BAB 3
METODE PENELITIAN
3.1 Alat-alat
1. Spektrofotometer
1
H-NMR JeolDelta2NMR
500MHz 2.
Spektrofotometer FT-IR Shimadzu
3. Spektrofotometer UV-Vis
4. Kolom Kromatografi
5. Rotarievapotaror Bűchi R-114
6. Labu rotarievaporator
1000 mL Schoot Duran
7. Lampu UV
254nm356nm UVGL 58
8. Neraca Analitis Mettler AE 200
9. Chamber 10. Ekstraktor
5000 mL SchootDuran
11. Alat destilasi 12. Labu takar
250 mL Pyrex
13. Corong Pisah 1000 mL
Pyrex 14. Gelas Beaker
500mL1000mL Pyrex 15. Gelas Erlenmeyer
250 mL Pyrex
16. Penangas air 17. Corong Kaca
18. Gelas Ukur 100 mL 10 mL
Pyrex 19. Spatula
20. Pipa Kapiler 21. Statif dan Klem
22. Tabung Reaksi Pyrex
23. Pipet Tetes 24. Botol Vial
12 mL 25. Batang Pengaduk
Universitas Sumatera Utara
3.2 Bahan-bahan
1. Daun Tumbuhan Kaliandra
2. Metanol
Destilasi 3.
Etil asetat Teknis
4. Aquadest
5. N-heksana
Teknis 6.
Silika gel 40 70-230 mesh ASTM E.Merck. KgA 7.
FeCl
3
5 8.
NaOH 10 9.
Serbuk Mg 10. HCl
p
11. H
2
SO
4p
12. Pereaksi Benedict 13. HCl 6
14. Kapas 15. Kloroform
Teknis 16. Plat KLT silika gel 60 F
254
E.Merck.Art 554 17. Plat KLT Preparatif 60 F
254
18. Benzena p.a. E. Merck
19. Aseton p.a. E. Merck
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Penyediaan Sampel
Sampel yang diteliti adalah daun kaliandra yang diperoleh dari daerah, Sumatera Utara. Daun tumbuhan Kaliandra dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan
sampai diperoleh serbuk daun Kaliandra sebanyak 1000 g.
Universitas Sumatera Utara
3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Kaliandra
Serbuk daun Kaliandra diidentifikasi dengan menggunakan cara Skrining Fitokimia. Untuk membuktikan adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam
daun tumbuhan Kaliandra maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna sebagai berikut:
Pertama-tama,dimasukkan 10 gram serabuk daun Kaliandra yang telah dikeringkan kedalam dua gelas erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 100 ml
metanol kedalam erlenmeyer I dan 100 ml etil asetat kedalam erlenmeyer II. Kemudian didiamkan 1 malam. Kemudian disaring. Selanjutnya ekstrak dari
metanol dan etil asetat masing-masing dibagi kedalam 4 tabung reaksi. Kemudian masing-masing tabung reaksi ditambahkan dengan pereaksi :
- Untuk ekstrak metanol sampel
a. Tabung I : dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan serbuk Mg, dan HCl
p
menghasilkan larutan merah jambu
c. Tabung III: dengan NaOH 10 menghasilkan larutan hijau kekuningan d. Tabung IV: dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutan hijau kehitaman
- Untuk ekstrak etil asetat sampel a. Tabung I : dengan FeCl
3
5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan serbuk Mg, dan HCl
p
menghasilkan larutan merah jambu
c. Tabung III: dengan NaOH 10 menghasilkan endapan kuning kecoklatan d. Tabung IV: dengan H
2
SO
4p
menghasilkan larutan hijau kehitaman
Universitas Sumatera Utara
3.3.3 Ekstraksi Daun Tumbuhan Kaliandra
Serbuk daun Kaliandra ditimbang sebanyak 1000 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 16 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama 24
jam. Maserasi ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan
hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemisahan tanin dengan cara melarutkan fraksi pekat metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat
kemudian di rotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol dan di ekstraksi
partisi berulang-ulang dengan n-heksana sampai lapisan n-heksana hampir bening. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali
dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ektrak pekat lapisan metanol. Fraksi metanol di uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict,
lalu di hidrolisis dengan menggunakan HCl 6 sambil di panaskan diatas penangas air selama ± 60 menit. Kemudian disaring dan filtrat yang diperoleh di
ektraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali hingga bening. Ekstrak kloroform dipekatkan dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga
diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 1,4 g.
3.3.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis
Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak kloroform dengan menggunakan fase diam silika gel 60F
254
Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari sistem dan perbandingan pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom.
Fasa gerak yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50vv.
Dimasukkan 10 ml campuran larutan fase gerak n-heksana: etil asetat 90:10 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Di totolkan
ekstrak pekat kloroform pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, lalu di
Universitas Sumatera Utara
tutup dan di elusi. Plat yang telah di elusi, di keluarkan dari bejana, lalu di keringkan.
Di amati noda yang terbentuk dibawah sinar UV, kemudian difiksasi dengan pereaksi FeCl
3
5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n-
heksana:etil asetat dengan perbandingan 80:20, 70:30, 60:40 vv.
3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom
Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel
40 70-230 mesh ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50vv.
Dirangkai alat kromatografkolom. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga
homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen.
Dibuburkan 1,4 g ekstrak pekat kloroform dengan silika gel dengan pelarut kloroform, kemudian dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi
bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat 90:10 vv secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama
banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 80:20
vv, 70:30 vv, 60:40 vv, dan 50:50 vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap ± 10 mL, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf
yang sama lalu diuji dengan FeCl
3
5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk pasta.
Universitas Sumatera Utara
3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT
Uji kemurnian pasta dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F
254
dengan fasa gerak n-heksana:etil asetat 60:40 vv, dan kloroform:metanol 70:30 vv.
Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi lapis tipis, lalu dijenuhkan. Ditotolkan pasta yang sebelumnya dilarutkan dengan
kloroform pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi lapis tipis yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes
sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, diamati di bawah sinar UV, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl
3
5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya
senyawa flavonoida.
3.3.7 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi
3.3.7.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible
Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam ITB, Jalan Ganesha 10- Bandung, Jawa Barat dengan
menggunakan pelarut metanol.
3.3.7.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR
Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam ITB, Jalan Ganesha 10- Bandung, Jawa Barat dengan
menggunakan pelarut KBr.
Universitas Sumatera Utara
3.3.7.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton
1
H-NMR
Analisis dengan alat Spektrometer
1
H-NMR diperoleh dari Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam ITB, Jalan Ganesha 10- Bandung dengan menggunakan
Aseton sebagai pelarut.
Universitas Sumatera Utara
3.4 Bagan Skrining Fitokimia Maserasi dengan pelarut Metanol
Serbuk daun tumbuhan kaliandra Calliandra calothyrsus
Diekstraksi maserasi dengan metanol Disaring
Dibagi kedalam 2 tabung reaksi
Ditambahkan pereaksi
FeCl
3
5 Diamati
perubahan warna
Larutan hitam positif fenolik
Ditambahkan pereaksi
Mg-HCl
Diamati perubahan
warna
Larutan merah muda positif fenolik
Tabung I Larutan Hijau
Tabung II Larutan Hijau
Universitas Sumatera Utara
Maserasi dengan pelarut Etil asetat
Serbuk daun tumbuhan kaliandra Calliandra calothyrsus
Diekstraksi maserasi dengan etil asetat Disaring
Dibagi kedalam 2 tabung reaksi
Ditambahkan pereaksi
FeCl
3
5 Diamati
perubahan warna
Larutan hitam positif flavonoid
Ditambahkan pereaksi
Mg-HCl Diamati
perubahan warna
Larutan merah muda positif flavonoid
Tabung I Larutan Hijau
Tabung II Larutan Hijau
Universitas Sumatera Utara
3.5 Bagan Penelitian