Sholeh Avivi Sudarsono Satriyas Ilyas da
OPTIMASI TRANSFORMASI GEN GUS KE JARINGAN
TANAMAN KACANG TANAH DENGAN BANTUAN
AGROBACTERIUM
Sholeh Avivi1), Sudarsono2), Satriyas Ilyas2), dan Hajrial Aswidinnoor2)
ABSTRACT
The aims of this research were: (1) to investigate the minimum concentration of
kanamycin antibiotic that could stop regeneration of peanut normal cell; (2) to know
the effect of the most effective bacteria population, the best time periode of
inoculation, the best time time periode of cocultivation, the explant type, and the best
time periode of preculture to optimize the Agrobacterium mediated transformation
on peanut.
We used pKIWI105 (gus and nptII gene inside) to achieve those
objectives. To know that the gene have been integrated inside the peanut explant we
used transient assay and integrative assay. From this study we concluded that the
best result of transformation system could obtain if we used 49 dap (days after
planting) embryonic callus as explants, 15 minute inoculation, 24 hours
cocultivation, and the bacteria concentration was OD600 = 0.5. The lowest
kanamycin concentration that could stop cell regeneration was 100 mg L-1.
Key words: Agrobacterium, gus, nptII, peanut
1) Staf Pengajar Jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian Universitas
Jember, Jl. Kalimantan, Jember 68121, e-mail: avi_vi@yahoo.com
2) Staf Pengajar Jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian Institut
Pertanian Bogor
1
ABSTRAK
Tujuan penelitian ini adalah untuk: (i) menemukan konsentrasi minimal
antibiotik kanamycin yang dapat menghentikan pertumbuhan sel kacang tanah
normal; (ii) untuk mengetahui pengaruh tingkat populasi bakteri, lama waktu
inokulasi, lama waktu kokultivasi, tipe eksplan, dan lama waktu prekultur untuk
mengoptimalkan transformasi gen dengan bantuan Agrobacterium pada kacang
tanah. Gen gus yang berada dalam plasmid pKIWI105 bersama-sama dengan gen
resistensi terhadap antibiotik kanamycin digunakan untuk mencapai tujuan tersebut.
Keberhasilan introduksi gen dianalisis pada saat dua hari sesudah inokulasi (transient
assay) dan pada beberapa percobaan dilakukan pula integrative assay. Hasil terbaik
integrasi gen gus pada kacang tanah dalam penelitian ini diperoleh jika digunakan
kalus embriogenik umur 49 HST sebagai eksplan dengan lama waktu inokulasi 15
menit, lama waktu kokultivasi 24 jam, dan konsentrasi bakteri OD600 = 0,5.
Konsentrasi kanamycin terendah yang sangat menghambat regenerasi sel
nontransgenik tanaman kacang tanah adalah 100 mg L-1.
Kata kunci: Agrobacterium, gus, nptII, kacang tanah
PENDAHULUAN
Setelah sistem regenerasi tanaman yang efektif secara in vitro ditemukan
maka tahap berikutnya yang harus dilakukan untuk dapat memperoleh tanaman
transgenik adalah introduksi DNA asing ke sel tanaman. Setelah gen dapat
terintroduksi ke dalam sel tanaman, sel tersebut perlu ditumbuhkan dalam media
seleksi yang mengandung antibiotik. Konsentrasi yang tepat dari antibiotik
penyeleksi ini perlu diketahui. Pada umumnya konsentrasi yang digunakan adalah
konsentrasi paling rendah yang dapat mematikan sel nontransgenik. Pada tingkat
konsentrasi ini, sel tanaman transgenik akan tetap hidup dan beregenerasi dengan
normal.
Untuk mengintroduksi DNA asing ke dalam sel tanaman, berbagai teknik dan
metode telah dilakukan orang, di antaranya adalah transformasi dengan bantuan
Agrobacterium, particle bombardment, memasukkan DNA secara langsung ke dalam
sel tanaman dengan sonikasi atau kejutan listrik, dan dengan cara mikroinjeksi DNA.
Walaupun demikian, hingga saat ini terdapat dua metode yang paling banyak
digunakan yaitu metode bombardment dan Agrobacterium.
Transformasi gen pada tanaman dengan bantuan Agrobacterium sendiri
merupakan salah satu metode yang dirasa cukup efektif dalam rekayasa genetika
tanaman, baik tanaman dikotil maupun monokotil (Cheng et al. 1996). Sistem
2
transformasi dengan bantuan Agrobacterium telah berkembang cukup baik umumnya
pada tanaman dikotil walaupun ada beberapa peneliti telah berhasil melakukan
transfer gen dengan bantuan Agrobacterium pada tanaman monokotil seperti padi
dan jagung (Hiei, Komari, dan Kubo 1997).
Beberapa faktor yang telah dilaporkan dapat mempengaruhi efisiensi
transformasi dengan bantuan Agrobacterium di antaranya adalah: (i) senyawa
inducer, seperti acetosyringone, hidroksi acetosyringone, thiamine, beberapa
monosakarida, alkysyringamides, dan NaCl (Shetty et al. 1997; Raghothama, et al.
1997; Lee, Marimoto, & William 1997); (ii) konsentrasi relatif bakteri, diukur
dengan spektrofotometer pada panjang gelombang λ = 600, yang sering disebut
OD600 (optical density yang diukur pada panjang gelombang λ = 600) (Rakousky, et
al. 1998); (iii) lamanya waktu inokulasi; (iv) lamanya waktu kokultivasi; (v) kondisi
prekultur eksplan yang akan ditransfer dengan Agrobacterium; (vi) perubahan pH
dan gula-gula dalam larutan seperti asam galakturonat, pektin dan sebagainya.
Dalam percobaan ini, berbagai faktor yang mempengaruhi keberhasilan
introduksi gen ke jaringan kacang tanah dengan bantuan Agrobacterium akan
dibakukan. Faktor yang akan diteliti meliputi: metode regenerasi tanaman transgenik
yang digunakan, konsentrasi bakteri yang optimum, lama waktu inokulasi, lama
waktu kokultivasi, lama waktu prekultur, dan jenis eksplan yang tepat untuk target
inokulasi.
Untuk mempercepat pembakuan metode tersebut, dalam percobaan ini akan
digunakan gen marker nptII dengan gen gus (pKIWI105; Gambar 1) dan
keberhasilan introduksi gennya akan dianalisis dengan menggunakan teknik
transsient assay. Pada beberapa percobaan juga dilakukan analisis integrative assay.
Gen marker tersebut digunakan mengingat ekspresi dari gen marker ini akan dengan
mudah
dideteksi.
Dengan
demikian,
keberhasilan
introduksi
gen
dengan
menggunakan suatu metode baku tertentu akan dapat dengan cepat diketahui.
pKIWI105
35S
Promoter
nptII
NOS
35S
Terminator
Promoter
gus/uidA
35S
Terminator
Gambar 1. Skema dari Plasmid pKIWI105 yang digunakan dalam percobaan
3
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Tanaman dan di
fasilitas kebun, jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian IPB. Penelitian mulai
dilakukan sejak bulan Januari 1997 sampai dengan bulan Desember 1999.
Metode penelitian yang dilakukan adalah: Preparasi eksplan, sterilisasi bici
kacang tanah, dan protokol induksi embrio somatik; Persiapan kultur bakteri;
Persiapan eksplan dan inokulasi standar; Percobaan pengaruh antibiotik kanamycin
terhadap efisiensi regenerasi tanaman; Percobaan untuk menentukan konsentrasi
bakteri yang optimum; Percobaan untuk menentukan lama waktu inokulasi yang
optimum; Percobaan untuk menentukan lama waktu kokultivasi yang optimum;
Percobaan untuk menentukan lama prekutur yang optimum; Percobaan untuk
menentukan jenis eksplan yang terbaik; dan Analisis embrio transgenik dengan PCR.
Preparasi eksplan, sterilisasi, dan protokol induksi embrio somatik.
Sebanyak tiga macam eksplan digunakan dalam penelitian ini yaitu leaflet, poros
embrio tanpa radikel, dan poros embrio tanpa radikel tanpa leaflet. Ketiga eksplan
diambil dari biji kacang tanah kultivar Gajah setelah disterilisasi.
Sebanyak 50-75 biji dalam wadah 1000 ml disterilkan dengan cara mencuci
biji-biji tersebut dengan 1000 ml larutan yang mengandung 1% (w/v) chlorine
(NaClO) dan 5-7 tetes Tween-20 selama 5-7 menit dikocok (100 rpm). Kemudian
dibilas sebanyak 4 kali dengan 1000 ml air steril. Bagian poros embrio dipisahkan
dan disterilisasi selama 5 menit dengan 1 % (w/v) larutan dichloroisocyanuric acid
(50 poros embrio/500 ml larutan) kemudian dibilas dengan air steril 3 kali.
Eksplan ditanam pada media MS16 [media dan vitamin MSO (Murashige and
Skoog), 2% (w/v) sukrosa, 0.8% (w/v) agar, dan 16 µM L-1 picloram (sigma)],
selanjutnya eksplan disubkultur pada media yang sama pada suhu 280C tanpa cahaya.
Subkultur dilakukan setiap 2 minggu sekali. Media MS16 ini digunakan sebagai
media dasar dalam setiap percobaan yang dilakukan.
Sesudah embrio terbentuk dan matang (mature), embrio siap untuk
dipindahkan ke media berikutnya. Tahap pertama adalah ke media MSC [media dan
vitamin MSO, 2 % (w/v) sukrosa, 0.8% (w/v) agar, dan 1 g L-1 Charcoal) selama
4
sebulan. Kemudian dipindah ke media MS10 [media dan vitamin MSO, 2% (w/v)
sukrosa, 0.8% (w/v) agar, dan 10 mg/L BAP) hingga terbentuk tanaman kacang
tanah (planlet setinggi 2-4 cm). Tahap selanjutnya tanaman dipindah ke media
perakaran MSOR [media dan vitamin MSO, 2 % (w/v) sukrosa, 0.8% (w/v) agar, dan
NAA 1 mg L-1].
Persiapan kultur bakteri. Agrobacterium dari stok glycerol atau stok LA
dicawankan dalam media LA yang mengandung antibiotik 100 mg/l spectinomicin
dan 20 mg L-1 rifampicin selama 2 hari pada suhu 280C. Sebanyak 5-7 koloni
tunggal yang terbentuk diinokulasikan ke media LB 30 ml (sebagai kultur awal) dan
ditumbuhkan selama 24 jam pada suhu 280C dengan dikocok pada kecepatan 100
rpm. Kemudian sebanyak 200 µl dari kultur awal tersebut diinokulasikan pada media
LB sebanyak 100 ml (sebagai kultur yang akan dipanen bakterinya) dan
ditumbuhkan selama 15-20 jam pada suhu 280C dengan dikocok pada kecepatan 100
rpm.
Panen bakteri dilakukan dengan cara mensentrifugasi suspensi bakteri yang
berasal dari kultur LB 100 ml pada 6000 rpm, selama 15 menit, dan suhu 40C.
Supernatan dibuang dan dikeringkan dengan kertas tissue selama 1 menit (harus
dijaga agar jangan sampai pelet keluar). Resuspensi pelet dilakukan dengan cara
menambahkan media regenerasi dari eksplan yang akan diinokulasi dengan
Agrobacterium. Sentrifugasi dan pengeringan dilakukan lagi seperti tahap
sebelumnya, kemudian resuspensi dilakukan kembali dengan media regenerasi
sebanyak 10 ml. Kultur diukur absorbannya dan ditera hingga mencapai nilai OD600
= 1 atau disesuaikan dengan perlakuan.
Persiapan eksplan dan inokulasi standar. Eksplan diiris dengan pisau
skalpel hingga berukuran 0.5 – 1 mm, kemudian diinokulasi dengan Agrobacterium
selama 10 menit (atau sesuai perlakuan). Periode kokultivasi dilakukan selama satu
hari (atau sesuai perlakuan). Eksplan kemudian dipindah ke media yang mengandung
antibiotik cefotaxim 300 mg L-1 selama lima hari. Setelah itu eksplan ditanam dalam
media seleksi (MS16 + cefotaxim 300 mg L-1 + kanamycin 100 mg L-1). Setiap 3
minggu sekali disubkultur hingga muncul tunas yang diduga transgenik.
Pengamatan integrative assay dilakukan pada 45 hari setelah inokulasi (HSI)
dan pengamatan transient assay dilakukan pada 7 HSI. Pengamatan dilakukan
5
terhadap jumlah eksplan yang ditanam, jumlah eksplan yang tertranformasi, dan
persentase sel/jaringan yang tertransformasi.
Percobaan pengaruh antibiotik kanamycin terhadap efisiensi regenerasi
tanaman. Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh antibiotik kanamycin
terhadap efisiensi regenerasi tanaman kacang tanah dalam media regenerasi.
Percobaan ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) faktorial yang dilakukan
dengan cara mengkombinasikan 2 faktor yaitu konsentrasi antibiotik kanamycin dan
konsentrasi picloram. Konsentrasi antibiotik yang digunakan terdiri atas taraf yaitu:
0, 50 100, 150, 200, dan 250 mg L-1, sedangkan konsentrasi picloram yang
digunakan 3 taraf yaitu 8, 12, dan 16 µM L-1. Eksplan yang digunakan adalah 100
pada masing-masing perlakuan. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah eksplan yang
mampu membentuk kalus embriogenik dan jumlah embrio pereksplan.
Percobaan untuk menentukan konsentrasi bakteri yang optimum.
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan konsentrasi bakteri yang optimum untuk
menghasilkan introduksi gen yang paling maksimal ke jaringan kacang tanah.
Konsentrasi optimum akan ditentukan berdasarkan ekspresi transien yang paling
tinggi pada jaringan yang diuji, kerusakan jaringan yang paling ringan, dan
keberhasilan dalam membebaskan jaringan dari kontaminasi Agrobacterium setelah
introduksi gen berhasil dilakukan.
Perlakuan konsentrasi bakteri yang diuji adalah suspensi bakteri dengan
konsentrasi OD600 = 0,25; 0,5; dan 1. Inokulasi dilakukan selama 15 menit. Eksplan
yang telah diinfeksi dikokultivasi di dalam media MS16 tanpa antibiotik selama satu
hari. Selanjutnya eksplan dipindahkan ke dalam media MS16 yang mengandung
antibiotik kanamycin (100 mg L-1) dan cefotaxime (300 mg L-1). Kanamycin
ditambahkan dalam media MS16 untuk menekan perkembangan sel/jaringan yang
tidak mengalami transformasi dan menumbuhkan jaringan yang membawa gen nptII
(gen ketahanan terhadap kanamycin), sedangkan cefotaxime ditambahkan untuk
membunuh kontaminan Agrobacterium yang sudah tidak diinginkan setelah proses
introduksi gen oleh bakterinya telah terjadi selama proses kokultivasi.
Jaringan
eksplan tersebut ditanam dalam media MS16 dengan antibiotik selama 1 minggu lalu
dianalisis dengan menggunakan transient assay untuk ekspresi gen gus.
6
Percobaan untuk menentukan lama waktu inokulasi yang optimum.
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan lama waktu inokulasi bakteri maksimal
ke jaringan kacang tanah. Eksplan diinokulasi dengan bakteri yang disiapkan dengan
cara merendam ke dalam larutan bakteri dengan konsentrasi OD600 = 0,5 selama 5,
15, dan 30 menit. Selanjutnya eksplan ditiriskan di atas kertas tissue steril untuk
membersihkan dari larutan bakteri berlebihan. Eksplan yang telah diinfeksi lalu
dikokultivasi di dalam media regenerasi embrio kacang tanah (media MS16) tanpa
antibiotik selama 24 jam. Inokulasi dan kokultivasi dilakukan untuk memberi
kesempatan bagi Agrobacterium untuk mentransfer gen nptII/gus ke jaringan kacang
tanah.
Analisis keberhasilan intoduksi gen gus dilakukan dengan melihat terjadinya
ekspresi gen ini secara transien. Analisis ekspresi gen gus dilakukan sebagaimana
telah dijelaskan sebelumnya. Selanjutnya banyaknya spot warna biru yang terbentuk
akan dihitung dan dipakai untuk menentukan waktu inokulasi yang paling optimum.
Percobaan untuk menentukan lama waktu kokultivasi yang optimum.
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan waktu kokultivasi bakteri yang optimum
untuk menghasilkan introduksi gen yang paling maksimal ke jaringan kacang tanah.
Kultur Agrobacterium yang akan dipakai disiapkan sebagaimana dalam percobaan
sebelumnya. Konsentrasi bakteri yang dipakai OD600 = 0,5. Eksplan kacang tanah
yang digunakan disiapkan pada percobaan sebelumnya.
Eksplan diinokulasi dengan bakteri dengan cara merendam ke dalam larutan
bakteri yang konsentrasinya telah ditentukan sebelumnya, selama 15 menit.
Selanjutnya eksplan ditiriskan di atas kertas tissue steril untuk membersihkan dari
larutan bakteri berlebihan. Eksplan yang telah diinfeksi selanjutnya dikokultivasi di
dalam media regenerasi embrio kacang tanah (media MS16) tanpa antibiotik selama
12, 24, dan 48 jam. Eksplan kacang tanah yang digunakan berupa poros embrio atau
leaflet yang diisolasi dari biji kacang tanah tua yang telah disterilkan dan embrio
(masih terdapat bagian kalus embriogeniknya).
Setelah kokultivasi, selanjutnya eksplan dipindahkan ke dalam media MS16
yang mengandung antibiotik kanamycin (100 mg L-1) dan cefotaxime (300 mg L-1)
dan eksplan ditumbuhkan sebagaimana dalam percobaan sebelumnya. Jaringan
7
eksplan tersebut ditanam daam media MS16 dengan antibiotik selama satu minggu
sebelum dianalisis dengan menggunakan transient assay untuk ekspresi gen gus.
Percobaan untuk menentukan lama prekutur yang optimum. Percobaan
ini bertujuan untuk menentukan waktu prekultur yaitu waktu di antara isolasi eksplan
dan perlakuan inokulasi, yang optimum untuk mendapatkan frekuensi produksi gen
yang paling maksimum. Perlakuan prekultur akan membuat eksplan menjadi tidak
mudah mati akibat infeksi Agrobacterium yang dilakukan dan eksplan dalam kondisi
sedang tumbuh ke arah kalus embriogenik yang kemungkinan besar akan lebih
bersifat kompeten (lebih mudah diintroduksi). Dengan demikian transfer gen ke
jaringan eksplan diharapkan akan lebih baik.
Eksplan ditanam terlebih dahulu dalam media MS16 selama 0, 6, 12, dan 49
hari sebelum perlakuan inokulasi dan kokultivasi bakteri dilakukan. Selanjutnya
eksplan yang telah mengalami periode prekultur diinokulasi dan dikokultivasi
dengan Agrobacterium dan keberhasilan introduksi gen marker dianalisis seperti
pada percobaan sebelumnya.
Percobaan untuk menentukan jenis eksplan yang terbaik. Percobaan ini
bertujuan untuk menentukan jenis eksplan yang terbaik untuk mendapatkan frekuensi
introduksi gen yang paling maksimum. Eksplan yang berbeda mempunyai tingkat
keberhasilan transfer gen yang berbeda pula.
Kultur Agrobacterium yang akan dipakai disiapkan sebagaimana dalam
percobaan sebelumnya. Konsentrasi bakteri yang dipakai OD600 = 0,5. Eksplan
kacang tanah yang digunakan disiapkan sebagaimana pada percobaan sebelumnya.
Eksplan kacang tanah yang digunakan berupa poros embrio atau leaflet yang
diisolasi dari biji kacang tanah tua yang telah disterilkan dan embrio (masih terdapat
bagian kalus embriogeniknya).
Eksplan yang telah diinokulasi dengan bakteri disiapkan dengan cara
merendam ke dalam larutan bakteri yang konsentrasinya telah ditentukan
sebelumnya yaitu selama 15 menit. Selanjutnya eksplan ditiriskan di atas kertas
tissue steril untuk membersihkan dari larutan bakteri berlebihan. Eksplan yang telah
diinfeksi selanjutnya dikokultivasi di dalam media regenerasi embrio kacang tanah
(media MS16) tanpa antibiotik selama 24 jam.
8
Analisis embrio transgenik dengan PCR.
Embrio yang muncul dan
mampu hidup dalam media seleksi selama sebelas minggu setelah inokulasi dengan
Agrobacterium kemudian dideteksi gen gusnya dengan PCR seperti yang dilakukan
oleh Thomson & Dietzgen (1995). Primer yang digunakan mempunyai sekuen
sebagai berikut.
: 5’-CGA TAC CTC TCT TTA GGC ATT GG-3’
: 5’-CAG CTG TCA TTG TTT GCC TCC CTG CTG CGG-3’
GUS1
CH4
Produk yang diberikan oleh primer GUS1 dan CH4 berukuran 600 bp.
Kondisi amplifikasi yang digunakan adalah 940C selama 3 menit, 35 siklus dari 940C
selama 45 detik, 550C selama 45 detik dan 720C selama 90 detik, kemudian
dilanjutkan pada 720C selama 10 menit. Kondisi terakhir reaksi berada pada suhu
40C sampai dirunning pada gel electroforesis.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Percobaan pengaruh antibiotik kanamycin terhadap efisiensi regenerasi
tanaman.
Pengaruh
konsentrasi
antibiotik
kanamycin
terhadap
kemampuan
eksplan
membentuk kalus dan pembentukan embrio disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Pengaruh Konsentrasi Antibiotik Kanamycin terhadap Pembentukan
Kalus dan Embrio dari Eksplan Leaflet Kacang Tanah Pada 4 MST
[Kan] (mg/l)
[Picloram] (µM/l)
8
12
16
0
Jumlah
K
E
50
Jumlah
K
E
100
Jumlah
K
E
150
Jumlah
K
E
200
Jumlah
K
E
250
Jumlah
K
E
93
44
21
77
78
89
1
1
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
17
9
10
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Catatan: MST = Minggu Setelah Tanam; K = Kalus; E = Embrio; Jumlah eksplan =
100/perlakuan
Seperti yang telah dikemukakan di atas bahwa percobaan ini bertujuan untuk
mengetahui pengaruh antibiotik kanamycin terhadap efisiensi regenerasi tanaman
kacang tanah dalam media regenerasi. Dari Tabel 1 terlihat bahwa kalus masih dapat
9
terbentuk sekitar 70-80% tetapi embrio sudah tidak dapat terbentuk pada konsentrasi
kanamycin 50 mg L-1 hingga pengamatan pada 4 MST, padahal tanpa antibiotik
embrio sudah mulai terbentuk pada 2 MST.
Pada konsentrasi 100 mg L-1
Kanamycin, terdapat kalus hanya sekitar 1-3% dan embrio tidak terbentuk sama
sekali. Kalus yang terbentuk terlihat berwarna kecoklatan hingga hitam, yang
menunjukkan bahwa kalus tersebut menuju proses kematian.
Melihat kondisi demikian, konsentrasi 100 mg L-1 ini dipilih untuk percobaan
selanjutnya sebab konsentrasi itu dapat menghambat regenerasi tanaman atau
mematikan jaringan ekspan. Antibiotik dengan konsentrasi 100 mg L-1 ini akan
digunakan untuk menyeleksi tanaman transgenik (yang tersisipi gen ketahanan
terhadap antibiotik). Sel-sel/jaringan tanaman yang mempunyai gen ketahanan
terhadap antibiotik kanamycin akan terus tumbuh beregenerasi menjadi tanaman.
Namun, sel/jaringan tanaman yang tidak tersisipi gen ketahanan tersebut akan mati
atau terhambat pertumbuhannya dan tidak bisa berkembang lebih lanjut.
Percobaan untuk menentukan konsentrasi bakteri yang optimum.
Respon eksplan leaflet, embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet dan
embrio/kalus embriogenik terhadap berbagai perlakuan populasi bakteri yang dipakai
untuk menginokulasi ekspan disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Respon Eksplan Leaflet, Embrio Axis Tanpa Radikel Tanpa Leaflet, dan
Embrio terhadap Berbagai Perlakuan Populasi Bakteri yang Dipakai untuk
Menginokulasi Eksplan. Inokulasi Bakteri Dilakukan Selama 15 Menit
Dalam Suspensi Bakteri OD600=0.5
Tipe eksplan
Leaflet
EA-RL
E
Populasi
bakteri
(OD600)
0.25
0.5
1
0.25
0.5
1
0.25
0.5
1
Jumlah
eksplan yang
ditanam
500
500
500
100
100
100
200
200
200
Jumlah
eksplan yang
diuji
200
200
200
35
35
35
100
100
100
Eksplan yang
GUS [+]
Jumlah spot
per eksplan
0
0
0
0
0
0
0
2
3
0
0
0
0
0
0
0
1
1
Catatan: Pengamatan dilakukan hingga 45 HSI. Data rata-rata dari tiga kali
percobaan EA-RL=embrio tanpa bakal akar dan bakal daun. EA-R=embrio tanpa
bakal akar.
10
Dari tabel itu terlihat bahwa eksplan positif berwarna biru yang tahan
kanamycin hingga 45 HSI diperoleh jika kita menggunakan bakteri dengan
konsentrasi OD600=0,5 dan 1. Namun, pada konsentrasi OD600 =1 bakteri sangat sulit
dimatikan.
Dalam beberapa percobaan bahkan tidak dapat dimatikan. Dengan
demikian OD600=0,5 lebih baik untuk dipilih. Dari tabel tersebut juga dapat diambil
kesimpulan bahwa eksplan terbaik yang dapat menghasilkan eksplan positif
berwarna biru tahan kanamycin adalah eksplan embrio atau kalus embriogenik. Jadi
dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa sebaiknya digunakan konsentrasi bakteri
OD600=0,5 dan eksplan embrio/kalus embriogenik.
Percobaan untuk menentukan lama inokulasi yang optimum.
Respon eksplan leaflet, embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet, dan
embrio/kalus embriogenik terhadap lama waktu inokulasi yang digunakan seperti
disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3. Respon Eksplan Leaflet, Embrio Axis Tanpa Radikel Tanpa Leaflet, dan
Embrio terhadap Berbagai Perlakuan Lama Inokulasi yang Dipakai untuk
Menginokulasi Eksplan.
Tipe
Lama
Jumlah
Jumlah
Eksplan
Jumlah spot
eksplan
inokulasi
eksplan
eksplan
yang GUS per eksplan
(menit)
yang
yang diesei
[+]
ditanam
Leaflet
5
250
100
0
0
15
250
100
1
1
30
250
100
2
2
EA-RL
5
100
40
0
0
15
100
40
0
0
30
100
40
0
0
E
5
200
100
0
0
15
200
100
3
3
30
200
100
0
0
Catatan: Pengamatan dilakukan hingga 45 HSI. Data rata-rata dari tiga kali
percobaan EA-RL=embrio tanpa bakal akar dan bakal daun. E =embrio/kalus
embriogenik.
Dari Tabel 3. terlihat bahwa eksplan positif berwarna biru yang tahan
kanamycin hingga 45 HSI diperoleh jika digunakan lama waktu inokuasi 15 dan 30
11
menit pada eksplan leaflet dan lama waktu inoulasi 15 menit pada eksplan
embrio/kalus embriogenik. Pada lama waktu inokulasi 30 menit bakteri sangat sulit
dimatikan, bahkan dalam beberapa percobaan tidak dapat dimatikan. Dengan
demikian lama waktu inokulasi 15 menit lebih baik untuk dipilih. Dari tabel tersebut
juga dapat diambil kesimpulan bahwa eksplan terbaik yang dapat menghasikan
embrio tahan kanamycin adalah eksplan embrio atau kalus embriogenik. Jadi dari
percobaan ini dapat kita simpulkan bahwa sebaiknya digunakan lama waktu
inokulasi 15 menit dan eksplan embrio/kalus embriogenik.
Percobaan untuk menentukan lama waktu kokultivasi yang optimum.
Respon eksplan leaflet, embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet, dan embrio/kalus
embriogenik terhadap lama waktu kokultivasi yang digunakan seperti disajikan pada
Tabel 4.
Tabel 4. Respon eksplan leaflet, embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet, dan embrio
terhadap berbagai perlakuan lama waktu kokultivasi.
Tipe
eksplan
Lama
Jumlah
Jumlah
Eksplan
Jumlah spot
kokultivasi
eksplan
diesei
yang GUS
per eksplan
(hari)
[+]
Leaflet
1
1000
100
0
0
2
1000
100
0
0
EA-RL
1
200
40
0
0
2
200
40
0
0
E
1
250
100
2
1
2
250
100
3
1
Catatan: Pengamatan dilakukan hingga 45 HSI. Data rata-rata dari tiga kali
percobaan EA-RL=embrio tanpa bakal akar dan bakal daun. E =embrio/kalus
embriogenik.
Dari Tabel 4 terlihat bahwa eksplan positif berwarna biru yang tahan
kanamycin hingga 45 HSI diperoleh jika kita menggunakan lama waktu kokultivasi 1
dan 2 hari pada eksplan embrio/kalus embriogenik. Pada lama waktu kokultivasi 2
hari, bakteri sangat sulit dimatikan, bahkan dalam beberapa percobaan tidak dapat
dimatikan. Dengan demikian lama waktu inokulasi 1 hari lebih baik untuk dipilih.
Dari tabel tersebut juga dapat diambil kesimpulan bahwa eksplan terbaik yang dapat
menghasilkan embrio tahan kanamycin adalah eksplan embrio atau kalus
12
embriogenik. Jadi, dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa sebaiknya digunakan
lama waktu kokultivasi 1 hari dan eksplan embrio/kalus embriogenik.
Percobaan untuk menentukan lama pre kultur yang optimum.
Respon eksplan leaflet dan embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet terhadap
lama waktu prekultur yang digunakan seperti disajikan pada Tabel 5.
Tabel 5. Respon eksplan leaflet dan embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet terhadap
berbagai perlakuan lama prekultur.
Tipe
eksplan
Lama
prekultur
(hari)
Jumlah
Jumlah
Eksplan
Jumlah spot
eksplan
eksplan
yang GUS per eksplan
yang
yang diesei
[+]
ditanam
EA-R
49
750
35
7
7
Leaflet
0
400
50
0
0
6
600
50
0
0
12
400
50
0
0
49
550
50
7
7
EA-RL
0
300
35
0
0
6
300
35
0
0
12
300
35
0
0
49
605
35
7
7
Catatan: Pengamatan dilakukan hingga 45 HSI. Data rata-rata dari tiga kali
percobaan EA-RL=embrio tanpa bakal akar dan bakal daun. EA-R=embrio tanpa
bakal akar.
Dari Tabel 5 terlihat bahwa eksplan positif berwarna biru yang tahan
kanamycin hingga 45 HSI diperoleh jika kita menggunakan eksplan leaflet dan
eksplan embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet yang telah diprekultur selama 49 hari.
Dengan demikian eksplan leaflet dan eksplan embrio axis tanpa radiel tanpa leaflet
yang telah diprekultur selama 49 HST, keduanya baik untuk dipilih. Sebagai catatan
eksplan leaflet maupun eksplan embrio axis tanpa radiel tanpa leaflet yang telah
diprekultur selama 49 HST telah menjadi eksplan embrio/kalus embriogenik.
Jadi, percobaan ini memperkuat kesimpulan percobaan sebelumnya bahwa
untuk dapat ditransfer eksplan butuh diprekultur lebih dahulu sehingga membentuk
embrio atau kalus embriogenik. Hal ini kemungkinan besar disebabkan pada kacang
tanah kondisi sel yang telah mengalami prekultur menjadi lebih kompeten
13
dibandingkan dengan sel yang belum diprekultur. Di samping itu Agrobacterium
akan lebih mudah mentransfer gen pada sel yang sedang aktif membelah.
Percobaan untuk menentukan jenis eksplan yang terbaik.
Respon
eksplan leaflet, embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet dan embrio/kalus embriogenik
setelah inokulasi Agrobacterium seperti disajikan pada Tabel 6.
Dari tabel itu terlihat bahwa eksplan positif berwarna biru diperoleh jika kita
menggunakan eksplan leaflet dan ekspan embrio/kalus embriogenik. Jika
pengamatan diteruskan hingga 40 hari setelah inokulasi (Tabel 7) ternyata se-sel
positif berwarna biru pada eksplan leaflet tidak dapat berkembang dan akhirnya mati.
Dengan demikian eksplan leaflet tidak disarankan untuk dipilih, sedangkan eksplan
embrio/kalus embriogenik terbaik untuk dipilih.
A
B
Gambar 2. Embrio Positif GUS. A. Transient Assay B. Integrative Assay
Tabel 6. Respon Eksplan Leaflet, Embrio Axis Tanpa Radikel Tanpa Leaflet, dan
Embrio (Transient Assay) Setelah Introduksi Gen Gus.
Tipe eksplan
Jumlah
Jumlah
Eksplan
Jumlah spot
eksplan total eksplan yang yang GUS
per eksplan
diesei
[+]
Leaflet
2000
200
13
20
EA-RL
400
40
0
0
E
400
200
30
35
Catatan: esei dilakukan pada 7 hari setelah inokulasi; EA-RL=embrio tanpa bakal
akar dan bakal daun; E =embrio/kalus embriogenik.
14
Respon eksplan leaflet, embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet, dan
embrio/kalus embriogenik setelah inokulasi dengan Agrobacterium disajikan pada
Tabel 7. Dari Tabel 7. tersebut terlihat bahwa eksplan positif berwarna biru yang
tahan kanamycin hingga 45 HSI diperoleh jika kita menggunakan eksplan
embrio/kalus embriogenik (Gambar 2).
Dengan demikian eksplan embrio/kalus
embriogenik terbaik untuk dipilih.
Tabel 7. Respon eksplan leaflet, embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet, dan embrio
(Integrative assay) setelah Introdusi gen gus.
Tipe eksplan
Jumlah
Jumlah
Eksplan
Jumlah spot
eksplan total eksplan yang yang GUS
per eksplan
diesei
[+]
Leaflet
2000
200
0
0
EA-RL
400
40
0
0
E
400
200
2
2
Catatan: esei dilakukan pada 45 HSI; EA-RL=embrio tanpa bakal akar dan bakal
daun; E =embrio/kalus embriogenik.
Pengujian dengan teknik PCR. Untuk membuktikan apakah embrio
tersebut benar-benar mengandung gen gus perlu diuji. Uji yang paling ideal dengan
menggunakan teknik southern blot, tetapi teknik sothern blot tidak dapat kita
terapkan untuk embrio sebab teknik ini memerlukan ekstrak DNA yang cukup
banyak yang tidak dapat kita peroleh dari embrio yang berukuran sangat kecil. Salah
satu alternatif pengujian adalah dengan PCR yang tidak memerlukan DNA banyak.
Pengujian DNA embrio yang berasal dari Agrobacterium sangat dikuatirkan
terdapat kontaminasi DNA dari Agrobacterium. Untuk menghindari kemungkinan
kontaminasi ini, bagian embrio yang di PCR adalah bagian ujung (diusahakan sejauh
mungkin dari bagian yang berkalus).
Untuk menguji apakah pada embrio masih terdapat Agrobacterium hidup
sebelum uji PCR hádala sebagai berikut. Setengah dari embrio yang diduga resisten
higromicin direndam lebih dahulu pada media bakteri selama 24 jam, kemudian
media bakteri tersebut disebarkan di atas media padat bakteriologis (LA; untuk
melihat apakah masih terdapat kontaminasi bakteri pada eksplan). Ternyata tidak ada
satupun bakteri yang tumbuh hingga 7 hari pengamatan, sedangkan media padat
yang diberi bakteri hidup dari kultur cair, bakteri dapat tumbuh dengan baik. Dengan
15
demikian
embrio
yang
diperoleh
dapat
diyakinkan
15
20
tidak
terkontaminasi
Agrobacterium.
5
10
600 bp
Gambar 3. PCR DNA total dari setengah embrio pada percobaan III dengan
menggunakan primer GUS1 & CH4. Lajur 1 kosong, Lajur 25 marker 1
kb ladder; ajur 2, kontrol tanpa template (akuades); Lajur 3-9, 7 DNA
total dari setengah embrio yang berasal dari EA-R; Lajur 10-16, 7 DNA
total dari setengah embrio yang berasal dari leaflet; Lajur 17-23, 7 DNA
total dari setengah embrio yang berasal dari EA-RL; Lajur 4-8, 10-12
17 19, 20 adalah embrio yang positif mengandung gen gus, memberikan
produk fragmen sepanjang 600 bp. Lajur 3, 9, 13-16, 18, dan 21-23
adalah embrio yang negatif mengandung gen gus; Lajur 24 adalah
pTOK233 DNA murni hasil maxiprep.
Hasil PCR terhadap setengah embrio menggunakan primer GUS1 & CH4
disajikan pada Gambar 3. Lajur 1 dan 25 adalah 1 kb ladder (marker). Kontrol
negatif dalam percobaan ini menggunakan air steril (Lajur 2) memang tidak muncul
potongan DNA. Hal ini membuktikan bahwa air steril yang kita gunakan tidak
terkontaminasi.
Dari Gambar 3. dapat kita ketahui keberhasilan integrasi gen gus setelah
analisis dengan PCR sebagai berikut. Sebanyak 7 embrio, yang berasal dari eksplan
EA-R berada pada lajur 3-9. Dari sejumlah 7 embrio 2 embrio (28.5%) yang tidak
menghasilkan produk DNA sebesar 600 bp/tidak mengandung gen gus (lajur 3 dan
9), sebanyak 7 embrio yang berasal dari eksplan leaflet berada pada lajur 10-16, dari
jumlah 7 embrio hanya terdapat 4 embrio (57%) yang tidak menghasilkan produk
DNA sebesar 600 bp/tidak mengandung gen gus (lajur 13-16). Sebanyak 7 embrio
yang berasal dari eksplan EA-R berada pada lajur 17-23. Dari sejumlah 7 embrio
16
terdapat 4 (57%) embrio yang tidak menghasilkan produk DNA sebesar 600 bp/tidak
mengandung gen gus (lajur 18 dan 21-23).
KESIMPULAN
Dari beberapa seri percobaan di atas dapat diambil kesimpuan bahwa hasil
terbaik integrasi gen gus pada kacang tanah dalam penelitian ini diperoleh jika kalus
embriogenik umur 49 HST digunakan sebagai eksplan dengan lama waktu inokulasi
15 menit, lama waktu kokultivasi 24 jam, dan konsentrasi bakteri OD600 = 0,5.
Konsentrasi kanamycin terendah yang sangat menghambat regenerasi tanaman
kacang tanah adalah 100 mg L-1.
UCAPAN TERIMAKASIH
Terimakasih kepada pembimbing: Prof Dr Surkati Abidin, Prof Dr Rusmilah Suseno,
Dr. Sudarsono, Dr. Hajrial Aswidinnoor, dan Dr. Satriyas Ilyas. Juga terimakasih
kepada lembaga pemberi dana untuk penelitian ini: RUT VII: Pengembangan
kacang tanah transgenik tahan PStV, DRN, KMNRT (cq. Dr. Sudarsono). Kepada
Dra. Erna Rochiyati, MSi. juga diucapkan terimakasih atas perannya sebagai
penyelaras bahasa.
DAFTAR PUSTAKA
Cheng, M., Jarret R.L., Li, Z., Xing. A. And Demsi, J.W. 1996. Production of fertile
transgenic peanut (Arachis hypogaea L.) plant using Agrobacterium
tumefaciens. Plant Cell Rep. 16:653-657.
Hiei, Y., T. Komari, and T. Kubo. 1997. Transformation of rice mediated by
Agrobacterium tumefaciens. Plan Mol. Biol. 35:205-218.
Lee, S., H. Marimoto, and P.G. Wiliams. 1997. Synthesis of high specific
radioactivity 35-(3H-6) dimethoxy-4-hydroxyacetophenone, an inducing
compound of the vir gene in Agrobacterium tumefaciens. Journal of Labelled
Compound and Radiopharmaceutica. 39(6):461-470.
Rakousky, S., T. Kocabek, R. Vincenciova, and M. Ondrej. 1998. Transient Bglucuronidase activity after infiltration of Arabidopsis thaliana by
Agrobacterium tumefaciens. Biologia Plantarum 40(1):33-41.
Ranghotama, K.G., A. Maggio, M. L. Narasimhan, A.K. Kononowics, G. Wang, M.
Paino-D’urzo, P.M. Hasegawa, and R.A. Bressan. 1997. Tissue-specific
activation of the osmotin gene by ABA, C-2H-4 and NaCl involves the
same promoter region. Plant Mol. Biol. 34(3):393-402.
17
Shetty, K., M. Ohshima, T. Murakami, K. Oosawa, and Y. Ohashi. 1997. Transgenic
melon (Cucumis meo L.) and potential for expression of novel proteins
important to food industry. Food Biotechnoogy. 11(2):111-128.
Thomson, D. and R.G. Dietzgen. 1995. Detection of DNA and RNA plant viruses by
PCR and RT-PCR using a rapid virus release protocol without tissue
homogenization. J. Virological Methods 54:85-95.
18
TANAMAN KACANG TANAH DENGAN BANTUAN
AGROBACTERIUM
Sholeh Avivi1), Sudarsono2), Satriyas Ilyas2), dan Hajrial Aswidinnoor2)
ABSTRACT
The aims of this research were: (1) to investigate the minimum concentration of
kanamycin antibiotic that could stop regeneration of peanut normal cell; (2) to know
the effect of the most effective bacteria population, the best time periode of
inoculation, the best time time periode of cocultivation, the explant type, and the best
time periode of preculture to optimize the Agrobacterium mediated transformation
on peanut.
We used pKIWI105 (gus and nptII gene inside) to achieve those
objectives. To know that the gene have been integrated inside the peanut explant we
used transient assay and integrative assay. From this study we concluded that the
best result of transformation system could obtain if we used 49 dap (days after
planting) embryonic callus as explants, 15 minute inoculation, 24 hours
cocultivation, and the bacteria concentration was OD600 = 0.5. The lowest
kanamycin concentration that could stop cell regeneration was 100 mg L-1.
Key words: Agrobacterium, gus, nptII, peanut
1) Staf Pengajar Jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian Universitas
Jember, Jl. Kalimantan, Jember 68121, e-mail: avi_vi@yahoo.com
2) Staf Pengajar Jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian Institut
Pertanian Bogor
1
ABSTRAK
Tujuan penelitian ini adalah untuk: (i) menemukan konsentrasi minimal
antibiotik kanamycin yang dapat menghentikan pertumbuhan sel kacang tanah
normal; (ii) untuk mengetahui pengaruh tingkat populasi bakteri, lama waktu
inokulasi, lama waktu kokultivasi, tipe eksplan, dan lama waktu prekultur untuk
mengoptimalkan transformasi gen dengan bantuan Agrobacterium pada kacang
tanah. Gen gus yang berada dalam plasmid pKIWI105 bersama-sama dengan gen
resistensi terhadap antibiotik kanamycin digunakan untuk mencapai tujuan tersebut.
Keberhasilan introduksi gen dianalisis pada saat dua hari sesudah inokulasi (transient
assay) dan pada beberapa percobaan dilakukan pula integrative assay. Hasil terbaik
integrasi gen gus pada kacang tanah dalam penelitian ini diperoleh jika digunakan
kalus embriogenik umur 49 HST sebagai eksplan dengan lama waktu inokulasi 15
menit, lama waktu kokultivasi 24 jam, dan konsentrasi bakteri OD600 = 0,5.
Konsentrasi kanamycin terendah yang sangat menghambat regenerasi sel
nontransgenik tanaman kacang tanah adalah 100 mg L-1.
Kata kunci: Agrobacterium, gus, nptII, kacang tanah
PENDAHULUAN
Setelah sistem regenerasi tanaman yang efektif secara in vitro ditemukan
maka tahap berikutnya yang harus dilakukan untuk dapat memperoleh tanaman
transgenik adalah introduksi DNA asing ke sel tanaman. Setelah gen dapat
terintroduksi ke dalam sel tanaman, sel tersebut perlu ditumbuhkan dalam media
seleksi yang mengandung antibiotik. Konsentrasi yang tepat dari antibiotik
penyeleksi ini perlu diketahui. Pada umumnya konsentrasi yang digunakan adalah
konsentrasi paling rendah yang dapat mematikan sel nontransgenik. Pada tingkat
konsentrasi ini, sel tanaman transgenik akan tetap hidup dan beregenerasi dengan
normal.
Untuk mengintroduksi DNA asing ke dalam sel tanaman, berbagai teknik dan
metode telah dilakukan orang, di antaranya adalah transformasi dengan bantuan
Agrobacterium, particle bombardment, memasukkan DNA secara langsung ke dalam
sel tanaman dengan sonikasi atau kejutan listrik, dan dengan cara mikroinjeksi DNA.
Walaupun demikian, hingga saat ini terdapat dua metode yang paling banyak
digunakan yaitu metode bombardment dan Agrobacterium.
Transformasi gen pada tanaman dengan bantuan Agrobacterium sendiri
merupakan salah satu metode yang dirasa cukup efektif dalam rekayasa genetika
tanaman, baik tanaman dikotil maupun monokotil (Cheng et al. 1996). Sistem
2
transformasi dengan bantuan Agrobacterium telah berkembang cukup baik umumnya
pada tanaman dikotil walaupun ada beberapa peneliti telah berhasil melakukan
transfer gen dengan bantuan Agrobacterium pada tanaman monokotil seperti padi
dan jagung (Hiei, Komari, dan Kubo 1997).
Beberapa faktor yang telah dilaporkan dapat mempengaruhi efisiensi
transformasi dengan bantuan Agrobacterium di antaranya adalah: (i) senyawa
inducer, seperti acetosyringone, hidroksi acetosyringone, thiamine, beberapa
monosakarida, alkysyringamides, dan NaCl (Shetty et al. 1997; Raghothama, et al.
1997; Lee, Marimoto, & William 1997); (ii) konsentrasi relatif bakteri, diukur
dengan spektrofotometer pada panjang gelombang λ = 600, yang sering disebut
OD600 (optical density yang diukur pada panjang gelombang λ = 600) (Rakousky, et
al. 1998); (iii) lamanya waktu inokulasi; (iv) lamanya waktu kokultivasi; (v) kondisi
prekultur eksplan yang akan ditransfer dengan Agrobacterium; (vi) perubahan pH
dan gula-gula dalam larutan seperti asam galakturonat, pektin dan sebagainya.
Dalam percobaan ini, berbagai faktor yang mempengaruhi keberhasilan
introduksi gen ke jaringan kacang tanah dengan bantuan Agrobacterium akan
dibakukan. Faktor yang akan diteliti meliputi: metode regenerasi tanaman transgenik
yang digunakan, konsentrasi bakteri yang optimum, lama waktu inokulasi, lama
waktu kokultivasi, lama waktu prekultur, dan jenis eksplan yang tepat untuk target
inokulasi.
Untuk mempercepat pembakuan metode tersebut, dalam percobaan ini akan
digunakan gen marker nptII dengan gen gus (pKIWI105; Gambar 1) dan
keberhasilan introduksi gennya akan dianalisis dengan menggunakan teknik
transsient assay. Pada beberapa percobaan juga dilakukan analisis integrative assay.
Gen marker tersebut digunakan mengingat ekspresi dari gen marker ini akan dengan
mudah
dideteksi.
Dengan
demikian,
keberhasilan
introduksi
gen
dengan
menggunakan suatu metode baku tertentu akan dapat dengan cepat diketahui.
pKIWI105
35S
Promoter
nptII
NOS
35S
Terminator
Promoter
gus/uidA
35S
Terminator
Gambar 1. Skema dari Plasmid pKIWI105 yang digunakan dalam percobaan
3
BAHAN DAN METODE
Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Biologi Molekuler Tanaman dan di
fasilitas kebun, jurusan Budidaya Pertanian, Fakultas Pertanian IPB. Penelitian mulai
dilakukan sejak bulan Januari 1997 sampai dengan bulan Desember 1999.
Metode penelitian yang dilakukan adalah: Preparasi eksplan, sterilisasi bici
kacang tanah, dan protokol induksi embrio somatik; Persiapan kultur bakteri;
Persiapan eksplan dan inokulasi standar; Percobaan pengaruh antibiotik kanamycin
terhadap efisiensi regenerasi tanaman; Percobaan untuk menentukan konsentrasi
bakteri yang optimum; Percobaan untuk menentukan lama waktu inokulasi yang
optimum; Percobaan untuk menentukan lama waktu kokultivasi yang optimum;
Percobaan untuk menentukan lama prekutur yang optimum; Percobaan untuk
menentukan jenis eksplan yang terbaik; dan Analisis embrio transgenik dengan PCR.
Preparasi eksplan, sterilisasi, dan protokol induksi embrio somatik.
Sebanyak tiga macam eksplan digunakan dalam penelitian ini yaitu leaflet, poros
embrio tanpa radikel, dan poros embrio tanpa radikel tanpa leaflet. Ketiga eksplan
diambil dari biji kacang tanah kultivar Gajah setelah disterilisasi.
Sebanyak 50-75 biji dalam wadah 1000 ml disterilkan dengan cara mencuci
biji-biji tersebut dengan 1000 ml larutan yang mengandung 1% (w/v) chlorine
(NaClO) dan 5-7 tetes Tween-20 selama 5-7 menit dikocok (100 rpm). Kemudian
dibilas sebanyak 4 kali dengan 1000 ml air steril. Bagian poros embrio dipisahkan
dan disterilisasi selama 5 menit dengan 1 % (w/v) larutan dichloroisocyanuric acid
(50 poros embrio/500 ml larutan) kemudian dibilas dengan air steril 3 kali.
Eksplan ditanam pada media MS16 [media dan vitamin MSO (Murashige and
Skoog), 2% (w/v) sukrosa, 0.8% (w/v) agar, dan 16 µM L-1 picloram (sigma)],
selanjutnya eksplan disubkultur pada media yang sama pada suhu 280C tanpa cahaya.
Subkultur dilakukan setiap 2 minggu sekali. Media MS16 ini digunakan sebagai
media dasar dalam setiap percobaan yang dilakukan.
Sesudah embrio terbentuk dan matang (mature), embrio siap untuk
dipindahkan ke media berikutnya. Tahap pertama adalah ke media MSC [media dan
vitamin MSO, 2 % (w/v) sukrosa, 0.8% (w/v) agar, dan 1 g L-1 Charcoal) selama
4
sebulan. Kemudian dipindah ke media MS10 [media dan vitamin MSO, 2% (w/v)
sukrosa, 0.8% (w/v) agar, dan 10 mg/L BAP) hingga terbentuk tanaman kacang
tanah (planlet setinggi 2-4 cm). Tahap selanjutnya tanaman dipindah ke media
perakaran MSOR [media dan vitamin MSO, 2 % (w/v) sukrosa, 0.8% (w/v) agar, dan
NAA 1 mg L-1].
Persiapan kultur bakteri. Agrobacterium dari stok glycerol atau stok LA
dicawankan dalam media LA yang mengandung antibiotik 100 mg/l spectinomicin
dan 20 mg L-1 rifampicin selama 2 hari pada suhu 280C. Sebanyak 5-7 koloni
tunggal yang terbentuk diinokulasikan ke media LB 30 ml (sebagai kultur awal) dan
ditumbuhkan selama 24 jam pada suhu 280C dengan dikocok pada kecepatan 100
rpm. Kemudian sebanyak 200 µl dari kultur awal tersebut diinokulasikan pada media
LB sebanyak 100 ml (sebagai kultur yang akan dipanen bakterinya) dan
ditumbuhkan selama 15-20 jam pada suhu 280C dengan dikocok pada kecepatan 100
rpm.
Panen bakteri dilakukan dengan cara mensentrifugasi suspensi bakteri yang
berasal dari kultur LB 100 ml pada 6000 rpm, selama 15 menit, dan suhu 40C.
Supernatan dibuang dan dikeringkan dengan kertas tissue selama 1 menit (harus
dijaga agar jangan sampai pelet keluar). Resuspensi pelet dilakukan dengan cara
menambahkan media regenerasi dari eksplan yang akan diinokulasi dengan
Agrobacterium. Sentrifugasi dan pengeringan dilakukan lagi seperti tahap
sebelumnya, kemudian resuspensi dilakukan kembali dengan media regenerasi
sebanyak 10 ml. Kultur diukur absorbannya dan ditera hingga mencapai nilai OD600
= 1 atau disesuaikan dengan perlakuan.
Persiapan eksplan dan inokulasi standar. Eksplan diiris dengan pisau
skalpel hingga berukuran 0.5 – 1 mm, kemudian diinokulasi dengan Agrobacterium
selama 10 menit (atau sesuai perlakuan). Periode kokultivasi dilakukan selama satu
hari (atau sesuai perlakuan). Eksplan kemudian dipindah ke media yang mengandung
antibiotik cefotaxim 300 mg L-1 selama lima hari. Setelah itu eksplan ditanam dalam
media seleksi (MS16 + cefotaxim 300 mg L-1 + kanamycin 100 mg L-1). Setiap 3
minggu sekali disubkultur hingga muncul tunas yang diduga transgenik.
Pengamatan integrative assay dilakukan pada 45 hari setelah inokulasi (HSI)
dan pengamatan transient assay dilakukan pada 7 HSI. Pengamatan dilakukan
5
terhadap jumlah eksplan yang ditanam, jumlah eksplan yang tertranformasi, dan
persentase sel/jaringan yang tertransformasi.
Percobaan pengaruh antibiotik kanamycin terhadap efisiensi regenerasi
tanaman. Percobaan ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh antibiotik kanamycin
terhadap efisiensi regenerasi tanaman kacang tanah dalam media regenerasi.
Percobaan ini menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) faktorial yang dilakukan
dengan cara mengkombinasikan 2 faktor yaitu konsentrasi antibiotik kanamycin dan
konsentrasi picloram. Konsentrasi antibiotik yang digunakan terdiri atas taraf yaitu:
0, 50 100, 150, 200, dan 250 mg L-1, sedangkan konsentrasi picloram yang
digunakan 3 taraf yaitu 8, 12, dan 16 µM L-1. Eksplan yang digunakan adalah 100
pada masing-masing perlakuan. Pengamatan dilakukan terhadap jumlah eksplan yang
mampu membentuk kalus embriogenik dan jumlah embrio pereksplan.
Percobaan untuk menentukan konsentrasi bakteri yang optimum.
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan konsentrasi bakteri yang optimum untuk
menghasilkan introduksi gen yang paling maksimal ke jaringan kacang tanah.
Konsentrasi optimum akan ditentukan berdasarkan ekspresi transien yang paling
tinggi pada jaringan yang diuji, kerusakan jaringan yang paling ringan, dan
keberhasilan dalam membebaskan jaringan dari kontaminasi Agrobacterium setelah
introduksi gen berhasil dilakukan.
Perlakuan konsentrasi bakteri yang diuji adalah suspensi bakteri dengan
konsentrasi OD600 = 0,25; 0,5; dan 1. Inokulasi dilakukan selama 15 menit. Eksplan
yang telah diinfeksi dikokultivasi di dalam media MS16 tanpa antibiotik selama satu
hari. Selanjutnya eksplan dipindahkan ke dalam media MS16 yang mengandung
antibiotik kanamycin (100 mg L-1) dan cefotaxime (300 mg L-1). Kanamycin
ditambahkan dalam media MS16 untuk menekan perkembangan sel/jaringan yang
tidak mengalami transformasi dan menumbuhkan jaringan yang membawa gen nptII
(gen ketahanan terhadap kanamycin), sedangkan cefotaxime ditambahkan untuk
membunuh kontaminan Agrobacterium yang sudah tidak diinginkan setelah proses
introduksi gen oleh bakterinya telah terjadi selama proses kokultivasi.
Jaringan
eksplan tersebut ditanam dalam media MS16 dengan antibiotik selama 1 minggu lalu
dianalisis dengan menggunakan transient assay untuk ekspresi gen gus.
6
Percobaan untuk menentukan lama waktu inokulasi yang optimum.
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan lama waktu inokulasi bakteri maksimal
ke jaringan kacang tanah. Eksplan diinokulasi dengan bakteri yang disiapkan dengan
cara merendam ke dalam larutan bakteri dengan konsentrasi OD600 = 0,5 selama 5,
15, dan 30 menit. Selanjutnya eksplan ditiriskan di atas kertas tissue steril untuk
membersihkan dari larutan bakteri berlebihan. Eksplan yang telah diinfeksi lalu
dikokultivasi di dalam media regenerasi embrio kacang tanah (media MS16) tanpa
antibiotik selama 24 jam. Inokulasi dan kokultivasi dilakukan untuk memberi
kesempatan bagi Agrobacterium untuk mentransfer gen nptII/gus ke jaringan kacang
tanah.
Analisis keberhasilan intoduksi gen gus dilakukan dengan melihat terjadinya
ekspresi gen ini secara transien. Analisis ekspresi gen gus dilakukan sebagaimana
telah dijelaskan sebelumnya. Selanjutnya banyaknya spot warna biru yang terbentuk
akan dihitung dan dipakai untuk menentukan waktu inokulasi yang paling optimum.
Percobaan untuk menentukan lama waktu kokultivasi yang optimum.
Percobaan ini bertujuan untuk menentukan waktu kokultivasi bakteri yang optimum
untuk menghasilkan introduksi gen yang paling maksimal ke jaringan kacang tanah.
Kultur Agrobacterium yang akan dipakai disiapkan sebagaimana dalam percobaan
sebelumnya. Konsentrasi bakteri yang dipakai OD600 = 0,5. Eksplan kacang tanah
yang digunakan disiapkan pada percobaan sebelumnya.
Eksplan diinokulasi dengan bakteri dengan cara merendam ke dalam larutan
bakteri yang konsentrasinya telah ditentukan sebelumnya, selama 15 menit.
Selanjutnya eksplan ditiriskan di atas kertas tissue steril untuk membersihkan dari
larutan bakteri berlebihan. Eksplan yang telah diinfeksi selanjutnya dikokultivasi di
dalam media regenerasi embrio kacang tanah (media MS16) tanpa antibiotik selama
12, 24, dan 48 jam. Eksplan kacang tanah yang digunakan berupa poros embrio atau
leaflet yang diisolasi dari biji kacang tanah tua yang telah disterilkan dan embrio
(masih terdapat bagian kalus embriogeniknya).
Setelah kokultivasi, selanjutnya eksplan dipindahkan ke dalam media MS16
yang mengandung antibiotik kanamycin (100 mg L-1) dan cefotaxime (300 mg L-1)
dan eksplan ditumbuhkan sebagaimana dalam percobaan sebelumnya. Jaringan
7
eksplan tersebut ditanam daam media MS16 dengan antibiotik selama satu minggu
sebelum dianalisis dengan menggunakan transient assay untuk ekspresi gen gus.
Percobaan untuk menentukan lama prekutur yang optimum. Percobaan
ini bertujuan untuk menentukan waktu prekultur yaitu waktu di antara isolasi eksplan
dan perlakuan inokulasi, yang optimum untuk mendapatkan frekuensi produksi gen
yang paling maksimum. Perlakuan prekultur akan membuat eksplan menjadi tidak
mudah mati akibat infeksi Agrobacterium yang dilakukan dan eksplan dalam kondisi
sedang tumbuh ke arah kalus embriogenik yang kemungkinan besar akan lebih
bersifat kompeten (lebih mudah diintroduksi). Dengan demikian transfer gen ke
jaringan eksplan diharapkan akan lebih baik.
Eksplan ditanam terlebih dahulu dalam media MS16 selama 0, 6, 12, dan 49
hari sebelum perlakuan inokulasi dan kokultivasi bakteri dilakukan. Selanjutnya
eksplan yang telah mengalami periode prekultur diinokulasi dan dikokultivasi
dengan Agrobacterium dan keberhasilan introduksi gen marker dianalisis seperti
pada percobaan sebelumnya.
Percobaan untuk menentukan jenis eksplan yang terbaik. Percobaan ini
bertujuan untuk menentukan jenis eksplan yang terbaik untuk mendapatkan frekuensi
introduksi gen yang paling maksimum. Eksplan yang berbeda mempunyai tingkat
keberhasilan transfer gen yang berbeda pula.
Kultur Agrobacterium yang akan dipakai disiapkan sebagaimana dalam
percobaan sebelumnya. Konsentrasi bakteri yang dipakai OD600 = 0,5. Eksplan
kacang tanah yang digunakan disiapkan sebagaimana pada percobaan sebelumnya.
Eksplan kacang tanah yang digunakan berupa poros embrio atau leaflet yang
diisolasi dari biji kacang tanah tua yang telah disterilkan dan embrio (masih terdapat
bagian kalus embriogeniknya).
Eksplan yang telah diinokulasi dengan bakteri disiapkan dengan cara
merendam ke dalam larutan bakteri yang konsentrasinya telah ditentukan
sebelumnya yaitu selama 15 menit. Selanjutnya eksplan ditiriskan di atas kertas
tissue steril untuk membersihkan dari larutan bakteri berlebihan. Eksplan yang telah
diinfeksi selanjutnya dikokultivasi di dalam media regenerasi embrio kacang tanah
(media MS16) tanpa antibiotik selama 24 jam.
8
Analisis embrio transgenik dengan PCR.
Embrio yang muncul dan
mampu hidup dalam media seleksi selama sebelas minggu setelah inokulasi dengan
Agrobacterium kemudian dideteksi gen gusnya dengan PCR seperti yang dilakukan
oleh Thomson & Dietzgen (1995). Primer yang digunakan mempunyai sekuen
sebagai berikut.
: 5’-CGA TAC CTC TCT TTA GGC ATT GG-3’
: 5’-CAG CTG TCA TTG TTT GCC TCC CTG CTG CGG-3’
GUS1
CH4
Produk yang diberikan oleh primer GUS1 dan CH4 berukuran 600 bp.
Kondisi amplifikasi yang digunakan adalah 940C selama 3 menit, 35 siklus dari 940C
selama 45 detik, 550C selama 45 detik dan 720C selama 90 detik, kemudian
dilanjutkan pada 720C selama 10 menit. Kondisi terakhir reaksi berada pada suhu
40C sampai dirunning pada gel electroforesis.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Percobaan pengaruh antibiotik kanamycin terhadap efisiensi regenerasi
tanaman.
Pengaruh
konsentrasi
antibiotik
kanamycin
terhadap
kemampuan
eksplan
membentuk kalus dan pembentukan embrio disajikan pada Tabel 1.
Tabel 1. Pengaruh Konsentrasi Antibiotik Kanamycin terhadap Pembentukan
Kalus dan Embrio dari Eksplan Leaflet Kacang Tanah Pada 4 MST
[Kan] (mg/l)
[Picloram] (µM/l)
8
12
16
0
Jumlah
K
E
50
Jumlah
K
E
100
Jumlah
K
E
150
Jumlah
K
E
200
Jumlah
K
E
250
Jumlah
K
E
93
44
21
77
78
89
1
1
3
0
0
0
0
0
0
0
0
0
17
9
10
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Catatan: MST = Minggu Setelah Tanam; K = Kalus; E = Embrio; Jumlah eksplan =
100/perlakuan
Seperti yang telah dikemukakan di atas bahwa percobaan ini bertujuan untuk
mengetahui pengaruh antibiotik kanamycin terhadap efisiensi regenerasi tanaman
kacang tanah dalam media regenerasi. Dari Tabel 1 terlihat bahwa kalus masih dapat
9
terbentuk sekitar 70-80% tetapi embrio sudah tidak dapat terbentuk pada konsentrasi
kanamycin 50 mg L-1 hingga pengamatan pada 4 MST, padahal tanpa antibiotik
embrio sudah mulai terbentuk pada 2 MST.
Pada konsentrasi 100 mg L-1
Kanamycin, terdapat kalus hanya sekitar 1-3% dan embrio tidak terbentuk sama
sekali. Kalus yang terbentuk terlihat berwarna kecoklatan hingga hitam, yang
menunjukkan bahwa kalus tersebut menuju proses kematian.
Melihat kondisi demikian, konsentrasi 100 mg L-1 ini dipilih untuk percobaan
selanjutnya sebab konsentrasi itu dapat menghambat regenerasi tanaman atau
mematikan jaringan ekspan. Antibiotik dengan konsentrasi 100 mg L-1 ini akan
digunakan untuk menyeleksi tanaman transgenik (yang tersisipi gen ketahanan
terhadap antibiotik). Sel-sel/jaringan tanaman yang mempunyai gen ketahanan
terhadap antibiotik kanamycin akan terus tumbuh beregenerasi menjadi tanaman.
Namun, sel/jaringan tanaman yang tidak tersisipi gen ketahanan tersebut akan mati
atau terhambat pertumbuhannya dan tidak bisa berkembang lebih lanjut.
Percobaan untuk menentukan konsentrasi bakteri yang optimum.
Respon eksplan leaflet, embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet dan
embrio/kalus embriogenik terhadap berbagai perlakuan populasi bakteri yang dipakai
untuk menginokulasi ekspan disajikan pada Tabel 2.
Tabel 2. Respon Eksplan Leaflet, Embrio Axis Tanpa Radikel Tanpa Leaflet, dan
Embrio terhadap Berbagai Perlakuan Populasi Bakteri yang Dipakai untuk
Menginokulasi Eksplan. Inokulasi Bakteri Dilakukan Selama 15 Menit
Dalam Suspensi Bakteri OD600=0.5
Tipe eksplan
Leaflet
EA-RL
E
Populasi
bakteri
(OD600)
0.25
0.5
1
0.25
0.5
1
0.25
0.5
1
Jumlah
eksplan yang
ditanam
500
500
500
100
100
100
200
200
200
Jumlah
eksplan yang
diuji
200
200
200
35
35
35
100
100
100
Eksplan yang
GUS [+]
Jumlah spot
per eksplan
0
0
0
0
0
0
0
2
3
0
0
0
0
0
0
0
1
1
Catatan: Pengamatan dilakukan hingga 45 HSI. Data rata-rata dari tiga kali
percobaan EA-RL=embrio tanpa bakal akar dan bakal daun. EA-R=embrio tanpa
bakal akar.
10
Dari tabel itu terlihat bahwa eksplan positif berwarna biru yang tahan
kanamycin hingga 45 HSI diperoleh jika kita menggunakan bakteri dengan
konsentrasi OD600=0,5 dan 1. Namun, pada konsentrasi OD600 =1 bakteri sangat sulit
dimatikan.
Dalam beberapa percobaan bahkan tidak dapat dimatikan. Dengan
demikian OD600=0,5 lebih baik untuk dipilih. Dari tabel tersebut juga dapat diambil
kesimpulan bahwa eksplan terbaik yang dapat menghasilkan eksplan positif
berwarna biru tahan kanamycin adalah eksplan embrio atau kalus embriogenik. Jadi
dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa sebaiknya digunakan konsentrasi bakteri
OD600=0,5 dan eksplan embrio/kalus embriogenik.
Percobaan untuk menentukan lama inokulasi yang optimum.
Respon eksplan leaflet, embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet, dan
embrio/kalus embriogenik terhadap lama waktu inokulasi yang digunakan seperti
disajikan pada Tabel 3.
Tabel 3. Respon Eksplan Leaflet, Embrio Axis Tanpa Radikel Tanpa Leaflet, dan
Embrio terhadap Berbagai Perlakuan Lama Inokulasi yang Dipakai untuk
Menginokulasi Eksplan.
Tipe
Lama
Jumlah
Jumlah
Eksplan
Jumlah spot
eksplan
inokulasi
eksplan
eksplan
yang GUS per eksplan
(menit)
yang
yang diesei
[+]
ditanam
Leaflet
5
250
100
0
0
15
250
100
1
1
30
250
100
2
2
EA-RL
5
100
40
0
0
15
100
40
0
0
30
100
40
0
0
E
5
200
100
0
0
15
200
100
3
3
30
200
100
0
0
Catatan: Pengamatan dilakukan hingga 45 HSI. Data rata-rata dari tiga kali
percobaan EA-RL=embrio tanpa bakal akar dan bakal daun. E =embrio/kalus
embriogenik.
Dari Tabel 3. terlihat bahwa eksplan positif berwarna biru yang tahan
kanamycin hingga 45 HSI diperoleh jika digunakan lama waktu inokuasi 15 dan 30
11
menit pada eksplan leaflet dan lama waktu inoulasi 15 menit pada eksplan
embrio/kalus embriogenik. Pada lama waktu inokulasi 30 menit bakteri sangat sulit
dimatikan, bahkan dalam beberapa percobaan tidak dapat dimatikan. Dengan
demikian lama waktu inokulasi 15 menit lebih baik untuk dipilih. Dari tabel tersebut
juga dapat diambil kesimpulan bahwa eksplan terbaik yang dapat menghasikan
embrio tahan kanamycin adalah eksplan embrio atau kalus embriogenik. Jadi dari
percobaan ini dapat kita simpulkan bahwa sebaiknya digunakan lama waktu
inokulasi 15 menit dan eksplan embrio/kalus embriogenik.
Percobaan untuk menentukan lama waktu kokultivasi yang optimum.
Respon eksplan leaflet, embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet, dan embrio/kalus
embriogenik terhadap lama waktu kokultivasi yang digunakan seperti disajikan pada
Tabel 4.
Tabel 4. Respon eksplan leaflet, embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet, dan embrio
terhadap berbagai perlakuan lama waktu kokultivasi.
Tipe
eksplan
Lama
Jumlah
Jumlah
Eksplan
Jumlah spot
kokultivasi
eksplan
diesei
yang GUS
per eksplan
(hari)
[+]
Leaflet
1
1000
100
0
0
2
1000
100
0
0
EA-RL
1
200
40
0
0
2
200
40
0
0
E
1
250
100
2
1
2
250
100
3
1
Catatan: Pengamatan dilakukan hingga 45 HSI. Data rata-rata dari tiga kali
percobaan EA-RL=embrio tanpa bakal akar dan bakal daun. E =embrio/kalus
embriogenik.
Dari Tabel 4 terlihat bahwa eksplan positif berwarna biru yang tahan
kanamycin hingga 45 HSI diperoleh jika kita menggunakan lama waktu kokultivasi 1
dan 2 hari pada eksplan embrio/kalus embriogenik. Pada lama waktu kokultivasi 2
hari, bakteri sangat sulit dimatikan, bahkan dalam beberapa percobaan tidak dapat
dimatikan. Dengan demikian lama waktu inokulasi 1 hari lebih baik untuk dipilih.
Dari tabel tersebut juga dapat diambil kesimpulan bahwa eksplan terbaik yang dapat
menghasilkan embrio tahan kanamycin adalah eksplan embrio atau kalus
12
embriogenik. Jadi, dari percobaan ini dapat disimpulkan bahwa sebaiknya digunakan
lama waktu kokultivasi 1 hari dan eksplan embrio/kalus embriogenik.
Percobaan untuk menentukan lama pre kultur yang optimum.
Respon eksplan leaflet dan embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet terhadap
lama waktu prekultur yang digunakan seperti disajikan pada Tabel 5.
Tabel 5. Respon eksplan leaflet dan embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet terhadap
berbagai perlakuan lama prekultur.
Tipe
eksplan
Lama
prekultur
(hari)
Jumlah
Jumlah
Eksplan
Jumlah spot
eksplan
eksplan
yang GUS per eksplan
yang
yang diesei
[+]
ditanam
EA-R
49
750
35
7
7
Leaflet
0
400
50
0
0
6
600
50
0
0
12
400
50
0
0
49
550
50
7
7
EA-RL
0
300
35
0
0
6
300
35
0
0
12
300
35
0
0
49
605
35
7
7
Catatan: Pengamatan dilakukan hingga 45 HSI. Data rata-rata dari tiga kali
percobaan EA-RL=embrio tanpa bakal akar dan bakal daun. EA-R=embrio tanpa
bakal akar.
Dari Tabel 5 terlihat bahwa eksplan positif berwarna biru yang tahan
kanamycin hingga 45 HSI diperoleh jika kita menggunakan eksplan leaflet dan
eksplan embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet yang telah diprekultur selama 49 hari.
Dengan demikian eksplan leaflet dan eksplan embrio axis tanpa radiel tanpa leaflet
yang telah diprekultur selama 49 HST, keduanya baik untuk dipilih. Sebagai catatan
eksplan leaflet maupun eksplan embrio axis tanpa radiel tanpa leaflet yang telah
diprekultur selama 49 HST telah menjadi eksplan embrio/kalus embriogenik.
Jadi, percobaan ini memperkuat kesimpulan percobaan sebelumnya bahwa
untuk dapat ditransfer eksplan butuh diprekultur lebih dahulu sehingga membentuk
embrio atau kalus embriogenik. Hal ini kemungkinan besar disebabkan pada kacang
tanah kondisi sel yang telah mengalami prekultur menjadi lebih kompeten
13
dibandingkan dengan sel yang belum diprekultur. Di samping itu Agrobacterium
akan lebih mudah mentransfer gen pada sel yang sedang aktif membelah.
Percobaan untuk menentukan jenis eksplan yang terbaik.
Respon
eksplan leaflet, embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet dan embrio/kalus embriogenik
setelah inokulasi Agrobacterium seperti disajikan pada Tabel 6.
Dari tabel itu terlihat bahwa eksplan positif berwarna biru diperoleh jika kita
menggunakan eksplan leaflet dan ekspan embrio/kalus embriogenik. Jika
pengamatan diteruskan hingga 40 hari setelah inokulasi (Tabel 7) ternyata se-sel
positif berwarna biru pada eksplan leaflet tidak dapat berkembang dan akhirnya mati.
Dengan demikian eksplan leaflet tidak disarankan untuk dipilih, sedangkan eksplan
embrio/kalus embriogenik terbaik untuk dipilih.
A
B
Gambar 2. Embrio Positif GUS. A. Transient Assay B. Integrative Assay
Tabel 6. Respon Eksplan Leaflet, Embrio Axis Tanpa Radikel Tanpa Leaflet, dan
Embrio (Transient Assay) Setelah Introduksi Gen Gus.
Tipe eksplan
Jumlah
Jumlah
Eksplan
Jumlah spot
eksplan total eksplan yang yang GUS
per eksplan
diesei
[+]
Leaflet
2000
200
13
20
EA-RL
400
40
0
0
E
400
200
30
35
Catatan: esei dilakukan pada 7 hari setelah inokulasi; EA-RL=embrio tanpa bakal
akar dan bakal daun; E =embrio/kalus embriogenik.
14
Respon eksplan leaflet, embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet, dan
embrio/kalus embriogenik setelah inokulasi dengan Agrobacterium disajikan pada
Tabel 7. Dari Tabel 7. tersebut terlihat bahwa eksplan positif berwarna biru yang
tahan kanamycin hingga 45 HSI diperoleh jika kita menggunakan eksplan
embrio/kalus embriogenik (Gambar 2).
Dengan demikian eksplan embrio/kalus
embriogenik terbaik untuk dipilih.
Tabel 7. Respon eksplan leaflet, embrio axis tanpa radikel tanpa leaflet, dan embrio
(Integrative assay) setelah Introdusi gen gus.
Tipe eksplan
Jumlah
Jumlah
Eksplan
Jumlah spot
eksplan total eksplan yang yang GUS
per eksplan
diesei
[+]
Leaflet
2000
200
0
0
EA-RL
400
40
0
0
E
400
200
2
2
Catatan: esei dilakukan pada 45 HSI; EA-RL=embrio tanpa bakal akar dan bakal
daun; E =embrio/kalus embriogenik.
Pengujian dengan teknik PCR. Untuk membuktikan apakah embrio
tersebut benar-benar mengandung gen gus perlu diuji. Uji yang paling ideal dengan
menggunakan teknik southern blot, tetapi teknik sothern blot tidak dapat kita
terapkan untuk embrio sebab teknik ini memerlukan ekstrak DNA yang cukup
banyak yang tidak dapat kita peroleh dari embrio yang berukuran sangat kecil. Salah
satu alternatif pengujian adalah dengan PCR yang tidak memerlukan DNA banyak.
Pengujian DNA embrio yang berasal dari Agrobacterium sangat dikuatirkan
terdapat kontaminasi DNA dari Agrobacterium. Untuk menghindari kemungkinan
kontaminasi ini, bagian embrio yang di PCR adalah bagian ujung (diusahakan sejauh
mungkin dari bagian yang berkalus).
Untuk menguji apakah pada embrio masih terdapat Agrobacterium hidup
sebelum uji PCR hádala sebagai berikut. Setengah dari embrio yang diduga resisten
higromicin direndam lebih dahulu pada media bakteri selama 24 jam, kemudian
media bakteri tersebut disebarkan di atas media padat bakteriologis (LA; untuk
melihat apakah masih terdapat kontaminasi bakteri pada eksplan). Ternyata tidak ada
satupun bakteri yang tumbuh hingga 7 hari pengamatan, sedangkan media padat
yang diberi bakteri hidup dari kultur cair, bakteri dapat tumbuh dengan baik. Dengan
15
demikian
embrio
yang
diperoleh
dapat
diyakinkan
15
20
tidak
terkontaminasi
Agrobacterium.
5
10
600 bp
Gambar 3. PCR DNA total dari setengah embrio pada percobaan III dengan
menggunakan primer GUS1 & CH4. Lajur 1 kosong, Lajur 25 marker 1
kb ladder; ajur 2, kontrol tanpa template (akuades); Lajur 3-9, 7 DNA
total dari setengah embrio yang berasal dari EA-R; Lajur 10-16, 7 DNA
total dari setengah embrio yang berasal dari leaflet; Lajur 17-23, 7 DNA
total dari setengah embrio yang berasal dari EA-RL; Lajur 4-8, 10-12
17 19, 20 adalah embrio yang positif mengandung gen gus, memberikan
produk fragmen sepanjang 600 bp. Lajur 3, 9, 13-16, 18, dan 21-23
adalah embrio yang negatif mengandung gen gus; Lajur 24 adalah
pTOK233 DNA murni hasil maxiprep.
Hasil PCR terhadap setengah embrio menggunakan primer GUS1 & CH4
disajikan pada Gambar 3. Lajur 1 dan 25 adalah 1 kb ladder (marker). Kontrol
negatif dalam percobaan ini menggunakan air steril (Lajur 2) memang tidak muncul
potongan DNA. Hal ini membuktikan bahwa air steril yang kita gunakan tidak
terkontaminasi.
Dari Gambar 3. dapat kita ketahui keberhasilan integrasi gen gus setelah
analisis dengan PCR sebagai berikut. Sebanyak 7 embrio, yang berasal dari eksplan
EA-R berada pada lajur 3-9. Dari sejumlah 7 embrio 2 embrio (28.5%) yang tidak
menghasilkan produk DNA sebesar 600 bp/tidak mengandung gen gus (lajur 3 dan
9), sebanyak 7 embrio yang berasal dari eksplan leaflet berada pada lajur 10-16, dari
jumlah 7 embrio hanya terdapat 4 embrio (57%) yang tidak menghasilkan produk
DNA sebesar 600 bp/tidak mengandung gen gus (lajur 13-16). Sebanyak 7 embrio
yang berasal dari eksplan EA-R berada pada lajur 17-23. Dari sejumlah 7 embrio
16
terdapat 4 (57%) embrio yang tidak menghasilkan produk DNA sebesar 600 bp/tidak
mengandung gen gus (lajur 18 dan 21-23).
KESIMPULAN
Dari beberapa seri percobaan di atas dapat diambil kesimpuan bahwa hasil
terbaik integrasi gen gus pada kacang tanah dalam penelitian ini diperoleh jika kalus
embriogenik umur 49 HST digunakan sebagai eksplan dengan lama waktu inokulasi
15 menit, lama waktu kokultivasi 24 jam, dan konsentrasi bakteri OD600 = 0,5.
Konsentrasi kanamycin terendah yang sangat menghambat regenerasi tanaman
kacang tanah adalah 100 mg L-1.
UCAPAN TERIMAKASIH
Terimakasih kepada pembimbing: Prof Dr Surkati Abidin, Prof Dr Rusmilah Suseno,
Dr. Sudarsono, Dr. Hajrial Aswidinnoor, dan Dr. Satriyas Ilyas. Juga terimakasih
kepada lembaga pemberi dana untuk penelitian ini: RUT VII: Pengembangan
kacang tanah transgenik tahan PStV, DRN, KMNRT (cq. Dr. Sudarsono). Kepada
Dra. Erna Rochiyati, MSi. juga diucapkan terimakasih atas perannya sebagai
penyelaras bahasa.
DAFTAR PUSTAKA
Cheng, M., Jarret R.L., Li, Z., Xing. A. And Demsi, J.W. 1996. Production of fertile
transgenic peanut (Arachis hypogaea L.) plant using Agrobacterium
tumefaciens. Plant Cell Rep. 16:653-657.
Hiei, Y., T. Komari, and T. Kubo. 1997. Transformation of rice mediated by
Agrobacterium tumefaciens. Plan Mol. Biol. 35:205-218.
Lee, S., H. Marimoto, and P.G. Wiliams. 1997. Synthesis of high specific
radioactivity 35-(3H-6) dimethoxy-4-hydroxyacetophenone, an inducing
compound of the vir gene in Agrobacterium tumefaciens. Journal of Labelled
Compound and Radiopharmaceutica. 39(6):461-470.
Rakousky, S., T. Kocabek, R. Vincenciova, and M. Ondrej. 1998. Transient Bglucuronidase activity after infiltration of Arabidopsis thaliana by
Agrobacterium tumefaciens. Biologia Plantarum 40(1):33-41.
Ranghotama, K.G., A. Maggio, M. L. Narasimhan, A.K. Kononowics, G. Wang, M.
Paino-D’urzo, P.M. Hasegawa, and R.A. Bressan. 1997. Tissue-specific
activation of the osmotin gene by ABA, C-2H-4 and NaCl involves the
same promoter region. Plant Mol. Biol. 34(3):393-402.
17
Shetty, K., M. Ohshima, T. Murakami, K. Oosawa, and Y. Ohashi. 1997. Transgenic
melon (Cucumis meo L.) and potential for expression of novel proteins
important to food industry. Food Biotechnoogy. 11(2):111-128.
Thomson, D. and R.G. Dietzgen. 1995. Detection of DNA and RNA plant viruses by
PCR and RT-PCR using a rapid virus release protocol without tissue
homogenization. J. Virological Methods 54:85-95.
18