BAB III METODE PENELITIAN
3.1 Lokasi dan Waktu Penelitian
Penelitian dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan, Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya Bogor. Penelitian dilakukan dari bulan Juni-Desember
2012. Pengamatan rutin dilakukan selama 4 empat bulan yakni bulan Juni- September 2012. Namun, pengamatan visual tetap dilakukan hingga bulan
Desember 2012.
3.2 Alat dan Bahan Penelitian
Alat yang digunakan untuk pembuatan media antara lain gelas piala, gelas ukur biasa, pipet volumetrik, neraca analitik, pH meter, panci, pengaduk,
autoclave, karet gelang, timbangan analitik, magnetic stirer, labu erlenmeyer, botol kultur, dan alumunium foil. Proses penanaman menggunakan alat-alat antara
lain scalpel, tisu, cawan petri, pisau, pinset, lampu Bunsen, laminar air flow cabinet,dan wrap plastic. Alat untuk pengamatan diantaranya alat tulis, tally
sheet, dan kamera. Bahan tanam eksplan yang digunakan adalah kultur kantong semar
Nepenthes gracilis Korth koleksi Laboratorium Kultur Jaringan, Pusat Konservasi Tumbuhan, Kebun Raya Bogor, yang berasal dari pulau Batam dan
telah disubkultur secara in vitro dengan ukuran 2 cm, 2-4 cm dan 4 cm pada media dasar 12MS Gambar 5a. Media dasar yang digunakan adalah media
Murashige Skoog dengan berbagai konsentrasi yakni 12MS, 14MS, 18MS, 116MS dan 132MS. 12MS berarti bahwa seluruh komponen unsur yang
terkandung dalam media dasar seperti unsur makro, mikro, vitamin Gambar 5b dan gula berjumlah setengah dari konsentrasi keseluruhan pada media dasar MS
penuh.
Gambar 5 Bahan tanam N.gracilis A dan komponen media dasar MS yang digunakan B.
3.3 Pelaksanaan Penelitian 3.3.1 Sterilisasi alat
Peralatan berupa botol kultur, cawan petri, scalpel, pinset dicuci dengan menggunakan detergen untuk menghilangkan kotoran yang masih melekat pada
peralatan tersebut. Setelah dicuci dan dibersihkan kemudian botol dan peralatan dibilas dengan air. Peralatan tersebut kemudian ditiriskan untuk menghilangkan
sisa air dengan posisi terbalik mulut botol berada di bawah. Khusus unttuk peralatan berbahan besi, setelah pembilasan sebaiknya langsung dikeringkan
dengan menggunakan tisu untuk menghindari timbulnya karat. Sterilisasi selanjutnya menggunakan autoclave. Peralatan dimasukkan ke
dalam autoclave dengan penataan yang sesuai. Botol kultur disusun dengan rapi dan rapat dalam kondisi terbalik. Sterilisasi peralatan dilakukan selama satu jam
pada suhu 121ºC dan tekanan 1 atm. Kemudian peralatan tersebut disimpan di dalam oven.
3.3.2 Pembuatan media
Media dasar Murashige Skoog MS dibuat menjadi beberapa modifikasi konsentrasi tanpa penambahan zat pengatur tumbuh ZPT Lampiran 1.
Pembuatan media modifikasi konsentrasi sebanyak 1 liter pada masing-masing modifikasi dilakukan dengan cara pengenceran bertingkat. Pertama-tama dibuat
media MS penuh dengan mencampurkan seluruh komponen unsur makro, mikro, vitamin dan gula misalnya didapatkan volume larutan sebanyak 500 ml. Volume
tersebut kemudian dibagi menjadi dua bagian masing-masing 250 ml yang kemudian salah satunya ditambahkan aquades hingga mencapai volume total 1
A B
liter. Media tersebut merupakan media dengan konsentrasi 12 MS. Volume media sebanyak 250 ml yang masih tersisa dibagi lagi menjadi dua bagian menjadi 125
ml yang kemudian salah satunya ditambah aquades hingga volume total 1 liter. Media tersebut merupakan media dengan konsentrasi 14 MS. Volume yang
masih tersisa diencerkan kembali hingga didapat keseluruhan modifikasi konsentrasi.
Modifikasi konsentrasi media yang telah didapat kemudian diukur pH dengan menggunakan pH meter. Tingkat keasaman yang digunakan adalah 5,7.
Jika pH pada pengukuran awal lebih tinggi maka larutan ditetesi dengan HCL 0,1 N, sedangkan apabila pH awal lebih rendah maka larutan ditetesi dengan KOH 0,1
N hingga didapat pH yang digunakan pada penelitian. Sebelum pemanasan, masing-masing modifikasi konsentrasi media
ditambahkan terlebih dahulu agar gelrite sebanyak 2,01 mgl. Setelah mendidih, larutan dituang ke dalam botol kecil masing-masing sebanyak 20 ml kemudian
ditutup dengan alumunium foil berukuran 10 cm × 10 cm dan diikat dengan karet gelang.
Langkah sterilisasi media dasar dan perlakuan hampir sama dengan sterilisasi alat. Sterilisasi dilakukan dengan autoclave pada suhu 121ºC dan
tekanan 1 atm selama 15 menit. Media yang telah steril kemudian disimpan di dalam ruang media dan dibiarkan selama 3 hari untuk memastikan tidak terjadi
kontaminasi pada media tanam.
3.3.3 Penanamansubkultur
Bahan dan alat penanaman disiapkan dalam laminar air flow cabinet. Bahan tanam eksplan berupa planlet N.gracilis dikeluarkan dari botol kultur dan
dipindahkan ke cawan petri untuk dibersihkan akar tanaman dengan menggunakan gunting kultur. Eksplan tersebut kemudian ditanam pada media
perlakuan. Sebelum botol ditutup, bagian bibir botol dan tutup aluminium foil terlebih dahulu dibakar dengan lampu bunsen untuk mencegah kontaminasi.
Proses penanaman dilakukan dengan cepat dan hati-hati karena semakin lama botol terbuka, semakin besar pula peluang kontaminan masuk ke dalam botol.
Selain itu, Nepenthes mudah layu sehingga semakin singkat proses penanaman semakin baik. Botol-botol yang telah berisi tanaman diletakkan di ruang kultur.
3.3.4 Pengamatan
Pengamatan dilakukan setiap minggu selama dua belas minggu setelah penanaman MSP untuk parameter tinggi tanaman, jumlah daun, dan jumlah
kantong. Parameter lain berupa warna daun dan kantong, persentase planlet hidup dan persentase planlet berkantong dilakukan pada minggu terakhir pengamatan.
a. Tinggi tanaman cm: diukur dari pangkal sampai titik tumbuh
b. Jumlah daun helai: dihitung jumlah daun yang terbentuk pada setiap
eksplan c.
Jumlah kantong buah: dihitung jumlah kantong yang terbentuk pada setiap eksplan
d. Warna daun dan kantong diamati secara kualitatif seperti pada Tabel 1.
Tabel 1 Morfologi warna daun dan kantong dengan bagan warna daun BWD
Morfologi BWD
Warna Daun Hijau tua
5 Hijau
4 Hijau muda
3 Hijau Kekuningan
2
Warna Kantong Hijau tua
5 Hijau muda
Merah maron 3
Coklat kemerahan
Pengukuran warna daun dilakukan dengan menggunakan bagan warna daun BWD seperti pada Gambar 6.
Sumber: Anonim 2012
Gambar 6 Bagan warna daun BWD. e.
Persentase planlet hidup : dihitung dari total eksplan yang hidup per total keseluruhan eksplan setiap kombinasi perlakuan kemudian dikali 100
f. Persentase planlet berkantong : dihitung dari total eksplan yang
berkantong per total keseluruhan eksplan setiap kombinasi perlakuan kemudian dikali 100.
3.4 Rancangan Percobaan
Rancangan percobaan yang digunakan dalam penelitian ini adalah Rancangan Faktorial dengan Acak Lengkap RAL-F. Jumlah faktor dalam
penelitian ini terdiri dari konsentrasi media dasar dan ukuran planlet. Kombinasi perlakuan digunakan sebanyak 15 kombinasi dengan 3 ulangan sehingga didapat
45 unit percobaan. Satu unit percobaan terdapat 4 botol yang masing-masing botol ditanam 1 planlet. Jumlah total botol kombinasi yang digunakan dalam penelitian
ini adalah sebanyak 180 botol. Kombinasi perlakuan dapat dilihat pada Tabel 2. Tabel 2 Kombinasi perlakuan konsentrasi media MS dan ukuran eksplan
Media MS Ukuran eksplan
2 cm 1 2-4 cm 2
˃ 4 cm 3
12MS A A1
A2 A3
14MS B B1
B2 B3
18MS C C1
C2 C3
116MS D D1
D2 D3
132MS E E1
E2 E3
3.5 Analisis Data
Kategori