4
II. BAHAN DAN METODE 2.1
Rancangan Perlakuan
Penelitian ini terdiri dari enam perlakuan yang masing-masing diberi 3 kali ulangan. Perlakuan yang diberikan berupa perendaman dengan dosis rElHP
berbeda yaitu 0, 3, 6, 9, dan 12 mgL dalam larutan NaCl 0,6 yang ditambah serum albumin sapi BSA 0,01, dan kontrol yang direndam dalam larutan NaCl
0,6 tanpa BSA dan rElHP. Penelitian menggunakan rancangan acak lengkap Tabel 1. Benih ikan sidat yang digunakan yaitu stadia glass eel yang diperoleh
dari pengumpul di Pelabuhan Ratu, Jawa Barat. Tabel 1. Rancangan perlakuan
Perlakuan Notasi
Perendaman 1
NaCl 0,6, BSA 0,01, dan rElHP 0 mgL 2
3 NaCl 0,6, BSA 0,01, dan rElHP 3 mgL
3 6
NaCl 0,6, BSA 0,01, dan rElHP 6 mgL 4
9 NaCl 0,6, BSA 0,01, dan rElHP 9 mgL
5 12
NaCl 0,6, BSA 0,01, dan rElHP 12 mgL 6
K NaCl 0,6
2.2 Produksi Hormon Pertumbuhan Rekombinan rHP
Penelitian ini dimulai dari produksi protein rHP dengan menggunakan bakteri Escherichia coli BL21 DE3 yang mengandung konstruksi pCold-IElHP
Alimuddin et al., 2010. Protein rekombinan yang dihasilkan adalah rHP ikan kerapu kertang ElHP. Bakteri E. coli yang mengandung konstruksi pCold-
IElHP dikultur dalam 3 mL media LB cair yang mengandung ampisilin dan NaOH 5M, dan diinkubasi pada suhu 37
C selama 18 jam menggunakan shaker 200 rpm. Setelah itu dilakukan subkultur dengan mengambil 1 dari kultur
sebelumnya dan dimasukkan ke dalam media LB cair mengandung ampisilin dan NaOH 5M yang baru, diinkubasi lagi menggunakan shaker 200 rpm pada suhu
37
o
C selama 3 jam. Induksi produksi rHP dilakukan dengan memberikan kejutan suhu 15
o
C selama 30 menit, ditambahkan IPTG 100 mM sebanyak 750 µL dan diinkubasi menggunakan shaker pada suhu 15
o
C selama 24 jam. Hasil kultur kemudian disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm selama 1 menit untuk
mengendapkan sel bakteri. Setelah itu pelet bakteri dicuci menggunakan buffer
5 phosphate saline
BFS sebanyak 1 kali, kemudian disimpan di deep-freezer - 80
o
C hingga akan digunakan. Pelet bakteri hasil sentrifugasi dicuci menggunakan bufer tris-EDTA TE
sebanyak 1 mL per 200 mg bakteri, diinkubasi pada suhu 37
o
C selama 20 menit dan kemudian disentrifugasi pada suhu 4
o
C dengan kecepatan 12.000 rpm selama 2 menit. Supernatan dibuang, dan ke dalam tabung berisi pelet bakteri dimasukkan
500 µL larutan lisozim 10 mg dalam 1 mL bufer TE untuk melisis dinding bakteri. Proses dilakukan selama 20 menit pada 37
o
C, lalu disentrifugasi pada 12.000 rpm selama 15 menit. Supernatan dibuang, dan endapan yang terbentuk
merupakan pelet protein rHP dalam bentuk badan inklusi inclusion body. Pelet protein rHP dicuci dengan BFS sebanyak 1 mL, pencucian dilakukan sebanyak 2
kali. Setelah selesai, protein di simpan dalam deep-freezer hingga akan digunakan.
2.3 Perendaman Ikan dalam Larutan rHP
Kategori