Analisis RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) Populasi Manggis (Garcinia mangostana L.) Di Sumatera Utara
Lampiran 1. Bagan prosedur isolasi DNA
0.2-0.3 gr daun segar digerus dgn nitrogen cair ,sambil digerus masukkan 0.1 gr PVPP sampai menjadi tepung . Lalu masukkan dalam tube 2 ml yng telah berisi 1 ml CTAB 2% dan 10 ul B-merkapto, bolak balik tube sampai homogen Vortex sampel sampai homogen, panaskan dalam waterbath suhu 65
˚ selama 60 menit (setiap 10 menit angkat lalu dibolak-balik). Setelah dingin masukkan KIAA 1ml per sampel, lalu sentrifuse 13.000 rpm selama 15 menit. Pindahkan bagian atas ke tube 2ml yang baru lalu tambahkan KIAA lagi 1 ml per sampel.
Ambil bagian atas (supernatant) lalu pindahkan ke tube ukuran 1.5 ml. Masukkan isopropanol dingin + sodium asetat, dibolak balik, lalu diamkan di dalam kulkas -20
˚C diinkubasi selama 1 malam.
Dikeluarkan dari kulkas lalu disentrifuse 13.000 rpm 20 menit, akan keliatan pellet pada bagian dasar tube, bagian atas (supernatant) dibuang lalu dan dikering-anginkan. Setelah itu dimasukkan buffer TE 100 ul, dispin manual hingga homogen. Setelah homogen ditambahkan Sodium asetat + etanol (100%) dingin, diinkubasi di dalam kulkas selama 3 jam pada -20
˚C Dikeluarkan dari kulkas lalu disentrifuse 13.000 rpm 15 menit, akan keliatan pellet pada bagian dasar tube, bagian atas (supernatant) dibuang lalu. Lalu dibasuh dengan etanol 70% sebanyak 200 ul lalu etanol dibuang. Tube berisi pellet dikering-anginkan sampai tidak terdapat gelembung cairan. Setelah kering ditambahkan buffer TE
Lampiran 2. Siklus PCR
Tahap Suhu Waktu Jumlah Siklus
Denaturasi awal 94ºC 2 menit 1 siklus Denaturasi 94ºC 1 menit 45 siklus Anealing 36ºC 1 menit 45 siklus Ekstension 72ºC 2 menit 45 siklus Ekstension akhir 72ºC 10 menit 1 siklus Kondisi akhir PCR 4ºC tak terbatas Setting PCR PCR (Thermal Cycler) Applied Biosystems
Lampiran 3. Data distance DARwin @DARwin 5.0 - DIS T S2 30 T S1 T S2 T S3 T S4 T S5 Sim1 Sim2 Sim3 DS1 DS2 DS3 DS4 DS5 Srg1 Srg2 Srg3 Srg4 Srg5 Lkt1 Lkt2 Lkt3 Lkt4 Lkt5 Lkt6 Lkt7 Lkt8 Lkt9 Lkt10 Lkt11 0.30 T S3 0.38 0.32 T S4 0.30 0.30 0.24 T S5 0.28 0.35 0.41 0.23 Sim1 0.16 0.23 0.33 0.23 0.26 Sim2 0.16 0.28 0.39 0.21 0.19 0.10 Sim3 0.19 0.28 0.40 0.23 0.16 0.10 0.10 DS1 0.20 0.34 0.47 0.24 0.20 0.13 0.08 0.11 DS2 0.17 0.29 0.39 0.22 0.20 0.11 0.06 0.11 0.10 DS3 0.23 0.28 0.43 0.23 0.16 0.14 0.10 0.08 0.11 0.13 DS4 0.24 0.32 0.45 0.27 0.17 0.18 0.13 0.14 0.12 0.19 0.08 DS5 0.25 0.32 0.35 0.28 0.20 0.19 0.14 0.14 0.20 0.12 0.16 0.17 Srg1 0.21 0.24 0.32 0.21 0.27 0.17 0.17 0.22 0.26 0.18 0.24 0.23 0.18 Srg2 0.27 0.32 0.23 0.14 0.29 0.25 0.23 0.25 0.31 0.26 0.29 0.28 0.29 0.20 Srg3 0.31 0.36 0.39 0.21 0.26 0.32 0.27 0.26 0.28 0.28 0.26 0.23 0.28 0.28 0.22 Srg4 0.25 0.32 0.30 0.10 0.20 0.26 0.21 0.16 0.24 0.20 0.20 0.27 0.25 0.24 0.16 0.18 Srg5 0.32 0.37 0.34 0.12 0.22 0.30 0.23 0.25 0.26 0.24 0.22 0.29 0.27 0.29 0.19 0.18 0.10 Lkt1 0.27 0.39 0.48 0.24 0.24 0.28 0.20 0.20 0.16 0.21 0.20 0.16 0.27 0.29 0.31 0.25 0.22 0.26 Lkt2 0.29 0.36 0.38 0.21 0.31 0.27 0.20 0.24 0.28 0.23 0.26 0.28 0.29 0.25 0.20 0.29 0.24 0.26 0.20 Lkt3 0.22 0.29 0.32 0.18 0.25 0.21 0.16 0.19 0.22 0.15 0.20 0.26 0.20 0.18 0.19 0.25 0.18 0.20 0.24 0.08 Lkt4 0.20 0.33 0.35 0.23 0.25 0.21 0.19 0.17 0.25 0.15 0.23 0.29 0.20 0.19 0.24 0.28 0.18 0.22 0.27 0.22 0.14 Lkt5 0.20 0.37 0.42 0.27 0.29 0.26 0.23 0.21 0.22 0.22 0.25 0.24 0.22 0.24 0.31 0.25 0.25 0.24 0.21 0.26 0.20 0.16 Lkt6 0.30 0.38 0.38 0.18 0.25 0.26 0.21 0.19 0.27 0.22 0.23 0.24 0.20 0.21 0.22 0.21 0.20 0.20 0.24 0.17 0.15 0.20 0.22 Lkt7 0.23 0.33 0.35 0.20 0.23 0.24 0.17 0.17 0.20 0.18 0.21 0.22 0.20 0.22 0.22 0.21 0.18 0.25 0.20 0.15 0.09 0.16 0.14 0.18 Lkt8 0.22 0.38 0.44 0.27 0.24 0.28 0.20 0.20 0.21 0.21 0.25 0.21 0.22 0.17 0.29 0.25 0.22 0.29 0.23 0.28 0.22 0.19 0.14 0.22 0.14 Lkt9 0.29 0.32 0.32 0.20 0.32 0.23 0.20 0.27 0.26 0.26 0.25 0.24 0.27 0.23 0.23 0.28 0.27 0.26 0.26 0.19 0.15 0.25 0.22 0.27 0.11 0.26 Lkt10 0.24 0.29 0.34 0.16 0.32 0.18 0.18 0.22 0.26 0.21 0.24 0.28 0.27 0.17 0.23 0.30 0.24 0.23 0.28 0.20 0.19 0.12 0.21 0.22 0.22 0.26 0.16 Lkt11 0.25 0.32 0.34 0.18 0.27 0.23 0.16 0.21 0.24 0.17 0.23 0.26 0.22 0.21 0.19 0.25 0.20 0.22 0.26 0.08 0.07 0.14 0.20 0.18 0.11 0.24 0.13 0.12 Lkt12 0.20 0.32 0.37 0.17 0.24 0.20 0.13 0.16 0.21 0.17 0.20 0.24 0.24 0.18 0.21 0.25 0.17 0.21 0.23 0.16 0.15 0.08 0.17 0.17 0.15 0.18 0.21 0.06 0.10 Dissimilarity calculated from data file: manggis_30_10primer_kode.var (type:'single') User selection Units: 30/30 and Variables: 80/80 Dissimilarity index: P resence / Absence - Dice Missing data options: No missing data 1000 bootstraps ----------------------------
TS1 : Tapsel1 DS3 : Deli Serdang3 Lkt3 : Langkat3 Maximum distance : 0.48 Keterangan TS2 : Tapsel2 DS4 : Deli Serdang4 Lkt4 : Langkat4 Minumum distance : 0.06 TS3 : Tapsel3 DS5 : Deli Serdang5 Lkt5 : Langkat5 TS4 : Tapsel4 Srg1 : Sergei1 Lkt6 : Langkat6 TS5 : Tapsel5 Srg2 : Sergei2 Lkt7 : Langkat7 Sim1 : Simalungun1 Srg3 : Sergei3 Lkt8 : Langkat8 Sim2 : Simalungun2 Srg4 : Sergei4 Lkt9 : Langkat9 Sim3 : Simalungun3 Srg5 : Sergei5 Lkt10 : Langkat10 DS1 : Deli Serdang1 Lkt1 : Langkat1 Lkt11 : Langkat11 DS2 : Deli Serdang2 Lkt2 : Langkat2 Lkt12 : Langkat12
Lampiran 4. Hasil uji kuantitas dan konsentrasi DNA manggis populasi
Sumatera Utara dengan spektrofotometer/nanophotometer
DNA Sampel 2 : TS2 DNA Sampel 1 : TS1 DNA Sampel 3 : TS3 DNA Sampel 4 : TS4 DNA Sampel 5 : TS5 DNA Sampel 6 : Sim1 DNA Sampel 9 : DS1 DNA Sampel 10 : DS2 DNA Sampel 11 : DS3 DNA Sampel 12 : DS4 DNA Sampel 13 : DS5 DNA Sampel 14 : Srg1
DNA Sampel 17 : Srg4 DNA Sampel 18 : Srg5 DNA Sampel 19 : Lkt1 DNA Sampel 20 : Lkt2 DNA Sampel 21 : Lkt3 DNA Sampel 22 : Lkt4
DNA sampel 25 : Lkt7 DNA Sampel 26 : Lkt8 DNA Sampel 27 : Lkt9 DNA Sampel 28 : Lkt10
DNA Sampel 29 : Lkt11 DNA Sampel 30 : Lkt12
Lampiran 5. Gambar kegiatan elektroforesis
Pembuatan agarose Elektroforesis
Ethibium bromide (Etbr) UV Tec (Gel Doc)
Lampiran 6. Gambar kegiatan di laboratorium
Isolasi DNA dengan Nitrogen cair
Lysis dinding sel dengan nitrogen cair Proses pemanasan
Pada Waterbath Vortex dan Centrifuge
Lampiran 7. Deskripsi Pembuatan Larutan Stok
a. CTAB 5 %
Larutan dibuat dengan melarutkan :
- NaCl : 2.0 g
- CTAB : 5.0 G - Aquades : 100 ml
b. Tris HCl 1 M pH 8.0 (100 ml)
Bahan yang digunakan adalah :
- Tris : 12.114 g
- HCl p.a. : 4.2 ml
- Aquades : 80 ml
- Larutan dibuat dengan mencampurkan bahan kimia di dalam gelas beaker yang diaduk dengan menggunakan batang pengaduk magnetik di atas hot plate
- Volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml
- Larutan disterilisasi dengan autoclave
c. Tris HCl 1 M pH 7.4 (50 m)
Bahan yang digunakan adalah :
- Tris : 6.057 g
- Aquades ditambahkan hingga volume larutan mendekati 50 ml
- Pengaturan Ph dilakukan dengan menambahkan NaOH 2.5 M hingga Ph 7.4
- Volume ditepatkan hingga 50 ml
- Larutan disterilisasi dengan autoclave
d. EDTA O.5 M pH 8.0 (100 ml)
Bahan yang digunakan adalah :
- NaEDTA : 18.612 g
- NaOH : 2.0 g
- Aquades : 80 ml
- Larutan dibuat dengan mencampur bahan kimia dalam gelas beaker dan diaduk dengan menggunakan batang pengaduk magnetik - Pengaturan pH dilakukan dengan menambahkan HCl hingga ph 8.0.
- Volume ditepatkan dengan aquades hingga 100 ml
- Larutan disterilisasi dengan autoclave
e. NaCl 5 M pH 7.7 (l00 ml)
Bahan yang digunakan adalah :
- NaCl : 29.22 g
- Aquades ditambahkan hingga larutan mendekati 100 ml dan diaduk dengan menggunakan batang pengaduk magnetik hingga larut
- Pengaturan PH dilakukan dengan menambahkan NaOH hingga pH 7.7
f. Buffer Ekstraksi/CTAB (100 ml)
Bahan yang digunakan adalah :
- CTAB 2 % : 40 ml CTAB 5 %
- NaCl 1,26 M : 25.1 ml NaCl 5 M - EDTA 20 mM : 4 ml EDTA 0.5 M pH 8.0
- Tris HCl pH 8.0 100 mM : 10 ml Tris HCl 1 M pH 8.0
- Aquades steril : 20.8 ml
g. Buffer TAE 50 X (100 ml)
Bahan yang digunakan adalah :
- Tris : 24.2 ml pH, 7.4
- Asam Asetat Glasial : 5.7 ml
- EDTA 0.5 M PH 8.0 : 10 ml
- Aquades ditambahkan hingga olume larutan 100 ml
h. Buffer TAE 1X (500 ml)
Bahan yang digunakan adalah :
- Buffer TAE 50 X : 10 ml
- Aquades : 490 ml
Bahan yang digunakan adalah :
- Tris HCl 1 M PH 8.0 : 0.5 ml
- EDTA 0.5 M PH 8.0 : 0.1 ml
- Aquades : 49..4 ml
- Dimasukkan ke dalam gelas beaker dan diaduk hingga merata
j. Kloroform Isoamilalkohol 24 : 1 (50 ml)
Bahan yang digunakan adalah :
- Kloroform : 48 ml
- Isoamilalkohol : 2 ml
- Dicampur merata
k. Etanol 70 % (100 ml)
- Etanol : 70 ml
- Aquades : 30 ml
Lampiran 8 .Peta Lokasi Penelitian Sumatera Utara
Lampiran 9. Gambar aksesi manggis TS1 AKSESI 1
Asal Desa : Napa (Tapsel) Kecamatan : Batang Toru Ketinggian Tempat : 70 mdpl Usia ± 60 tahun Letak : N 0.3º19’ 43.1’’, E 0.99º 0.1’56.1’’ Lilit Batang : 140 cm
Lampiran 10. Gambar aksesi manggis TS2 AKSESI 2
TS2
Asal Desa : Sipenggeng (Tapsel) Kecamatan : Batang Toru Ketinggian tempat : 76 mdpl Usia Tanaman : ± 40 tahun Letak : S 0.1º03’ 24.9’’, E 101º 37.’45.5’’ Tinggi Tanaman ± 20 m Lilit Batang : 134 cm
Lampiran 11. Gambar aksesi manggis TS3 AKSESI 3
TS3
Asal Desa : Huraba 1 (Tapsel) Kecamatan : Marancar Ketinggian Tempat : 320 mdpl Usia tanaman : ± 40 tahun Letak : S 0.1º03’ 21.9’’, E 101º 37.’12.5’’ Tinggi Tanaman :± 10 m Lilit Batang : 110 cm
Lampiran 12. Gambar aksesi manggis TS4 AKSESI 4
TS4
Asal Desa : Pangarongan (Tapsel) Kecamatan : Marancar Ketinggian Tempat : 360 mdpl Usia tanaman : ± 40 tahun Letak : S 0.1º03’ 31.2’’, E 101º 37.’41.3’’ Tinggi Tanaman :± 15 m Lilit Batang : 112 cm
Lampiran 13. Gambar aksesi manggis TS5 AKSESI 5
TS5
Aksesi : Simasom (Tapsel) Kecamatan : Angkola Timur Ketinggian Tempat : 602 mdpl Usia tanaman : ± 50 tahun Letak : N 0.1º31’ 40.2’’, E 099º 10.’54.8’’ Tinggi Tanaman :± 15 m Lilit Batang : 140 cm
Lampiran 14. Gambar aksesi manggis Sim1
AKSESI 6
Aksesi : Sirama 1 Kabupaten : Simalungun Usia ± 100 tahun Tinggi Tanaman : ± 25 m Lilit Batang : 160 cm
Lampiran 15. Gambar aksesi manggis Sim2
AKSESI 7
Lampiran 16. Gambar aksesi manggis Sim3
Sim3Asal Desa : Petani Timur
Lampiran 17. Gambar aksesi manggis DS1
AKSESI 9
Asal Desa : Pancur Batu Kabupaten : Deli Serdang Usia ± 20 tahun Tinggi Tanaman : ± 8 m
Lampiran 18. Gambar aksesi manggis DS2
AKSESI 10
Asal Desa : Tiang Layar Kabupaten : Deli Serdang Usia ± 40 tahun Tinggi Tanaman : ± 20 m ili
Lampiran 19. Gambar aksesi manggis DS3
AKSESI 11
DS3
Asal Desa : Rambung Baru Kabupaten : Deli Serdang Usia ± 40 tahun Tinggi Tanaman : ± 15 m Lilit Batang : 78 cm
Lampiran 20. Gambar aksesi manggis DS4
AKSESI 12
Lampiran 21. Gambar aksesi manggis DS5
AKSESI 13
Lampiran 22. Gambar aksesi manggis Srg1
AKSESI 14
Lampiran 23. Gambar aksesi manggis Srg2
AKSESI 15
Lampiran 24. Gambar aksesi manggis Srg3
AKSESI 16
Lampiran 25. Gambar aksesi manggis Srg4
AKSESI 17
Lampiran 26. Gambar aksesi manggis Srg5
AKSESI 18 Srg5
Lampiran 27. Gambar aksesi manggis Lkt1
AKSESI 19 Lkt1
Lampiran 28. Gambar aksesi manggis Lkt2
AKSESI 20
Lkt2
Asal Desa : Stabat Banyumas Kabupaten : Langkat
Lampiran 29. Gambar aksesi manggis Lkt3
AKSESI 21
Lampiran 30. Gambar aksesi manggis Lkt4
AKSESI 22 Lkt4
Lampiran 31. Gambar aksesi manggis Lkt5
AKSESI 23
Lkt5
Asal Desa : Stabat Barat -1 Kabupaten : Langkat Usia ± 15 tahun
Lampiran 32. Gambar aksesi manggis Lkt6
AKSESI 24
Lkt6
Asal Desa : Stabat Barat-2 Kabupaten : Langkat
Lampiran 33. Gambar aksesi manggis Lkt7
AKSESI 25
Lkt7
Asal Desa : Stabat Kota Kabupaten : Langkat Usia ± 30 tahun Tinggi Tanaman : ± 14 m Lilit Batang : 65 cm
Lampiran 34. Gambar aksesi manggis Lkt8
AKSESI 26
Asal Desa : Hulu Berayun Kabupaten : Langkat
Lampiran 35. Gambar aksesi manggis Lkt9
AKSESI 27
Asal Desa : Namo Cengkeh Kabupaten : Langkat Usia ± 30 tahun Tinggi Tanaman : ± 14 m Lilit Batang : 30 cm
Lampiran 36. Gambar aksesi manggis Lkt10
AKSESI 28
Asal Desa : Tanjung Keliling Kabupaten : Langkat Usia ± 30 tahun Tinggi Tanaman : ± 16 m Lilit Batang : 25 cm
Lampiran 37. Gambar aksesi manggis Lkt11
AKSESI 29
Asal Desa : Namo Datok Kabupaten : Langkat Usia ± 25 tahun Tinggi Tanaman : ± 15 m Lilit Batang : 64 cm
Lampiran 38. Gambar aksesi manggis Lkt12
AKSESI 30
Asal Desa : Sukatani Kabupaten : Langkat Usia ± 15 tahun Tinggi Tanaman : ± 10 m Lilit Batang : 48 cm