Alat-alat Bahan-bahan Bagan Skrining Fitokimia Maserasi dengan pelarut Metanol

BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Alat-alat

1. Spektrofotometer 1 H-NMR JeolDelta2NMR 500MHz 2. Spektrofotometer FT-IR Shimadzu 3. Spektrofotometer UV-Vis 4. Kolom Kromatografi 5. Rotarievapotaror Bűchi R-114 6. Labu rotarievaporator 1000 mL Schoot Duran 7. Lampu UV 254nm356nm UVGL 58 8. Neraca Analitis Mettler AE 200 9. Chamber 10. Ekstraktor 5000 mL SchootDuran 11. Alat destilasi 12. Labu takar 250 mL Pyrex 13. Corong Pisah 1000 mL Pyrex 14. Gelas Beaker 500mL1000mL Pyrex 15. Gelas Erlenmeyer 250 mL Pyrex 16. Penangas air 17. Corong Kaca 18. Gelas Ukur 100 mL 10 mL Pyrex 19. Spatula 20. Pipa Kapiler 21. Statif dan Klem 22. Tabung Reaksi Pyrex 23. Pipet Tetes 24. Botol Vial 12 mL 25. Batang Pengaduk Universitas Sumatera Utara

3.2 Bahan-bahan

1. Daun Tumbuhan Kaliandra 2. Metanol Destilasi 3. Etil asetat Teknis 4. Aquadest 5. N-heksana Teknis 6. Silika gel 40 70-230 mesh ASTM E.Merck. KgA 7. FeCl 3 5 8. NaOH 10 9. Serbuk Mg 10. HCl p 11. H 2 SO 4p 12. Pereaksi Benedict 13. HCl 6 14. Kapas 15. Kloroform Teknis 16. Plat KLT silika gel 60 F 254 E.Merck.Art 554 17. Plat KLT Preparatif 60 F 254 18. Benzena p.a. E. Merck 19. Aseton p.a. E. Merck

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Penyediaan Sampel

Sampel yang diteliti adalah daun kaliandra yang diperoleh dari daerah, Sumatera Utara. Daun tumbuhan Kaliandra dikeringkan di udara terbuka, lalu dihaluskan sampai diperoleh serbuk daun Kaliandra sebanyak 1000 g. Universitas Sumatera Utara

3.3.2 Uji Pendahuluan Terhadap Ekstrak Daun Tumbuhan Kaliandra

Serbuk daun Kaliandra diidentifikasi dengan menggunakan cara Skrining Fitokimia. Untuk membuktikan adanya senyawa flavonoida yang terdapat dalam daun tumbuhan Kaliandra maka dilakukan uji pendahuluan secara kualitatif dengan reaksi warna sebagai berikut: Pertama-tama,dimasukkan 10 gram serabuk daun Kaliandra yang telah dikeringkan kedalam dua gelas erlenmeyer. Kemudian ditambahkan 100 ml metanol kedalam erlenmeyer I dan 100 ml etil asetat kedalam erlenmeyer II. Kemudian didiamkan 1 malam. Kemudian disaring. Selanjutnya ekstrak dari metanol dan etil asetat masing-masing dibagi kedalam 4 tabung reaksi. Kemudian masing-masing tabung reaksi ditambahkan dengan pereaksi : - Untuk ekstrak metanol sampel a. Tabung I : dengan FeCl 3 5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan serbuk Mg, dan HCl p menghasilkan larutan merah jambu c. Tabung III: dengan NaOH 10 menghasilkan larutan hijau kekuningan d. Tabung IV: dengan H 2 SO 4p menghasilkan larutan hijau kehitaman - Untuk ekstrak etil asetat sampel a. Tabung I : dengan FeCl 3 5 menghasilkan larutan berwarna hitam b. Tabung II : dengan serbuk Mg, dan HCl p menghasilkan larutan merah jambu c. Tabung III: dengan NaOH 10 menghasilkan endapan kuning kecoklatan d. Tabung IV: dengan H 2 SO 4p menghasilkan larutan hijau kehitaman Universitas Sumatera Utara

3.3.3 Ekstraksi Daun Tumbuhan Kaliandra

Serbuk daun Kaliandra ditimbang sebanyak 1000 g, kemudian dimaserasi dengan metanol sebanyak ± 16 L sampai semua sampel terendam dan dibiarkan selama 24 jam. Maserasi ditampung dan dipekatkan dengan menggunakan alat rotarievaporator sehingga diperoleh ekstrak pekat metanol. Kemudian diuapkan hingga semua pelarut metanol menguap. Lalu dilakukan pemisahan tanin dengan cara melarutkan fraksi pekat metanol dengan etil asetat, dan disaring. Filtrat kemudian di rotarievaporator lalu diuapkan hingga semua pelarut etil asetat menguap. Lalu fraksi pekat etil asetat dilarutkan dengan metanol dan di ekstraksi partisi berulang-ulang dengan n-heksana sampai lapisan n-heksana hampir bening. Lapisan metanol dipisahkan dari lapisan n-heksana, lalu dipekatkan kembali dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ektrak pekat lapisan metanol. Fraksi metanol di uji kandungan gula dengan pereaksi Benedict, lalu di hidrolisis dengan menggunakan HCl 6 sambil di panaskan diatas penangas air selama ± 60 menit. Kemudian disaring dan filtrat yang diperoleh di ektraksi partisi dengan kloroform sebanyak 3 kali hingga bening. Ekstrak kloroform dipekatkan dengan rotarievaporator dan diuapkan kembali sehingga diperoleh ekstrak pekat kloroform sebanyak 1,4 g.

3.3.4 Analisis Kromatografi Lapis Tipis

Analisis Kromatografi Lapis Tipis dilakukan terhadap ekstrak kloroform dengan menggunakan fase diam silika gel 60F 254 Merck. Analisis ini dimaksudkan untuk mencari sistem dan perbandingan pelarut yang sesuai untuk kromatografi kolom. Fasa gerak yang digunakan adalah campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50vv. Dimasukkan 10 ml campuran larutan fase gerak n-heksana: etil asetat 90:10 vv ke dalam bejana kromatografi, kemudian dijenuhkan. Di totolkan ekstrak pekat kloroform pada plat KLT yang telah diaktifkan. Dimasukkan plat ke dalam bejana yang telah berisi campuran pelarut yang telah dijenuhkan, lalu di Universitas Sumatera Utara tutup dan di elusi. Plat yang telah di elusi, di keluarkan dari bejana, lalu di keringkan. Di amati noda yang terbentuk dibawah sinar UV, kemudian difiksasi dengan pereaksi FeCl 3 5. Diamati warna bercak yang timbul dan dihitung harga Rf yang diperoleh. Perlakuan yang sama dilakukan untuk perbandingan pelarut n- heksana:etil asetat dengan perbandingan 80:20, 70:30, 60:40 vv.

3.3.5 Isolasi Senyawa Flavonoida dengan Kromatografi Kolom

Isolasi senyawa flavonoida secara kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak pekat kloroform yang telah diperoleh. Fasa diam yang digunakan adalah silika gel 40 70-230 mesh ASTM dan fasa gerak yaitu n-heksana 100, campuran pelarut n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 90:10, 80:20, 70:30, 60:40, 50:50vv. Dirangkai alat kromatografkolom. Terlebih dahulu dibuburkan silika gel 40 70-230 mesh ASTM dengan menggunakan n-heksana, diaduk-aduk hingga homogen lalu dimasukkan ke dalam kolom kromatografi. Kemudian dielusi dengan menggunakan n-heksana 100 hingga silika gel padat dan homogen. Dibuburkan 1,4 g ekstrak pekat kloroform dengan silika gel dengan pelarut kloroform, kemudian dimasukkan ke dalam kolom kromatografi yang telah berisi bubur silika gel, lalu ditambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat 90:10 vv secara perlahan-lahan dan diatur sehingga aliran fasa yang keluar dari kolom sama banyaknya dengan penambahan fasa gerak dari atas. Ditingkatkan kepolaran dengan menambahkan fasa gerak n-heksana:etil asetat dengan perbandingan 80:20 vv, 70:30 vv, 60:40 vv, dan 50:50 vv. Hasil yang diperoleh ditampung dalam botol vial setiap ± 10 mL, lalu di KLT dan digabung fraksi dengan harga Rf yang sama lalu diuji dengan FeCl 3 5. Kemudian diuapkan sampai terbentuk pasta. Universitas Sumatera Utara

3.3.6 Uji Kemurnian Hasil Isolasi dengan Kromatografi Lapis Tipis KLT

Uji kemurnian pasta dilakukan dengan kromatografi lapis tipis dengan menggunakan fasa diam silika gel 60 F 254 dengan fasa gerak n-heksana:etil asetat 60:40 vv, dan kloroform:metanol 70:30 vv. Dimasukkan 10 mL larutan fasa gerak ke dalam bejana kromatografi lapis tipis, lalu dijenuhkan. Ditotolkan pasta yang sebelumnya dilarutkan dengan kloroform pada plat KLT. Dimasukkan plat KLT tersebut ke dalam bejana kromatografi lapis tipis yang telah jenuh. Setelah pelarut fasa gerak merembes sampai batas tanda, plat KLT dikeluarkan dari bejana, dikeringkan, diamati di bawah sinar UV, dan difiksasi dengan menggunakan pereaksi FeCl 3 5 dalam metanol menghasilkan bercak berwarna hitam yang menunjukkan adanya senyawa flavonoida.

3.3.7 Identifikasi Senyawa Hasil Isolasi

3.3.7.1 Identifikasi dengan Spektrofotometer UV-Visible

Analisis dengan alat Spektrofotometer UV-Visible diperoleh dari Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam ITB, Jalan Ganesha 10- Bandung, Jawa Barat dengan menggunakan pelarut metanol.

3.3.7.2 Identifikasi dengan Spektrofotometer Inframerah FT-IR

Analisis dengan alat Spektrofotometer FT-IR diperoleh dari Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam ITB, Jalan Ganesha 10- Bandung, Jawa Barat dengan menggunakan pelarut KBr. Universitas Sumatera Utara

3.3.7.3 Identifikasi dengan Spektrometer Resonansi Magnetik Inti Proton

1 H-NMR Analisis dengan alat Spektrometer 1 H-NMR diperoleh dari Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam ITB, Jalan Ganesha 10- Bandung dengan menggunakan Aseton sebagai pelarut. Universitas Sumatera Utara

3.4 Bagan Skrining Fitokimia Maserasi dengan pelarut Metanol

Serbuk daun tumbuhan kaliandra Calliandra calothyrsus Diekstraksi maserasi dengan metanol Disaring Dibagi kedalam 2 tabung reaksi Ditambahkan pereaksi FeCl 3 5 Diamati perubahan warna Larutan hitam positif fenolik Ditambahkan pereaksi Mg-HCl Diamati perubahan warna Larutan merah muda positif fenolik Tabung I Larutan Hijau Tabung II Larutan Hijau Universitas Sumatera Utara Maserasi dengan pelarut Etil asetat Serbuk daun tumbuhan kaliandra Calliandra calothyrsus Diekstraksi maserasi dengan etil asetat Disaring Dibagi kedalam 2 tabung reaksi Ditambahkan pereaksi FeCl 3 5 Diamati perubahan warna Larutan hitam positif flavonoid Ditambahkan pereaksi Mg-HCl Diamati perubahan warna Larutan merah muda positif flavonoid Tabung I Larutan Hijau Tabung II Larutan Hijau Universitas Sumatera Utara

3.5 Bagan Penelitian