III. METODOLOGI PENELITIAN
A. BAHAN DAN ALAT
Sampel pati resistan yang digunakan pada penelitian ini adalah pati resistan beras Cisokan dan pati sagu asal Sukabumi yang diperoleh dari Balai
Besar Penelitian Pasca Panen. Pati resistan yang digunakan merupakan RS tipe 3 hasil retrogradasi dan hidrolisis enzimatik dengan enzim pullulanase 160
NPUNg substrat. Kontrol yang digunakan adalah pati resistan komersial High Maize dengan merek dagang Novelose 260 National Starch. Bakteri
fermentatif yang digunakan adalah Clostridium butyricum BCC B2571 yang berasal dari kultur Balai Besar Veteriner.
Bahan yang digunakan adalah yeast extract, beef extract, peptone, glukosa, soluble starch, sodium klorida, sodium asetat, cystein hidrocloride,
bacto agar, indikator potensial redox resazurin, gas CO
2
, K
2
SO
4
, HgO, H
2
SO
4
pekat, NaOH, H
2
BO
3
, HCl, KOH 2 M, amilosa murni, etanol 95, asam asetat 1 N, larutan iod, KI, buffer KCl-HCl pH 1.5, buffer Trismaleate 0.1 M pH 6.9,
akuades, larutan α-amilase, larutan amiloglukosidase, pepsin, buffer sodium asetat 0.4 M pH 4.75, fenol 5, standar butirat Fluka dan standar asetat
Fluka. Alat yang digunakan adalah kromatografi gas Agilent technologies 7890
A, anoxomat, spektofotometer, inkubator, mikropipet, tabung reaksi, syringe 1 ml, cawan petri, pipet, timbangan analitik, sentrifus, tabung sentrifus, cawan
aluminium, oven, desikator, cawan porselen, labu kjedahl 100 ml, alat destilasi, labu lemak, kertas saring, soxhlet, water-bath bergoyang, dan autoclave.
B. METODE PENELITIAN
1. Pembuatan medium RCM
Reinforced Clostridial Medium
Medium pertumbuhan Clostridium yang digunakan adalah RCM Reinforced Clostridial Medium yang mengandung substansi seperti yang
disajikan pada Tabel 2. Medium ini selanjutnya disebut sebagai medium
basal. Seluruh bahan tersebut, kecuali cystein hidrocloride, dicampur, kemudian pH medium di atur menjadi 6.8 dan ditambahkan indikator
potensial redoks resazurin sebesar 0.1 ml100 ml. Penambahan resazurin akan menyebabkan warna medium menjadi merah muda saat dipanaskan.
Campuran medium tersebut dididihkan hingga indikator resazurin berubah warna dari merah muda menjadi tidak berwarna, kemudian didinginkan
dengan dihembus gas CO
2.
Setelah dingin, cystein hidroclorida ditambahkan dan diaduk rata. Medium dimasukkan ke dalam tabung
reaksi bertutup butyl rubber, kemudian disterilisasi pada 121 C selama 20
menit. Media dapat disimpan pada suhu beku frezeer sebelum digunakan.
Tabel 2. Komposisi medium basal Reinforced Clostridial Medium RCM
Bahan Jumlah
gL
Yeast Extract 3,0
Beef Extract powder 10,0
Pepton 5,0
Glucose 1,0
Soluble Starch 2,0
Sodium Chlorida 5,0
Sodium Acetate 3,0
Cystein hidrocloride 0,5
pH medium 6,8 ± 0,2
2. Aktivasi dan fermentasi in vitro
Clostridium butyricum BCC B2571 Teknik Hungate
Kultur bakteri Clostridium butyricum BCC B2571 diaktivasi dengan cara menginokulasi 5 ml strain ke dalam tabung berisi 5 ml
medium basal RCM dengan menggunakan syringe. Tabung tersebut diinkubasi secara anaerob pada suhu 37
C selama 24 jam. Kultur bakteri diawetkan dengan menyimpannya pada suhu dingin 5
C. Bakteri disegarkan setiap sebulan sekali atau setiap akan digunakan sebagai kultur
fermentasi.
Fermentasi in vitro dilakukan untuk mengamati pertumbuhan bakteri pada substrat uji Hi maize, pati resistan sagu dan pati resistan
beras. Fermentasi dilakukan dengan menggunakan teknik hungate untuk menjaga kondisi anaerob berdasarkan metode Sanz et al. 2005. Substrat
berupa Hi maize, RS beras dan RS sagu masing-masing sebanyak 2 ditambahkan ke medium basal sebagai pengganti soluble starch. Medium
fermentasi dimasukkan ke dalam tabung fermentasi sebanyak 4.5 ml, disterilisasi 121
C selama 20 menit kemudian diinokulasikan dengan 0.5 ml kultur bakteri segar berumur 24 jam. Fermentasi dilakukan selama 48
jam dan diamati pertumbuhannya pada jam ke- 3, 24, 30, 38, 42 dan 48. Perhitungan dilakukan dengan metode Total Plate Count TPC yakni
koloni di antara 25-250 Harrigan, 1998 . Perhitungan sebagai berikut:
Keterangan: n
1
= jumlah cawan pengenceran pertama yang dihitung n
2
= jumlah cawan pengenceran kedua yang dihitung FP = Faktor pengenceran
TPC = jumlah koloni 1n
1
+ 0.1 n
2
x FP
C. METODE ANALISIS
1. Analisis Kadar Air, Metode Oven AOAC, 1995
