KELEBIHAN DAN KELEMAHAN MASING MASING ME
KELEBIHAN DAN KELEMAHAN MASING-MASING METODE DALAM
ANALISA PROTEIN
Metode Kjedhal
a. Kelebihan :
1) Metode Kjeldahl digunakan secara luas di seluruh dunia dan masih merupakan metode standar
dibanding metode lain.
2) Dapat diaplikasikan pada semua jenis makanan
3) Tidak mahal (Jika tidak menggunakan autosistem)
4) Akurat untuk protein kasar
5) Dapat dimodifikasi untuk mengukur jumlah kecil protein
6) Sifatnya yang universal, presisi tinggi dan reprodusibilitas baik membuat metode ini banyak
digunakan untuk penetapan kadar protein.
b. Kelemahan :
1. Mengukur total N organic, termasuk N yang bukan protein.
2. Memakan waktu (2 jam)
3. Protein yang berbeda memerlukan faktor koreksi yang berbeda karena susunan residu
asam amino yang berbeda.
4. Menggunakan reagen-reagen yang sangat korosif dan prosesnya yang lumayan berbahaya
Kelemahan dan kelebihan metode ini dikarenakan :
Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada
asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen semua jenis nitrogen akan
terhitung meskipun bukan dari protein.
Proses daripada metode ini melewati proses yang panjang --. Memakan waktu yang lama.
a. Destruksi
Pada proses ini terjadi proses pembebasan amoniak menjadi ammonium sulfat. Dalam
prosesnya menggunakan H2SO4 (yang sangat berbahaya dan korosif) selain itu
ditambahkan pula katalisator yang berfungsi mempertinggi titik didih asam sulfat
tersebut sanagt berbahaya)
b. Destilasi
Pada proses destilasi, ditambahkan NaOH pekat ammonium sulfat gas amoniak.
Gas amoniak yang menguap akan ditangkap oleh asam borat.
c. Titrasi
Ammonium borat akan dititrasi dengan HCL ammonium clorida dan jumlah gas
ammoniak yang dibebaskan sebanding dengan jumlah HCl titran.
Hasil Notrogen yang didapatkan harus dikalikan dengan factor konversi, sementara itu factor
konversi masing-masing protein berbeda-beda.
Metode Lowry
Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk
sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion
Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat phosphotungstat
(phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropoly molybdenum blue akibat reaksi oksidasi
gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif
yang dapat dideteksi secara kolorimetri.
a. Kelebihan :
1. Sangat sensitive
- 50 – 100x lebih sensitive daripada metode biuret
Maninggar K. / Reguler-17/ P27834012021 / SMT V
Page 1
- 10 – 20x lebih sensitive dari UV absorption method
2. Kurang dipengaruhi oleh turbiditas sampel
3. Lebih spesifik
4. Sederhana, dapat dilakukan 1 – 1,5 jam
b. Kekurangan :
1. Warna bervariasi dihasilkan pada protein yang berbeda
2. Warna tidak terbatas pada konsentrasi protein dan dengan senyawa fenol dapat membentuk
warna biru sehingga bisa menganggu hasil penetapan
3. Reaksi dapat dipengaruhi oleh sukrosa, lipid, buffer phosphate, monosakarida dan
heksoamin,
Interferensi agen-agen ini dapat diminimalkan dengan menghilangkan interferens tersebut.
Sangat dianjurkan untuk menggunakan blanko untuk mengkoreksi absorbansi. Interferensi
yang disebabkan oleh deterjen, sukrosa dan EDTA dapat dieliminasi dengan penambahan
SDS atau melakukan preparasi sampel dengan pengendapan protein.
Metode Biuret
Protein yang terukur pada metode biuret adalah protein yang larut air (protein terlarut),
karena yang diukur adalah jumlah ikatan peptida dalam protein, maka tidak dapat mendeteksi
nitrogen dari senyawa non peptida sehingga yang terukur adalah protein sesungguhnya.
a. Kelebihan :
1. Murah
2. Cepat (30 menit)
3. Penyimpangan warna jarang ditemukan dibandingkan dengan metode lain.
4. Sangat sedikit substansi lain yang terdeteksi
5. N dari non peptide dan non peptide tidak terdeteksi
b. Kelemahan
1. Kurang sensitif dibandingkan lowry
2. Penyerapan warna dapat dipengaruhi oleh pigmen bila ada
3. Konsentrasi tinggi dari garam ammonium dapat menimbulkan reaksi
4. Terjadi variasi warna pada jenis protein yang berbeda, kurang sensitif terhadap jenis protein
karena absorpsi yang terjadi melibatkan ikatan peptida yang ada di semua protein, bukan
pada gugus samping spesifik.
5. Penyimpangan warna dapat terjadi pada larutan bila terdapat kadar lemak dan karbohidrat
yang tinggi
Metode Bradford
a. Kelebihan
1. Cepat (2 menit), pereaksi yang digunakan sangat sederhana dan mudah untuk disiapkan
2. Kompleks warna biru pada larutan yang diberi reagen bardford sanagt cepat terbentuk dan
bersifat stabil. Kestabilan warna biru coomasie ini karena adanya interaksi antara lapisan
hidrofobik dari protein dengan bentuk anion dari zat wana coomasie brilliant blue G250 yang
menstabilkan bentuk anion tersebut.
3. Tidak terpengaruh ammonium sulfat, sukrosa atau kation
4. Dapat mengukur protein dengan BM Lebih dari 4000 da
b. Kelemahan
1. Terpengaruh dengan deterjen non-ionik dan ionik, namun karena jumlanya kecil masih dapat
dikontrol. Bila terjadi kontaminasi dengan NaCl pada serum BSA, maka yang terjadi adalah
absorbansi larutan akan semakin kecil
Maninggar K. / Reguler-17/ P27834012021 / SMT V
Page 2
2. Kompleks protein dengan larutan dapat berikatan dengan kuvet dari kwarsa, sehingga harus
menggunakan kuvet plastik atau kaca
3. Terjadi variasi warna, sehingga dalam pemilihan standart protein harus hati-hati
Metode Formol
Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin akan membentuk
dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan
mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan
tepat. Indikator yang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi
merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik.
a. Kelebihan
- Hanya tepat digunakan utnuk menentukan suatu proses terjadinya pemecahan
- Murah, cepat dan tidak memerlukan keahlian khusus. (Ragensia yang digunakan sudah sering
dijumpai dan mudah untuk didapatkan. Selain itu titrasi ini menggunakn prinsip titrasi asambasa yang sudah sering digunakan)
b. Kerugian
Kurang tepat untuk menentukan jenis protein tertentu.
Metode Dye Binding (Pengikatan zat warna)
Adanya gugus polar dalam protein dapat mengikat zat warna yang bermuatan berlawanan
dengan muatan protein membentuk komplek warna yang tak larut. Zat warna yang sering digunakan
ialah zat warna asidik seperti Amino Black 10B (λ maks 615 nm) dan Orange G (λ maks 485 nm)
karena memiliki 2 gugus –SO3H (negatif) sehingga akan berikatan kuat dengan gugus amina yang
bersifat basa dari protein. Protein membentuk kompleks tak larut dengan pewarna karena interaksi
elektrostatik antar molekul, tapi masih tersisa pewarna tak terikat yang larut. Pewarna anionic
berikatan dengan gugus kationik dari residu asam amino basa (histidine, arganine dan lysine) dan
pada gugus asam amino bebas di ujung. Jumlah pewarna tak terikat yang tersisa setelah kompleks
protein-pewarna dipisahkan (misalnya dengan sentrifugasi) ditentukan dengan pengukuran serapan.
Jumlah protein yang ada di larutan awal berhubungan dengan jumlah pewarna yang terikat :
[Pewarna terikat] = [Pewarna awal] - [Pewarna bebas]
a. Kelebihan
- Cepat
- Reagen relative murah dan mudah didapatkan
b. Kekurangan
- Diperlukan ketelitian yang ekstra, karena biasanya bila kurang teliti hasil pengukuran sesudah
akan lebih tinggi.
- Tidak untuk menentukan jenis protein yang ada.
- Harus mencapai titik isoelektris, jika tidak maka hasil yang didapatkan tidak akan sesuai.
Maninggar K. / Reguler-17/ P27834012021 / SMT V
Page 3
ANALISA PROTEIN
Metode Kjedhal
a. Kelebihan :
1) Metode Kjeldahl digunakan secara luas di seluruh dunia dan masih merupakan metode standar
dibanding metode lain.
2) Dapat diaplikasikan pada semua jenis makanan
3) Tidak mahal (Jika tidak menggunakan autosistem)
4) Akurat untuk protein kasar
5) Dapat dimodifikasi untuk mengukur jumlah kecil protein
6) Sifatnya yang universal, presisi tinggi dan reprodusibilitas baik membuat metode ini banyak
digunakan untuk penetapan kadar protein.
b. Kelemahan :
1. Mengukur total N organic, termasuk N yang bukan protein.
2. Memakan waktu (2 jam)
3. Protein yang berbeda memerlukan faktor koreksi yang berbeda karena susunan residu
asam amino yang berbeda.
4. Menggunakan reagen-reagen yang sangat korosif dan prosesnya yang lumayan berbahaya
Kelemahan dan kelebihan metode ini dikarenakan :
Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada
asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen semua jenis nitrogen akan
terhitung meskipun bukan dari protein.
Proses daripada metode ini melewati proses yang panjang --. Memakan waktu yang lama.
a. Destruksi
Pada proses ini terjadi proses pembebasan amoniak menjadi ammonium sulfat. Dalam
prosesnya menggunakan H2SO4 (yang sangat berbahaya dan korosif) selain itu
ditambahkan pula katalisator yang berfungsi mempertinggi titik didih asam sulfat
tersebut sanagt berbahaya)
b. Destilasi
Pada proses destilasi, ditambahkan NaOH pekat ammonium sulfat gas amoniak.
Gas amoniak yang menguap akan ditangkap oleh asam borat.
c. Titrasi
Ammonium borat akan dititrasi dengan HCL ammonium clorida dan jumlah gas
ammoniak yang dibebaskan sebanding dengan jumlah HCl titran.
Hasil Notrogen yang didapatkan harus dikalikan dengan factor konversi, sementara itu factor
konversi masing-masing protein berbeda-beda.
Metode Lowry
Dalam metode ini terlibat 2 reaksi. Awalnya, kompleks Cu(II)-protein akan terbentuk
sebagaimana metode biuret, yang dalam suasana alkalis Cu(II) akan tereduksi menjadi Cu(I). Ion
Cu+ kemudian akan mereduksi reagen Folin-Ciocalteu, kompleks phosphomolibdat phosphotungstat
(phosphomolybdotungstate), menghasilkan heteropoly molybdenum blue akibat reaksi oksidasi
gugus aromatik (rantai samping asam amino) terkatalis Cu, yang memberikan warna biru intensif
yang dapat dideteksi secara kolorimetri.
a. Kelebihan :
1. Sangat sensitive
- 50 – 100x lebih sensitive daripada metode biuret
Maninggar K. / Reguler-17/ P27834012021 / SMT V
Page 1
- 10 – 20x lebih sensitive dari UV absorption method
2. Kurang dipengaruhi oleh turbiditas sampel
3. Lebih spesifik
4. Sederhana, dapat dilakukan 1 – 1,5 jam
b. Kekurangan :
1. Warna bervariasi dihasilkan pada protein yang berbeda
2. Warna tidak terbatas pada konsentrasi protein dan dengan senyawa fenol dapat membentuk
warna biru sehingga bisa menganggu hasil penetapan
3. Reaksi dapat dipengaruhi oleh sukrosa, lipid, buffer phosphate, monosakarida dan
heksoamin,
Interferensi agen-agen ini dapat diminimalkan dengan menghilangkan interferens tersebut.
Sangat dianjurkan untuk menggunakan blanko untuk mengkoreksi absorbansi. Interferensi
yang disebabkan oleh deterjen, sukrosa dan EDTA dapat dieliminasi dengan penambahan
SDS atau melakukan preparasi sampel dengan pengendapan protein.
Metode Biuret
Protein yang terukur pada metode biuret adalah protein yang larut air (protein terlarut),
karena yang diukur adalah jumlah ikatan peptida dalam protein, maka tidak dapat mendeteksi
nitrogen dari senyawa non peptida sehingga yang terukur adalah protein sesungguhnya.
a. Kelebihan :
1. Murah
2. Cepat (30 menit)
3. Penyimpangan warna jarang ditemukan dibandingkan dengan metode lain.
4. Sangat sedikit substansi lain yang terdeteksi
5. N dari non peptide dan non peptide tidak terdeteksi
b. Kelemahan
1. Kurang sensitif dibandingkan lowry
2. Penyerapan warna dapat dipengaruhi oleh pigmen bila ada
3. Konsentrasi tinggi dari garam ammonium dapat menimbulkan reaksi
4. Terjadi variasi warna pada jenis protein yang berbeda, kurang sensitif terhadap jenis protein
karena absorpsi yang terjadi melibatkan ikatan peptida yang ada di semua protein, bukan
pada gugus samping spesifik.
5. Penyimpangan warna dapat terjadi pada larutan bila terdapat kadar lemak dan karbohidrat
yang tinggi
Metode Bradford
a. Kelebihan
1. Cepat (2 menit), pereaksi yang digunakan sangat sederhana dan mudah untuk disiapkan
2. Kompleks warna biru pada larutan yang diberi reagen bardford sanagt cepat terbentuk dan
bersifat stabil. Kestabilan warna biru coomasie ini karena adanya interaksi antara lapisan
hidrofobik dari protein dengan bentuk anion dari zat wana coomasie brilliant blue G250 yang
menstabilkan bentuk anion tersebut.
3. Tidak terpengaruh ammonium sulfat, sukrosa atau kation
4. Dapat mengukur protein dengan BM Lebih dari 4000 da
b. Kelemahan
1. Terpengaruh dengan deterjen non-ionik dan ionik, namun karena jumlanya kecil masih dapat
dikontrol. Bila terjadi kontaminasi dengan NaCl pada serum BSA, maka yang terjadi adalah
absorbansi larutan akan semakin kecil
Maninggar K. / Reguler-17/ P27834012021 / SMT V
Page 2
2. Kompleks protein dengan larutan dapat berikatan dengan kuvet dari kwarsa, sehingga harus
menggunakan kuvet plastik atau kaca
3. Terjadi variasi warna, sehingga dalam pemilihan standart protein harus hati-hati
Metode Formol
Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin akan membentuk
dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus aminonya sudah terikat dan tidak akan
mempengaruhi reaksi antara asam dengan basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan
tepat. Indikator yang digunakan adalah p.p., akhir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi
merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik.
a. Kelebihan
- Hanya tepat digunakan utnuk menentukan suatu proses terjadinya pemecahan
- Murah, cepat dan tidak memerlukan keahlian khusus. (Ragensia yang digunakan sudah sering
dijumpai dan mudah untuk didapatkan. Selain itu titrasi ini menggunakn prinsip titrasi asambasa yang sudah sering digunakan)
b. Kerugian
Kurang tepat untuk menentukan jenis protein tertentu.
Metode Dye Binding (Pengikatan zat warna)
Adanya gugus polar dalam protein dapat mengikat zat warna yang bermuatan berlawanan
dengan muatan protein membentuk komplek warna yang tak larut. Zat warna yang sering digunakan
ialah zat warna asidik seperti Amino Black 10B (λ maks 615 nm) dan Orange G (λ maks 485 nm)
karena memiliki 2 gugus –SO3H (negatif) sehingga akan berikatan kuat dengan gugus amina yang
bersifat basa dari protein. Protein membentuk kompleks tak larut dengan pewarna karena interaksi
elektrostatik antar molekul, tapi masih tersisa pewarna tak terikat yang larut. Pewarna anionic
berikatan dengan gugus kationik dari residu asam amino basa (histidine, arganine dan lysine) dan
pada gugus asam amino bebas di ujung. Jumlah pewarna tak terikat yang tersisa setelah kompleks
protein-pewarna dipisahkan (misalnya dengan sentrifugasi) ditentukan dengan pengukuran serapan.
Jumlah protein yang ada di larutan awal berhubungan dengan jumlah pewarna yang terikat :
[Pewarna terikat] = [Pewarna awal] - [Pewarna bebas]
a. Kelebihan
- Cepat
- Reagen relative murah dan mudah didapatkan
b. Kekurangan
- Diperlukan ketelitian yang ekstra, karena biasanya bila kurang teliti hasil pengukuran sesudah
akan lebih tinggi.
- Tidak untuk menentukan jenis protein yang ada.
- Harus mencapai titik isoelektris, jika tidak maka hasil yang didapatkan tidak akan sesuai.
Maninggar K. / Reguler-17/ P27834012021 / SMT V
Page 3