penentuan Dosis Iradiasi Inaktivasi sel E. coli dengan Sinar Gamma
Kultur pada fase mid log disentrifuge 10000 rpm dan dibilas dengan aquades steril sebanyak 2 kali. Pelet yang diperoleh diencerkan hingga jumlah sel
diperoleh 10
13
selml dan ditempatkan di dalam vial gelas sebanyak 10 ml. Selanjutnya diiradiasi sinar gamma dengan dosis 0Gy, 50Gy, 200Gy, 500Gy,
600Gy, 700Gy, 800Gy, 900Gy, dan 1000Gy di Gamma Chamber 4000 A dengan laju dosis 1089,59 Gyjam. Selanjutnya kultur hasil iradiasi diencerkan hingga
jumlah sel diperoleh 10
11
selml dan ditempatkan di dalam vial gelas sebanyak 10 ml. Kultur hasil iradiasi kemudian dihitung jumlah selnya dengan metode droptest
untuk uji inaktivasi. Hasil yang diperoleh dibuat kurva dengan axis dosis iradiasi dan ordinat jumlah sel.
3.4.3 Pengukuran Protein Sel E. coli Metode Lowry
Kultur hasil iradiasi diukur kandungan protein ekstraselular dan intraselular. Untuk mengetahui kandungan protein ekstraselular langsung menggunakan kultur
hasil iradiasi, sedangkan untuk protein intraselular dipecah terlebih dahulu dengan melarutkan kultur hasil iradiasi ke dalam aseton 1 : 1 dan disonikasi selama 15
menit. Kemudian 1 ml sampel ekstra dan intraselular ditambahkan 5 ml larutan Lowry I Lampiran 1 dan dibiarkan selama 10 menit. Setelah itu, ditambahkan
0,5 ml larutan Lowry II Lampiran 1 dan dibiarkan selama 30 menit. Setelah itu, dibaca dengan spektrofotometer visible pada panjang gelombang 700 nm, dan
dibandingkan dengan standar BSA.
3.4.4 Karakteristik Profil Protein Bakteri E. coli
Pada penelitian ini menggunakan metode elektroforesis 1 dimensi SDS- PAGE dengan sistem buffer Laemmli. Konsentrasi gel poliakrilamida yang
digunakan adalah 10. a.
Preparasi sampel Kultur hasil iradiasi sinar gamma dengan dosis yang berbeda diambil
sebanyak 40 µl dengan mikropipet ke dalam tabung effendorf, ditambahkan aseton sebanyak 40 µl dan disonikasi selama 15 menit, lalu ditambahkan
buffer sampel sebanyak 20 µl dan divortek hingga homogen, kemudian dididihkan selama + 5 menit, setelah itu disentrifuge selama 5 menit.
b. Preparasi gel elektroforesis
- Separating gel 10
30 Acrylamide solution 6 ml ditambahkan separating gel buffer 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 sebanyak 4,5 ml, kemudian aquabides 7,5 ml dan 10
Ammonium persulfate 0,08 ml serta TEMED 0,01 ml.
- Stacking gel 45
30 Acrylamide solution 0,9 ml ditambahkan stacking gel buffer 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 sebanyak 1,5 ml, kemudian aquabides 3,6 ml dan 10
Ammonium persulfate 0,02 ml serta TEMED 0,01 ml.
c. Pembuatan kolom gel
Setelah separating gel dibuat kemudian dimasukkan sedikit demi sedikit ke dalam alat elektroforesis dengan mikropipet, lalu ditambahkan aquabides
untuk meratakan separating gel tersebut. Setelah separating gel membeku dimasukkan stacking gel sedikit demi sedikit, lalu pasang sisir pembentuk
kolom biarkan hingga stacking gel membeku lalu diangkat sisirnya. Kemudian dipasang hasil gel tersebut pada perangkat elektroforesis.
d. Loading sampel
Larutan buffer dimasukkan ke dalam tangki elektroforesis. Kemudian sampel sebanyak 15 µl dimasukkan ke dalam kolom gel dengan hati-hati lalu
dielektroforesis selama + 100 menit pada 200 Volt, 40 mA. e.
Pewarnaan gel Gel diangkat lalu diwarnai dengan coomassie brilliant blue staining gel warna
biru Coomassie R-250, selama + 1 jam.
f. Pencucian gel
Gel dicuci dengan larutan destain solution coomassie R-250, selama + 1 hari. Selanjutnya hasil pencucian discan dan dianalisis menggunakan LabImage 1D
2006 dan SPSS 11.5.
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN
Kategori